Ensayo novedoso para la nocicepción en frío<em> Drosophila</em> Las larvas

Summary

Aquí se demuestra un nuevo ensayo para estudiar la nocicepción frío en larvas de Drosophila. Este ensayo utiliza una sonda Peltier hecha a la medida capaz de aplicar un estímulo frío nocivo focal y da lugar a comportamientos específicos de frío cuantificables. Esta técnica permitirá además disección celular y molecular de la nocicepción frío.

Abstract

Cómo los organismos detectar y responder a las temperaturas nocivas aún es poco conocido. Además, los mecanismos de sensibilización de la maquinaria sensorial, tal como en los pacientes que experimentan la neuropatía periférica o sensibilización inducida por la lesión subyacentes, no están bien caracterizados. El modelo de Drosophila genéticamente tratables se ha utilizado para estudiar las células y los genes necesarios para la detección de calor nocivo, que ha dado múltiples genes conservados de interés. Poco se sabe sin embargo sobre las células y los receptores importantes para la detección frío nocivo. Aunque, Drosophila no sobrevive a la exposición prolongada a temperaturas frías (≤10 ºC), y evitará fresco, prefiriendo las temperaturas más cálidas en ensayos de preferencias de comportamiento, cómo se detectan y, posiblemente, evitar estímulos de frío nocivos sólo recientemente ha sido investigado.

Aquí se describen y caracterizan los primeros fríos nocivo (≤10 ºC) en el ensayo de conductaDrosophila. El uso de esta herramienta y el ensayo, se muestra un investigador cómo evaluar cualitativa y cuantitativamente comportamientos nociceptivos fríos. Esto puede hacerse en condiciones de cultivo normales / sanos, o presumiblemente en el contexto de una enfermedad, lesión o sensibilización. Además, este ensayo puede ser aplicado a larvas seleccionadas para los genotipos deseados, lo que podría impactar thermosensation, dolor, o sensibilización nociceptiva. Dado que el dolor es un proceso altamente conservada, utilizando este ensayo para estudiar más a fondo la nocicepción térmica es probable que recoger importante comprensión de los procesos de dolor en otras especies, incluyendo vertebrados.

Introduction

Drosophila ha demostrado ser de gran utilidad para la identificación de nuevos genes conservados y circuitos neuronales que subyacen a los comportamientos complejos. Moscas proporcionan un conjunto de herramientas genético sofisticado y un sistema nervioso simplificado, que permiten la manipulación precisa genética y neuronal ^{1, 2, 3, 4} para diseccionar las bases celulares y moleculares de la nocicepción ^{5, 6, 7.} Las larvas son particularmente útiles para estos análisis, dado que los ensayos de comportamiento para el tacto suave ^{8, 9, 10,} calor nocivo ^{11, 12, 13} y la sensación mecánica de estímulos nocivos ^4, </sup> ¹¹ ya se han establecido, y la cutícula larval transparente permite la obtención de imágenes en vivo o fijo de la epidermis y de las neuronas sensoriales subyacentes. Recientemente, un ensayo frío nocivo También se ha desarrollado ^7, que se describe con más detalle aquí.

Usando una sonda fría bien,-cónica con punta, mostramos que exhiben las larvas de Drosophila un conjunto de comportamientos reactivos específicos de frío, distinto de comportamientos observados durante la locomoción normal, siguientes toque suave, o después de duras estímulos mecánico de temperatura o alta ^{7, 8, 11} . Los comportamientos específicos de frío incluyen un robusto contracción de todo el cuerpo (CT), un aumento de 45-90º de los segmentos posteriores (PR) y un aumento simultáneo de la parte anterior y posterior segmentos en forma de U (Estados Unidos). La prevalencia de estos comportamientos se incrementa con temperaturas decrecientes pero cada picos a sligeramente diferentes temperaturas frías. Trabajos recientes sugieren que las respuestas de TC están mediadas por diferentes neuronas sensoriales periféricas que los que responden a estímulos calor nocivo o mecánica dura ^7.

Al igual que los nociceptores vertebrados, Drosophila dendríticas múltiple (MD), las neuronas sensoriales periféricas tienen estructuras dendríticas complejos que ramifican sobre la epidermis ^1. neuronas MD están presentes en cada segmento del cuerpo de las larvas, la proyección de sus axones al cordón nervioso ventral ^14. neuronas sensoriales MD están separados en cuatro clases diferentes (I-IV) en base a la morfología dendrítica y tienen diferentes funciones sensoriales ^{4, 9, 10, 15, 16, 17.} Si bien se requieren neuronas clase IV para las respuestas de balanceo de la carrocería lateral de larvasa altas temperaturas o estímulos mecánicos dura ^4, clase III se requieren las neuronas para las respuestas de suave tacto ^{9, 10} y no sólo se activan por frío, pero también son necesarios para las respuestas de comportamiento evocada por frío ^7. Ambos de clase III y clase IV neuronas utilizan potenciales canales discretos receptor transitorio (TRP) para facilitar las respuestas de comportamiento a nociva ^{7, 11, 18} y no nocivo estímulos ^{9, 10, 17, 19.} Además, la nocicepción larval se sensibiliza después de la lesión, en los niveles celular ²⁰ y de comportamiento ^{12, 21.}

El ensayo descrito aquí permite la quantification de cualquiera normal, o potencialmente alteró las respuestas de comportamiento a bajas temperaturas que van desde nocivo frío (≤ 10 ºC), enfriar inocuo (11-17 ºC), a temperatura ambiente (18-22 ºC). Las temperaturas frías utilizadas en este ensayo son capaces de activar directamente de clase III neuronas sensoriales, provocando robustos, los aumentos de calcio reproducibles y respuestas de comportamiento evocada por frío, que puede ser cualitativa y cuantitativamente analizadas ^7. Este ensayo puede ser aplicado a larvas de virtualmente cualquier genotipo, así como a las larvas expuestas a diversas condiciones ambientales (nutrición alterado, lesión, agentes farmacológicos) para determinar los factores tanto genéticos como ambientales que afectan a la nocicepción frío, sensibilización nociceptiva o plasticidad nociceptivo. Dado que thermosensation es ubicuo en muchas especies, este ensayo proporciona una herramienta valiosa para el estudio de la nocicepción y puede descubrir nuevas dianas de genes o interacciones neuronales que mejorennuestra comprensión de la nocicepción vertebrados.

La sonda fría hecha a la medida (ver sonda fría, Tabla de Materiales) utiliza una temperatura de bucle cerrado controlado dispositivo Peltier, que enfría el tubo de aluminio y punta cónica a través de la conducción térmica. Un termistor está incorporado dentro de la punta cónica de aluminio informa de la temperatura en tiempo real sobre la unidad de control. Un disipador de calor y el ventilador están unidos al módulo termoeléctrico para regular la carga del efecto Peltier calor (Qc) de modo que el intervalo de temperatura deseado de (22-0 ° C) se puede lograr (véase la unidad de control térmico, Tabla de Materiales). El estímulo frío nocivo de la punta de sonda fría se aplica a mano a la línea media dorsal, a segmento (s) equidistante de los extremos anterior y posterior (aproximadamente segmento A4, véase la Figura 1A) de la larva. En respuesta a estímulos de frío, las larvas generalmente producen uno de los tres comportamientos evocados frías dentro de un 10 s de corte: un cuerpo llenocontracción (TC), un aumento de 45-90º segmentos anterior y posterior en forma de U (Estados Unidos), o un aumento de los segmentos posteriores (PR) (descritos en los resultados). Ninguno de estos comportamientos se llevan a cabo durante la locomoción peristáltica normal o comportamiento de forrajeo. Estos comportamientos también son distintas de las respuestas táctiles suaves y la respuesta aversiva rodadura a alta temperatura o estímulos mecánicos nocivos.

Protocol

1. Preparación de las larvas Elevar acciones o cruces genéticos en una incubadora a 25 ºC. Si el cultivo de una cruz, utilizar 20-25 hembras vírgenes y 15-20 varones por cada vial que contiene medios de comunicación regular de mosca harina de maíz. Permitir que las hembras ponen huevos a aproximadamente 48 h antes de transferirlos a un nuevo vial de alimentos. 4-5 días después de la puesta de huevos, recoger 3 rd instar larvas del genotipo deseado por chorros su…

Representative Results

Drosophila larvas se mueven con un movimiento peristáltico que incluye pausas ocasionales, cabeza vueltas, y los cambios de dirección 22. En respuesta a la aplicación focal de un estímulo nocivo frío sin embargo, las larvas presentan un conjunto de comportamientos únicos, a diferencia del rodillo lateral aversivo al calor nocivo y estímulos mecánicos. Estos comportamientos también son diferentes de las respuestas al toque suave …

Discussion

El ensayo descrito aquí se puede utilizar para evaluar cualitativa y cuantitativamente la nocicepción o sensibilización nociceptiva en larvas de varios fondos genéticos, influencias ambientales, y / o condiciones de avería inducida. Dado que este ensayo permite la aplicación focal de un estímulo frío, con esta herramienta se puede evaluar la función de un subconjunto de neuronas sensoriales periféricas específicamente en respuesta a las temperaturas frías. Curiosamente, estos comportamientos evocados fríos …

Materials

Cold Probe	Pro-Dev Engineering	Custom-built on demand	Part numbers and construction details can be provided on request
Thermal Control Unit	TE Technology	Custom Built enclosure	Part numbers and construction details can be provided on request
Zeiss Stemi 2000 microscope	Zeiss	NT55-605
Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator	Dolan-Jenner Industries.	A20500
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide	Schott North America, Inc.	Schott A08575
Forceps	FST	FS-1670	Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae
Paintbrush	Dick Blick Art Materials	06762-1002	Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use.
35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish	Falcon	351008
60 X 10 mm Polystyrene Petri Dish				Falcon	351007
Piece of black vinyl (at least 2 x 2 inches)			Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe
Fisherbrand Scoopula Spatula	Fisher Scientific	14-357Q	Used to move food
Kimtech Science Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture