콜드 통각에 대한 소설 분석<em> 초파리</em> 애벌레
Summary
여기에서 우리는 초파리 유충의 차가운 통각을 연구하는 새로운 분석을 보여줍니다. 이 분석은 초점 유해 냉 자극을인가 할 수있는 맞춤식 펠티에 프로브를 이용하여 정량화하고 초기 특정 행동을 초래한다. 이 기술은 차가운 통각의 추가 세포 및 분자 해부를 허용합니다.
Abstract
어떻게 생물 감지하고 여전히 제대로 이해 유해 온도에 반응한다. 또한, 말초 신경 병증 또는 손상 유발 과민성 발생한 환자와 같은 감각 기계 과민성, 기본 메커니즘은 잘 특징 아니다. 유 전적으로 취급 용이 초파리 모델은, 유해한 열 감지에 필요한 세포의 유전자를 연구하는 데 사용 된 이는 관심의 여러 보존 유전자를 산출했다. 약간은 세포 및 유해 차가운 감지에 대한 중요한 수용체에 대해 그러나 알려져있다. 초파리는 낮은 온도 (≤10 ° C)에 장시간 노출 살아남을하지 않으며, 유해 차가운 자극을가 감지 방법 행동 선호도 분석에 따뜻한 온도를 선호 멋진 피하고 가능한 피할 것,하지만 최근 조사되었다.
여기에 우리가 설명하고의 첫 번째 유해 감기 (≤10 ° C) 행동 분석의 특징초파리. 이 도구 및 분석을 사용하여, 우리는 질적 및 양적 차가운 침해 행동을 평가하는 방법 조사관을 보여줍니다. 이 질병, 부상 또는 감작의 맥락에서 아마도 일반 / 건강한 문화 조건에서 수행, 또는 할 수 있습니다. 또한,이 분석은 thermosensation 통증 또는 통각 과민에 영향을 줄 수있는 원하는 유전자형 선정 유충에 적용될 수있다. 고통이 더 가능성이 척추 동물을 포함한 다른 종, 통증 프로세스의 중요한 이해를 수집합니다 것입니다 열 통각을 연구하기 위해이 분석을 사용하여, 고도의 보존 과정 감안할.
Introduction
초파리는 새로운 보존 유전자와 복잡한 행동을 기초 신경 회로의 식별을위한 매우 유용한 것으로 입증되었습니다. 파리 정교한 유전 툴킷 통각 5, 6, 7의 세포 및 분자 염기 해부 정확한 유전 적 신경 조작 1,2,3,4 허용 간략화 신경계를 제공한다. 유충 부드러운 촉감 8, 9, 10, 유해한 열 11, 12, 13 및 유해 자극 (4)의 기계적 감각에 대한 행동 분석 주어진 이러한 분석에 특히 유용 </sup> 11은 이미 설립 투명 유충 표피는 표피와 하부 감각 뉴런의 라이브 영상 또는 고정을 허용하고있다. 최근 유해 감기위한 분석은 또한 우리는 여기에서 더 상세히 설명 7 개발되었다.
벌금, 원뿔 스쳐 차가운 프로브를 사용하여, 우리는 표시하거나 거친 기계적 또는 고온 자극 (7), (8) 후, 11 초파리 애벌레 전시 부드러운 터치 다음 정상 운동 동안 관찰 행동, 구별 차가운 별 반응 일련의 행동, 그 . 차가운 특정 행동은 강력한 전신 수축 (CT), U 자형 (미국)에 후방 세그먼트 (PR) 및 전방의 동시 인상 및 후방 세그먼트의 45-90º 인상을 포함한다. 이러한 행동의 유병률은 감소 온도 만의 각 피크 증가살짝 다른 추운 온도. 최근 연구는 CT의 응답이 유해 열이나 강한 기계적 자극 (7)에 응답 것보다 다른 주변 감각 신경에 의해 매개되는 것을 의미한다.
많은 척추 통각 수용기 같은 초파리 다수의 돌기 (MD) 말초 감각 신경 세포는 표피 (1) 위에 arborize 수지상 복합 구조를 갖는다. MD 뉴런 복부 신경 코드 (14)에 자신의 축삭을 투영 모든 유충 바디 부분에 존재한다. MD 감각 신경 돌기의 형태에 기초하여 네 개의 서로 다른 클래스 (I-IV)로 분리하고, 감각 기능 4, 9, 10, 15, 16, 17을 변화 하였다. 클래스 IV 뉴런은 유충 횡 체 롤 응답 요구되지만고온 또는 열악한 기계적 자극 4 클래스 III 뉴런 부드러운 터치 응답 (9), (10)에 필요한 단지 초기 활성화되지 않고, 또한 냉간 유발 행동 반응 (7)에 요구한다. 모두 클래스 III 및 IV 클래스 신경 자극 9, 10, 17, 19 7, 11, 18, 유해하고 비에 유해한 행동 반응을 촉진하기 위해 이산 일시적 수용체 전위 (TRP) 채널을 사용한다. 또한, 애벌레 통각은 20 세포 및 행동 수준 12, 21, 다음과 같은 부상을 민감합니다.
여기에 설명 된 분석은 허용 quantificatio보통, 하나의 잠재적 인 N은 상온 (18-22 ºC)에 유해 냉기 (10 ≤ ºC)까지 저온, 무해한 차가운 (11-17 ºC)로 행동 반응을 변경. 이 분석에 사용되는 저온 직접 클래스 III 감각 뉴런을 활성화하고 질적 양적 7을 분석 할 강력한 재현성 칼슘 증가 냉간 유발 행동 반응을 유도 할 수있다. 이 분석은 초기 통각, 통각 과민 또는 통각 소성 영향 유전 적 및 환경 두 인자를 결정하는 다양한 환경 조건에 노출 된 유충 (변경 영양, 부상되는 약물)에뿐만 아니라 거의 모든 유전형의 유충에 적용될 수있다. thermosensation 여러 종에 걸쳐 유비쿼터스 것을 감안할 때,이 분석은 통각의 연구를위한 유용한 도구를 제공하며, 새로운 유전자 대상 또는 개선 신경 세포의 상호 작용을 발견 할 수있다척추 동물의 통각에 대한 우리의 이해.
맞춤 제작 된 콜드 프로브 (콜드 프로브, 소재의 표 참조)를 통한 열 전도 알루미늄 샤프트와 원추형 팁을 냉각시키는 펠티에 소자를 제어 폐쇄 루프 온도를 이용한다. 서미스터는 알루미늄 원추형 팁 내부에 내장되고, 제어부의 실시간 온도를보고한다. 히트 싱크 팬 (열 제어 유닛 자재 표 참조)를 얻을 수있는 펠티에 효과의 열 부하 (QC)이므로 (22-0 °의 C)의 바람직한 온도 범위를 조절하는 열전 모듈에 부착된다. 콜드 프로브 팁의 유해 냉 자극 전후방 단부로부터 등거리 세그먼트 (들), 등쪽 정중선에 손으로 적용되는 유충 (약 A4 세그먼트,도 1a 참조). 차가운 자극에 대응하여, 유충은 일반적으로 10 초 컷오프에서 세 냉간 유발 행동 중 하나를 생산 : 몸 전체를수축 (CT), U 자형 (US) 또는 (결과 설명) 후부 세그먼트 (PR)의 인상에 전방 및 후방 세그먼트의 45-90º 인상. 이러한 행동의 아무도는 정상적인 연동 운동이나 먹이를 찾아 다니는 행동 중에 수행되지 않습니다. 이러한 동작은 부드러운 촉감 응답 및 높은 온도 또는 유해한 기계적 자극에 대한 반응 혐오 압연에서 구별된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 분석은 정 성적 및 정량적으로 여러 유전 배경, 환경 적 영향들, 및 / 또는 손상을 유도 조건에서 통각 유충 또는 통각 과민을 평가하는데 사용될 수있다. 이 분석은이 도구 냉 자극의 초점 응용이 가능하기 때문에 하나의 특히 저온에 응답 말초 감각 뉴런의 서브셋의 기능을 평가할 수있다. 흥미롭게도,이 추위 유발 행동은 열 (7), (11)에 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 비판적 원고를 읽기 위해 차가운 프로브 분석, 플라이 주식에 대한 블루밍턴 초파리 증권 센터 및 Galko 실험실 구성원의 초기 단계 개발을위한 사라 우 및 카밀 그레이엄합니다. 이 작품은 NIH NRSA HNT에 (NIH F31NS083306)에 의해 NIH R01NS069828, R21NS087360 및 MJG에 대한 기초 연구에서 텍사스 MD 앤더슨 클라크 원정대의 대학에 의해 지원되었다.
Materials
| Cold Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Thermal Control Unit | TE Technology | Custom Built enclosure | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Forceps | FST | FS-1670 | Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use. |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351008 | |
| 60 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351007 | |
| Piece of black vinyl (at least 2 x 2 inches) | Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Used to move food |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture |
Riferimenti
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O’Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).
- Im, S. H., Galko, M. J. Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception. Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).
- Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain. Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).
- Turner, H. N., et al. The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila. Curr Biol. , (2016).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).
- Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae. Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).
- Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. J Vis Exp. (63), e3837 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).
- Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Neely, G. G., et al. TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila. PLoS One. 6 (8), e24343 (2011).
- Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila. Mol Brain. 5, 39 (2012).
- Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. Elife. 4, e10735 (2015).
- Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).
- Berrigan, D., Pepin, D. J. How Maggots Move – Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera. J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).
- Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biol. 2 (8), E239 (2004).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
- Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology. Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Gill, R. D. Multistate life-tables and regression models. Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).
- Mantel, N. Ranking procedures for arbitrarily restricted observation. Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).
- Breslow, N. A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship. Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).
- Gehan, E. A. A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples. Biometrika. 52, 203-223 (1965).
