Neuartige Assay für kalte Nozizeption in<em> Drosophila</em> Larvae
Summary
Hier zeigen wir einen neuen Assay kalt Nozizeption in Drosophila – Larven zu studieren. Dieser Test verwendet eine speziell angefertigten Peltier Sonde, die eine Brenn schädliche Kältereiz Anwendung und führt zu einer quantifizierbaren kalt spezifischen Verhaltensweisen. Diese Technik wird weiter zelluläre und molekulare Präparation von kalter Nozizeption ermöglichen.
Abstract
Wie Organismen erkennen und darauf reagieren auf schädliche Temperaturen ist noch wenig verstanden. Ferner sind die Mechanismen Sensibilisierung der sensorischen Maschinen zugrunde liegen, wie bei Patienten periphere Neuropathie oder Verletzung induzierte Sensibilisierung erfahren, nicht gut charakterisiert. Genetisch tractable Drosophila – Modell wird verwendet, um die Zellen und Gene zu untersuchen , die für schädliche Brunsterkennung, welches mehrere konservierte Gene von Interesse ergeben. Es ist wenig bekannt, aber über die Zellen und Rezeptoren wichtig für schädliche Kälte Erkundung. Obwohl nicht Drosophila nicht längere überleben Exposition gegenüber kalten Temperaturen (≤10 ° C), und vermeidet kühlen, lieber wärmere Temperaturen in Verhaltenspräferenztests, wie sie fühlen und möglicherweise schädliche Kältereize vermeiden wurde erst vor kurzem untersucht worden.
Hier beschreiben wir, und charakterisieren, die erste schädliche Kälte (≤10 ºC) Verhaltenstest inDrosophila. Mit diesem Tool und Test zeigen wir einen Ermittler, wie man qualitativ und quantitativ kalt nocizeptives Verhalten beurteilen. Dies kann unter normalen / gesunden Kulturbedingungen durchgeführt werden, oder vermutlich im Zusammenhang mit der Krankheit, Verletzung oder Sensibilisierung. Ferner kann dieser Assay für die Larven gewünschten Genotypen ausgewählt aufgebracht werden, die thermosensation auswirken könnten, Schmerzen oder nozizeptive Sensibilisierung. Da Schmerz ist ein hoch konservierter Prozess, unter Verwendung dieser Tests zum weiteren thermischen Nozizeption studieren wird wahrscheinlich wichtiges Verständnis der Schmerzprozesse in anderer Spezies aufzuzulesen, einschließlich Wirbeltiere.
Introduction
Drosophila hat sich als sehr nützlich für die Identifizierung von neuen Genen konserviert und neuronaler Schaltkreise sein , das komplexe Verhalten zugrunde liegen. Flies liefern eine hoch entwickelte genetische Toolkit und ein vereinfachtes Nervensystems , die 1, für die präzise genetische Manipulation und neuronaler erlauben 2, 3, 4 , um die zellulären und molekularen Grundlagen der Nozizeption 5, 6, 7 zu sezieren. Larven sind besonders nützlich für diese Analysen, da der Verhaltensassays für sanfte Berührung 8, 9, 10, schädliche Wärme 11, 12, 13 und die mechanische Empfindung von schädlichen Reizen 4, </sup> 11 haben bereits festgestellt worden ist , und die transparente Larvencuticula ermöglicht lebenden oder fixierten Abbildung der Epidermis und der darunter liegenden sensorischen Neuronen. Vor kurzem wurde ein Test für schädliche Kälte auch 7 entwickelt, die wir hier näher beschreiben.
Unter Verwendung eine feine, konisch bestückte kalte Sonde zeigen wir , dass Drosophila – Larven zeigen eine Reihe von Kalt spezifischen reaktiven Verhaltensweisen, die sich von Verhaltensweisen während der normalen Fortbewegung, folgenden sanfte Berührung beobachtet oder nach hartem mechanischem oder hohen Temperaturen Stimuli 7, 8, 11 . Die kalt spezifischen Verhaltensweisen beinhalten eine robuste Ganzkörper-Kontraktion (CT), ein 45-90º Erhöhung der posterioren Segmente (PR) und einer gleichzeitigen Erhöhung der vorderen und hinteren Segmente in einer U-Form (US). Die Prävalenz dieser Verhaltensweisen steigt mit abnehmender Temperatur, aber jedes Peaks bei sleicht unterschiedliche kalte Temperaturen. Neuere Arbeiten legen nahe , dass CT – Antworten von verschiedenen peripheren sensorischen Neuronen als die vermittelt werden , die 7 bis schädlicher Hitze oder groben mechanischen Reiz reagieren.
Ähnlich wie wirbel Nozizeptoren, Drosophila multiple dendritische (md) periphere sensorische Neuronen haben komplexe dendritische Strukturen , die 1 über die Epidermis verzweigen. md Neuronen ist in jedem larvalen Körpersegment, ihre Axone zu der Bauchmark 14 vorsteht. md sensorische Neuronen sind in vier verschiedene Klassen eingeteilt (I-IV) auf dendritische Morphologie basierten und sensorische Funktionen haben variierende 4, 9, 10, 15, 16, 17. Während Klasse IV Neuronen sind für die Larven seitliche Wankbewegungen Antworten erforderlichgegenüber hohe Temperaturen oder aggressiven mechanischen Reiz 4, Klasse III – Neuronen sind für die sanfte Berührung Antworten 9, 10 erforderlich , und werden nicht nur durch Kalt aktiviert, sind jedoch für die Kalt evozierten Verhaltensreaktionen 7 ebenfalls erforderlich. Beiden Klassen III und Klasse IV Neuronen verwenden diskrete transient receptor potential (TRP) Kanäle Verhaltensreaktionen auf schädliches 7, 11, 18 und nicht-schädlichen Reiz 9, 10, 17, 19 zu erleichtern. Ferner ist Larven Nozizeption nach einer Verletzung sensibilisiert, auf zellulärer 20 und Verhaltensstufen 12, 21.
Der Test hier beschrieben ermöglicht die quantification entweder normal oder möglicherweise veränderte Verhaltensreaktionen auf kalte Temperaturen im Bereich von schädlicher Kälte (≤ 10 ° C), unschädliche kühlen (11-17 ºC), auf Umgebungstemperatur (18-22 ºC). Die kalten Temperaturen in diesem Test verwendet werden , sind fähig Klasse III sensorische Neuronen direkt Aktivierung Hervorrufen robust, reproduzierbar Calciumerhöhungen und kalt evozierten Verhaltensreaktionen, die qualitativ und quantitativ sein können , 7 analysiert. Dieser Test kann auf unterschiedliche Umweltbedingungen (veränderte Ernährung, Verletzungen, pharmakologische Wirkstoffe) sowohl genetische als auch Umweltfaktoren zu bestimmen, ausgesetzt von praktisch jeden Genotyp sowie den Larven Larven angewandt werden, die kalt Nozizeption, nozizeptive Sensibilisierung oder nozizeptiven Plastizität auswirken. Da thermosensation ist allgegenwärtig in vielen Arten, stellt dieser Test ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von Nozizeption und kann neue Genziele oder neuronale Interaktionen aufzudecken, die verbessernunser Verständnis von Wirbeln Nozizeption.
Die angefertigten kalte Sonde (siehe kalte Sonde, Table of Materials) verwendet eine geschlossene Regelkreis Temperatur Peltier – Vorrichtung gesteuert wird , die die Aluminiumschaft und konische Spitze durch Wärmeleitung kühlt. Ein Thermistor ist im Inneren der Aluminium-konischen Spitze eingebetteten berichtet die Echtzeit-Temperatur auf die Steuereinheit. Ein Kühlkörper und Lüfter sind mit der thermoelektrischen Modul befestigt , um den Peltier – Effekt der Wärmelast (Qc) so den gewünschten Temperaturbereich von (22-0 ° C) zu regulieren (siehe Thermal Control Unit, Table of Materials) erreicht werden. Der gesundheitsschädliche Kältereiz des kalten Sondenspitze mit der Hand auf die dorsalen Mittellinie aufgebracht wird, zu segmentieren (n) im gleichen Abstand von vorderen und hinteren Enden der Larve (ungefähr Segment A4, siehe 1A). Als Reaktion auf Kältereize, Larven erzeugen im allgemeinen eine von drei Kalt evozierte Verhaltensweisen innerhalb von 10 s Cutoff: ein GanzkörperKontraktion (CT), eine Erhöhung von 45-90º anterioren und posterioren Segmente in einer U-Form (US) oder eine Erhöhung der posterioren Segmente (PR) (im beschriebenen Ergebnisse). Keines dieser Verhaltensweisen während des normalen peristaltische Fortbewegung oder Nahrungssuchverhalten durchgeführt. Diese Verhaltensweisen sind auch verschieden von sanfter Berührung Reaktionen und die aversiven Roll Reaktion auf hohe Temperaturen oder schädliche mechanische Reize.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Test hier beschrieben ist, kann verwendet werden, um qualitativ und quantitativ Nozizeption oder nozizeptive Sensibilisierung in Larven von verschiedenen genetischen Hintergründen, Umwelteinflüssen zu bewerten und / oder Schäden induzierten Bedingungen. Da dieser Test für Focal Anwendung eines Kältereizes ermöglicht, mit diesem Werkzeug kann man die Funktion einer Untergruppe von peripheren sensorischen Neuronen spezifisch an kalten Temperaturen bei der Reaktion abzuschätzen. Interessanterweise scheinen diese…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Sarah Wu und Camille Graham für die kritische Lektüre des Manuskripts frühen Phasen des kalten Sondentest, der Bloomington Drosophila Stock Center für Fliegen Aktien und Galko lab Mitglieder zu entwickeln. Diese Arbeit wurde durch die NIH NRSA (NIH F31NS083306) zu HNT, und von NIH R01NS069828, R21NS087360 und University of Texas MD Anderson Clark Stipendium in der Grundlagenforschung zu MJG unterstützt.
Materials
| Cold Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Thermal Control Unit | TE Technology | Custom Built enclosure | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Forceps | FST | FS-1670 | Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use. |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351008 | |
| 60 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351007 | |
| Piece of black vinyl (at least 2 x 2 inches) | Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Used to move food |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture |
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