Romance Ensaio para Fria nocicepção em<em> Drosophila</em> Larvas
Summary
Aqui demonstramos um novo ensaio para estudar nocicepção frio em larvas de Drosophila. Este ensaio utiliza uma sonda de Peltier-construído sob encomenda capaz de aplicar um estímulo frio nocivo focal e resulta em comportamento quanto ao frio quantificáveis. Esta técnica permitirá ainda dissecção celular e molecular da nocicepção frio.
Abstract
Como organismos perceber e responder a temperaturas nocivos ainda é mal compreendido. Além disso, os mecanismos subjacentes a sensibilização das máquinas sensorial, tal como em doentes com neuropatia periférica ou sensibilização induzida pela lesão, não estão bem caracterizados. O modelo de Drosophila geneticamente tratável foi usado para estudar as células e os genes necessários para a detecção de calor nocivo, que produziu vários genes conservados de interesse. Pouco se conhece no entanto sobre as células e receptores importantes para a detecção de frio nocivo. Embora, a Drosophila não sobreviver à exposição prolongada a temperaturas frias (≤10 ºC), e vai evitar fresco, preferindo temperaturas mais quentes em ensaios de preferência comportamentais, como eles detectam e possivelmente evitar estímulos nocivos frio só recentemente foi investigado.
Aqui nós descrever e caracterizar o primeiro frio nocivo (≤10 ºC) ensaio comportamentalDrosophila. Usando esta ferramenta e ensaio, mostramos um investigador como avaliar qualitativamente e quantitativamente comportamentos nociceptivos frias. Isto pode ser feito sob condições de cultura normais / saudáveis, ou presumivelmente no contexto de doença, lesão ou sensibilização. Além disso, este ensaio pode ser aplicado a larvas seleccionados para os genótipos desejados, que pode ter impacto thermosensation, dor, ou sensibilização nociceptiva. Dado que a dor é um processo altamente conservado, utilizando este ensaio para um estudo mais aprofundado nocicepção térmica provavelmente vai recolher compreensão importante de processos de dor em outras espécies, incluindo vertebrados.
Introduction
Drosophila tem provado ser altamente útil para a identificação de novos genes e conservada circuitos neuronais subjacentes a comportamentos complexos. Moscas fornecer um conjunto de ferramentas genéticas sofisticado e um sistema nervoso simplificado que permite a manipulação de precisão genética e neuronal 1, 2, 3, 4 para dissecar as bases celulares e moleculares da nocicepção 5, 6, 7. As larvas são particularmente úteis para estas análises, dado que os ensaios comportamentais para toque suave 8, 9, 10, o calor nocivo 11, 12, 13 e sensação mecânica de estímulos nocivos 4, </sup> 11 já foram estabelecidos, ea cutícula larval transparente permite imagens ao vivo ou fixo da epiderme e neurônios sensoriais subjacentes. Recentemente, um ensaio para frio nocivo também foi desenvolvido 7, que descrevemos em mais detalhes aqui.
Usando uma sonda de frio fino, cónico de ponta, mostra-se que as larvas de Drosophila exibem um conjunto de comportamentos reactivos específicos do frio, distinto de comportamentos observados durante a locomoção normais, seguindo toque suave, ou após dura mecânica ou alta estímulos temperatura 7, 8, 11 . Os comportamentos específicos de frio incluem uma contracção robusta de corpo inteiro (CT), um aumento de 45-90º os segmentos posteriores (RP) e um aumento simultâneo do segmentos anterior e posterior em forma de U (US). A prevalência destes comportamentos aumenta com a diminuição da temperatura mas cada picos a slevemente diferentes temperaturas frias. Um trabalho recente sugere que as respostas CT são mediadas por diferentes neurónios sensoriais periféricos do que aqueles que respondem ao calor nocivo ou estímulos mecânicos dura 7.
Muito como nociceptores vertebrados, Drosophila dendrítica múltipla (MD) neurónios sensoriais periféricos têm estruturas dendríticas complexos que arborize sobre a epiderme 1. neurónios MD estão presentes em cada segmento do corpo das larvas, que se projecta seus axónios para o cordão nervoso ventral 14. neurónios sensoriais md são separados em quatro classes diferentes (I-IV), com base em morfologia dendrítica e têm diferentes funções sensoriais 4, 9, 10, 15, 16, 17. Embora os neurónios da classe IV, são necessárias para as respostas de rolo lateral do corpo larvaisa temperaturas elevadas ou estímulos mecânicos dura 4, classe III são necessários para os neurónios respostas suave de toque, 9 e 10 não são apenas activados por frio, mas também são necessárias para as respostas comportamentais evocadas frios-7. Ambas as classes III e IV neurónios utilizar canais discretos do receptor transiente potencial (TRP) para facilitar as respostas comportamentais a estímulos 9, 10, 17, 19 nocivo 7, 11, 18 e não nocivo. Além disso, nocicepção larval é sensibilizado lesão seguinte, nos níveis celular 20 e comportamentais 12, 21.
O ensaio aqui descrito permite a quantification de qualquer normal, ou potencialmente alterados respostas comportamentais a temperaturas baixas que variam de frio nocivo (≤ 10 ºC), arrefecer inócuo (11-17 ° C), a temperaturas ambiente (18-22 ° C). As temperaturas frias utilizados neste ensaio são capazes de activar directamente classe III neurónios sensoriais, provocando robustos, reprodutíveis e cálcio aumenta as respostas comportamentais evocadas a frio, que pode ser qualitativamente e quantitativamente analisadas 7. Este ensaio pode ser aplicado a virtualmente qualquer larvas de genótipo, bem como para as larvas expostas a diversas condições ambientais (nutrição alterada, ferimentos, agentes farmacológicos) para determinar os factores genéticos e ambientais que têm impacto sobre a nocicepção frio, sensibilização nociceptiva ou plasticidade nociceptiva. Dado que thermosensation é ubíqua em muitas espécies, este ensaio proporciona uma ferramenta valiosa para o estudo da nocicepção e pode descobrir novos alvos gicos ou interacções neuronais que irão melhorarnossa compreensão da nocicepção vertebrados.
A sonda fria com especificação (ver sonda fria, Tabela de Materiais) utiliza uma temperatura de circuito fechado controlado dispositivo Peltier, o qual arrefece o eixo de alumínio e ponta cónica através de condução térmica. Um termistor é incorporado no interior da ponta cónica alumínio relata a temperatura em tempo real na unidade de controlo. Um dissipador de calor e do ventilador estão ligados ao módulo termoeléctrico, para regular a carga do efeito Peltier calor (Qc) de modo que o intervalo de temperatura desejado de (22-0 ° C) pode ser obtida (ver a Unidade de Controlo térmica, Tabela de Materiais). O estímulo frio nocivo da ponta da sonda a frio é aplicada à mão à linha média dorsal, ao segmento (s) equidistante das extremidades anterior e posterior (aproximadamente segmento A4, ver Figura 1A) da larva. Em resposta a estímulos frios, geralmente larvas produzir um dos três comportamentos evocado a frio a cerca de 10 s de corte: um corpo completocontracção (CT), um aumento de 45-90º segmentos anterior e posterior em forma de U (US), ou um aumento dos segmentos posteriores (PR) (descritos nos resultados). Nenhum desses comportamentos são realizadas durante a locomoção peristáltico normal ou comportamento de forrageamento. Estes comportamentos são também distintas das respostas de toque suave e a resposta de rolamento aversivo a alta temperatura ou estulos mecicos nocivos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ensaio aqui descrito pode ser utilizado para avaliar quantitativamente e qualitativamente nocicepção ou sensibilização nociceptiva em larvas de várias origens genéticas, as influências ambientais, e / ou condições induzidas por danos. Uma vez que este ensaio permite a aplicação de um estímulo de foco frio, com esta ferramenta pode-se avaliar a função de um subconjunto de neurónios sensoriais periféricos especificamente em resposta a temperaturas frias. Curiosamente, estes comportamentos evocou a frio p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Sarah Wu e Camille Graham para o desenvolvimento de fases iniciais do ensaio frio sonda, a Bolsa de Centro Bloomington Drosophila para as populações da mosca, e membros do laboratório Galko pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH NRSA (NIH F31NS083306) para HNT, e pelo NIH R01NS069828, R21NS087360 e uma Universidade do Texas MD Anderson Clark Fellowship em pesquisa básica para MJG.
Materials
| Cold Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Thermal Control Unit | TE Technology | Custom Built enclosure | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Forceps | FST | FS-1670 | Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use. |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351008 | |
| 60 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351007 | |
| Piece of black vinyl (at least 2 x 2 inches) | Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Used to move food |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture |
Riferimenti
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O’Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).
- Im, S. H., Galko, M. J. Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception. Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).
- Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain. Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).
- Turner, H. N., et al. The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila. Curr Biol. , (2016).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).
- Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae. Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).
- Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. J Vis Exp. (63), e3837 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).
- Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Neely, G. G., et al. TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila. PLoS One. 6 (8), e24343 (2011).
- Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila. Mol Brain. 5, 39 (2012).
- Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. Elife. 4, e10735 (2015).
- Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).
- Berrigan, D., Pepin, D. J. How Maggots Move – Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera. J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).
- Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biol. 2 (8), E239 (2004).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
- Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology. Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Gill, R. D. Multistate life-tables and regression models. Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).
- Mantel, N. Ranking procedures for arbitrarily restricted observation. Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).
- Breslow, N. A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship. Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).
- Gehan, E. A. A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples. Biometrika. 52, 203-223 (1965).
