Assay רומן עבור הקרה Nociception ב<em> דרוזופילה</em> זחלים
Summary
כאן אנו מדגימים assay הרומן ללמוד nociception קר הזחלים תסיסנית. assay זה מנצל בדיקה שהותקנה פלטייה מסוגל ליישם גירוי קור מוקד רעיל וכתוצאה מכך התנהגויות קרות ספציפיות הניתנות לכימות. טכניקה זו תאפשר דיסקציה תאית ומולקולרית נוספת של nociception הקר.
Abstract
איך אורגניזמים לחוש ולהגיב לטמפרטורות רעילות עדיין הוא הבין היטב. בהמשך, המנגנונים רגישים של המכונות החושיות, כגון בחולים חווים נוירופתיה היקפית או רגישות מושרה פציעה, אינם מתאפיינים גם. המודל תסיסנית הגנטי הצייתן נעשה שימוש כדי לחקור את תאי גנים דרושים זיהוי חום רעיל, אשר הניב גנים שמורים מרובים של עניין. מעט מאוד ידוע זאת על תאי קולטנים חשובים עבור חישה קרה רעילה. למרות, דרוזופילה לא לשרוד חשיפה ממושכת לטמפרטורות קרות (≤10 ºC), ותמנע מגניב, והעדיפה בטמפרטורות חמות מבחני העדפה התנהגותית, איך הם מרגישים ואולי למנוע גירויים קרים רעילים יש רק נחקר לאחרונה.
כאן אנו מתארים ולאפיין הקור הרעיל הראשון (≤10 ºC) assay התנהגותייםדרוזופילה. שימוש בכלי זה assay, אנו מראים חוקרים כיצד איכותיים וכמותית להעריך התנהגויות nociceptive קרות. ניתן לעשות זאת בתנאי תרבות נורמלים / בריאים, או כנראה בהקשר של מחלה, פציעה או רגישות. יתר על כן, ניתן ליישם assay כדי זחלים שנבחרו עבור גנוטיפים רצוי, אשר עשוי להשפיע thermosensation, כאב, או רגישות nociceptive. בהתחשב בכך כאב הוא תהליך שמור ביותר, באמצעות assay ללמוד nociception תרמית נוספת יהיה ללקט הבנה חשובה סביר של תהליכי כאב מינים אחרים, כולל בעלי חוליות.
Introduction
דרוזופילה הוכיחה להיות שימושי מאוד עבור זיהוי של גנים שמורים הרומן ומעגלים עצביים העומדים בבסיס התנהגויות מורכבות. זבובים לספק ערכת כלים גנטיות מתוחכמת ומערכת עצבים פשוטה המאפשרת מניפולציה גנטית מדויקת עצבית 1, 2, 3, 4 לנתח הבסיסים התאיים ומולקולריים של nociception 5, 6, 7. זחלים הם שימושיים במיוחד עבור ניתוחים אלו, בהתחשב בעובדת מבחני התנהגות עבור מגע עדין 8, 9, 10, חום רעיל 11, 12, 13 ו תחושה מכאנית של גירוי מזיק 4, </sup> 11 כבר הוקמו, ואת לציפורן הזחל השקופה מאפשרת הדמיה לחיות או קבועה של האפידרמיס העצב סנסורי בסיסי. לאחרונה, ב assay עבור קר רעיל גם פותח 7, אשר אנו מתארים בפירוט רב יותר כאן.
באמצעות בדיקה קרה בסדר, קוניים שקצהו, אנו מראים כי תערוכת זחלים תסיסנית סט של התנהגויות תגובתי קרות ספציפיות, נבדל התנהגויות שנצפו בזמן תנועה נורמלית, הבאים במגע עדין, או אחרי גירויי טמפרטורה מכאניים או גבוהים קשים 7, 8, 11 . ההתנהגויות הקרות ספציפיות כוללות התכווצות גוף מלא וחזקה (CT), העלאת 45-90º המגזרים האחוריים (יח"צ) ו העלאה זמנית של הקדמי ואת הפלח אחורי לתוך בצורת U (ארה"ב). השכיחות של התנהגויות אלה מגדילה עם טמפרטורות ופוחתות אך כל פסגות בבית היםטמפרטורות שונות קרות בקלילות. מחקר שנערך לאחרונה מצביע על כך תגובות CT מתווכות על ידי עצב סנסורי פריפריה שונה מאלו להגיב חום רעיל או גירויים מכאניים קשים 7.
בדומה קולטן אזעקה החולייתנים, דנדריטים מרובים דרוזופילה (MD) עצב סנסורי הפריפריה יש מבנים דנדריטים מורכבים arborize מעל האפידרמיס 1. נוירונים MD נמצאים בכל מגזר גוף הזחל, מקרין האקסונים שלהם כדי העצב בחוט הגחון 14. עצב סנסורי MD מופרד לארבע כיתות שונות (I-IV) המבוססות על מורפולוגיה הדנדריטים ויש לי משתנה פונקציות חושיות 4, 9, 10, 15, 16, 17. בעוד נוירונים IV בכיתה נדרשים עבור תגובות רול גוף לרוחב זחללטמפרטורות גבוהות או גירויים מכאניים קשים III נוירונים 4, בכיתה נדרשות עבור תגובות מגע עדין 9, 10 ו לא מופעלים רק על ידי קר, אלא גם נדרשים עבור התגובות התנהגותיות הקרות עורר 7. שני נוירונים IV III ומעמד בכיתה לנצל ערוצי פוטנציאל הקולטן חולף דיסקרטיים (TRP) כדי להקל על תגובות התנהגותיות 7 רעילים, 11, 18 ו גירויים שאינם רעיל 9, 10, 17, 19. בהמשך, nociception הזחל הוא רגיש לפציעה הבאה, ברמה התאית 20 והתנהגותיים 12, 21.
Assay המתואר כאן מאפשר quantification של אחד נורמלי, או פוטנציאל לשנות תגובות התנהגותיות לטמפרטורות קרות החל קר מזיק (≤ 10 ºC), מגניב מזיק (11-17 ºC), כדי בטמפרטורות הסביבה (18-22 ºC). הטמפרטורות הקרות המשמשות assay זה מסוגלות מפעיל ישירות בכיתת III נוירונים חושיים, לעורר עליות סידן חזקות, לשחזור קר עורר תגובות התנהגותיות, אשר יכולה להיות איכותית וכמותית נתחו 7. ניתן ליישם assay זה כדי זחלים של כל גנוטיפ כמעט כמו גם זחלים חשופים לתנאים סביבתיים מגוונים (תזונת שינה, פגיעה, סוכנים תרופתיים) כדי לקבוע שניהם גורמים גנטיים וסביבתיים המשפיעים nociception הקר, רגישות nociceptive או פלסטיות nociceptive. בהתחשב בכך thermosensation הוא נמצא בכל מקום על פני מינים רבים, assay זה מספק כלי רב ערך לחקר nociception ועלול לחשוף מטרות גן רומן או אינטראקציות עצביות שתשפרנההבנתנו nociception חוליות.
החללית הקרה שהותקנה (ראה בדיקה קרה, טבלת החומרים) מנצלת טמפרטורת לולאה סגורה מבוקרת מכשיר פלטייה, אשר מקרר את פיר אלומיניום טיפ חרוטים באמצעות הולכה תרמית. Thermistor מוטבע בתוך קצה קוני אלומיניום מדווח הטמפרטורה בזמן אמת על יחידת הבקרה. כיור ומאוורר מחוברים מודול התרמו להסדיר את עומס החום של אפקט פלטייה (קוו) ולכן טווח הטמפרטורה הרצויה של (22-0 מעלות צלזיוס) יכול להיות מושגת (ראה יחידת בקרת תרמית, ענייני חומרים). הגירוי הקר המזיק של בדיקת הקצה הקר מוחל ביד אל קו אמצע הגב, כדי לפלח (הים) במרחק שווה מן הקצוות קדמיים וגם אחוריים (בערך קטע A4, לראות באיור 1 א) של הזחל. בתגובה לגירויים קרים, זחלים בדרך כלל לייצר אחד משלוש התנהגויות קרות עורר בתוך החיתוך של 10: גוף מלאהתכווצות (CT), העלאה 45-90º של מגזרים קדמיים וגם אחוריים לתוך בצורת U (ארה"ב), או העלאה של המגזרים האחוריים (יח"צ) (המתוארים תוצאות). אף אחד ההתנהגויות אלה מבוצעים בזמן תנועה פריסטלטיות רגילה או התנהגות שיחור מזון. התנהגויות אלו הן גם נבדלים תגובות מגע עדינות התגובה מתגלגלת מרתיעת טמפרטורה גבוהה או גירויים מכאניים רעילים.
Protocol
Representative Results
Discussion
Assay המתואר כאן יכול לשמש כדי להעריך איכותית וכמותית nociception או רגישות nociceptive הזחלים של רקע גנטי שונים, השפעות סביבתיות, ו / או תנאי-induced נזק. מאז assay זה מאפשר יישום מוקד של גירוי קור, עם הכלי הזה אפשר להעריך את הפונקציה של קבוצת משנה של עצב סנסורי פריפריה במיוחד להגיב לטמפר…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים שרה וו וקמיל גרהם לפיתוח בשלבים מוקדמים של assay הבדיקה הקר, המרכז במלאי Bloomington תסיסנית מניות זבוב, וחברי מעבדת Galko עבור האנושות לקרוא את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי NIH NRSA (NIH F31NS083306) כדי HNT, ועל ידי NIH R01NS069828, R21NS087360 לבין אוניברסיטת טקסס MD Anderson קלארק המלגה בסיסי מחקר כדי MJG.
Materials
| Cold Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Thermal Control Unit | TE Technology | Custom Built enclosure | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Forceps | FST | FS-1670 | Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use. |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351008 | |
| 60 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351007 | |
| Piece of black vinyl (at least 2 x 2 inches) | Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Used to move food |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture |
Riferimenti
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O’Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).
- Im, S. H., Galko, M. J. Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception. Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).
- Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain. Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).
- Turner, H. N., et al. The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila. Curr Biol. , (2016).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).
- Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae. Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).
- Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. J Vis Exp. (63), e3837 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).
- Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Neely, G. G., et al. TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila. PLoS One. 6 (8), e24343 (2011).
- Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila. Mol Brain. 5, 39 (2012).
- Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. Elife. 4, e10735 (2015).
- Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).
- Berrigan, D., Pepin, D. J. How Maggots Move – Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera. J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).
- Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biol. 2 (8), E239 (2004).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
- Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology. Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Gill, R. D. Multistate life-tables and regression models. Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).
- Mantel, N. Ranking procedures for arbitrarily restricted observation. Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).
- Breslow, N. A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship. Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).
- Gehan, E. A. A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples. Biometrika. 52, 203-223 (1965).
