Summary
Dans cette méthode, nous présentons des procédures biochimiques pour l'isolement rapide et efficace des protéines de filament intermédiaire (IF) provenant de multiples tissus de souris. Les IF isolés peuvent être utilisés pour étudier les changements dans les modifications post-traductionnelles par spectrométrie de masse et d'autres analyses biochimiques.
Abstract
Les filaments intermédiaires (IF), ainsi que les filaments d'actine et les microtubules, forment le cytosquelette - un élément structurel critique de chaque cellule. Les mécanismes de fonctionnement normal fournissent aux cellules une résilience mécanique et résistante au stress, tandis qu'un cytosquelette SF dysfonctionnel compromet la santé cellulaire et a été associé à de nombreuses maladies humaines. Les modifications post-traductionnelles (PTM) régulent de manière critique la dynamique de l'IF en réponse aux changements physiologiques et aux conditions de stress. Par conséquent, la capacité de surveiller les changements dans la signature PTM des IF peut contribuer à une meilleure compréhension fonctionnelle et, en fin de compte, le conditionnement du système IF en tant que résonateur de stress pendant les lésions cellulaires. Cependant, le grand nombre de protéines IF, codées par plus de 70 gènes individuels et exprimés de manière dépendant des tissus, est un défi majeur pour trier l'importance relative des PTM différents. À cette fin, des méthodes permettant la surveillance des PTM sur les protéines IFÀ l'échelle de l'organisme, plutôt que pour les membres isolés de la famille, peut accélérer les progrès de la recherche dans ce domaine. Ici, nous présentons des méthodes biochimiques pour l'isolement de la fraction totale, détergente-soluble et détergente des protéines IF de 9 différents tissus de souris (cerveau, coeur, poumon, foie, intestin grêle, intestin grêle, pancréas, rein et rate). Nous démontrons en outre un protocole optimisé pour l'isolement rapide des protéines IF en utilisant la matrice de lysage et l'homogénéisation automatisée de différents tissus de souris. Le protocole automatisé est utile pour le profilage des IF dans des expériences avec un volume élevé d'échantillons (comme dans les modèles de maladies impliquant plusieurs animaux et des groupes expérimentaux). Les échantillons résultants peuvent être utilisés pour diverses analyses en aval, y compris le profil PTM à base de spectrométrie de masse. En utilisant ces méthodes, nous fournissons de nouvelles données pour montrer que les protéines IF dans différents tissus de souris (cerveau et foie) subissent des changements parallèles par rapport à leur expressionLes niveaux de tension et les PTM pendant le vieillissement.
Introduction
Les IF sont une famille de protéines qui, chez l'homme, sont codées par 73 gènes et classées en six types majeurs: les types I-IV sont cytoplasmiques ( par exemple, les kératines épithéliales et capillaires (K), les desmin de myocytes, les neurofilaments, la protéine acide fibrillaire glieuse (GFAP) et d'autres); Type V sont les laminés nucléaires; Et le type VI sont des IF dans l'objectif 1 . En ce qui concerne leur organisation moléculaire, les protéines IF possèdent trois domaines communs: un domaine de "tige" à bobine enroulée hautement conservé et des domaines globulaires de "tête" et "queue". Les tétrastes de protéines IF se forment pour former des précurseurs de filaments courts, qui sont finalement incorporés dans des filaments matures qui forment des structures cytosquelettiques et nucléosquelettes dynamiques impliquées dans la protection mécanique 2 , la détection du stress 3 , 4 , la régulation de la transcription 5 et la croissance et d'autres fonctions cellulaires critiques"> 1 , 6 , 7 .
L'importance fonctionnelle du système IF est soulignée par l'existence de nombreuses maladies humaines causées par des mutations missense dans les gènes IF, y compris les neuropathies, les myopathies, les troubles de la fragilité de la peau, les dysfonctionnements métaboliques et les syndromes de vieillissement prématuré 8 . Certaines mutations du gène IF ne causent pas, mais prédisposent leurs porteurs à la progression de la maladie, comme les kératines épithéliales simples dans la maladie du foie 9 . Ce dernier est dû aux fonctions critiques de protection contre le stress des IF dans les épithéliums. Les IF en général sont parmi les protéines cellulaires les plus abondantes dans des conditions basales, mais sont encore fortement induites lors de divers types de stress 10 . Par exemple, des études récentes évaluant les changements à l'échelle du protéome dans le nématode C. elegans ont démontré que les IF multiples sont très régulées et enclines à l'agrégatPendant le vieillissement organique 11 , 12 . Étant donné que la maintenance d'une structure IF appropriée est essentielle pour la résistance cellulaire à diverses formes de stress 10 , l'agrégation FI peut également contribuer au déclin fonctionnel pendant le vieillissement. Cependant, des études au niveau de l'organisme examinant de multiples protéines IF de mammifères à travers différents tissus soumis au stress sont insuffisantes.
Les IF sont des structures hautement dynamiques qui s'adaptent aux besoins des cellulaires. Les kératines, par exemple, subissent un cyclisme indépendant de la biosynthèse entre un groupe protéique soluble (non filamenteux) et insoluble (filamentaire) 13 . Dans des conditions physiologiques normales environ 5%, le pool K8 / K18 total peut être extrait dans un tampon sans détergent, par rapport à environ 20% qui peut être solubilisé dans le détergent non ionique Nonidet P-40, qui est biochimiquement comparable à Triton- X100 14 , 15 . Au cours de la mitose, il y a une augmentation notable de la solubilité de l'épithéliale de type simple K8 et K18 14 , qui est moins apparente dans les kératines épidermiques mais plus apparente dans la vimentine et d'autres protéines IF de type III 15 , 16 . Les propriétés de solubilité des protéines IF sont étroitement réglementées par la phosphorylation, une modification clé après la traduction (PTM) pour le réarrangement des filaments et la solubilité 17 , 18 , 19 , 20 . La plupart des IF sont soumises à une réglementation étendue par un certain nombre de PTM sur des sites conservés, ce qui entraîne des changements fonctionnels 17 .
Le but de cette méthode est d'introduire des chercheurs qui sont nouveaux dans le champ IF pour l'extraction biochimique et les méthodes analytiques pour l'étude des protéines IF à travers de multiples tissus de souris. SpécifiqueNous nous concentrons sur l'isolement des protéines IF en utilisant une méthode d'extraction à haute teneur en sel et une évaluation des changements dans les PTM par spectrométrie de masse et par des anticorps ciblant PTM. Ces méthodes s'appuient sur les procédures précédemment publiées 21, mais incluent des modifications pour extraire différents types de protéines IF pour révéler un mécanisme commun de régulation dans la famille IF. Par exemple, l'acétylation de K8 à un résidu de lysine spécifique régule l'organisation du filament, tandis que l'hyperacétylation favorise l'insolubilité du K8 et la formation d'agrégats 22 . Des études récentes sur le profil protéomique mondial ont en outre révélé que la plupart des protéines IF spécifiques des tissus sont également des cibles pour l'acétylation et que la plupart des sites d'acétylation IF sont confinés au domaine de la tige très conservé. Cela souligne la nécessité de méthodes adaptées au profilage global du système IF. Nous introduisons également une méthode rapide d'isolement des protéines IF à partir de tissus multiples en utilisant une homogénéisation automatique en optiMatrice de lysisation. Les préparations résultantes sont appropriées pour l'analyse PTM en aval par spectrométrie de masse et d'autres méthodes.
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Protocol
Le protocole est approuvé et exécuté conformément au Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux (IACUC) à l'Université de Caroline du Nord.
1. Préparations
- Préparer le tampon Triton-X (1% de Triton X-100, 5 mM d'acide éthylènediaminetétracétique (EDTA), augmenter le volume dans une solution salée tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4). Pour faire 500 ml: agiter 5 ml chacun de Triton X-100 et 500 mM d'EDTA dans 490 ml de PBS, pH 7,4. Conserver la solution tampon Triton-X à 4 ° C.
- Préparer un tampon de sel élevé (10 mM de Tris-HCl, pH 7,6, 140 mM de NaCl, 1,5 M de KCl, 5 mM d'EDTA, 0,5% de Triton X-100, augmenter le volume dans du double distillât (dd) H 2 O). Pour préparer 500 ml, on agite 10 ml de Tris-HCl 0,5 M (pH 7,6), 14 ml de NaCl 5 M, 55,9 g de KCl, 5 ml d'EDTA 0,5 M et 2,5 ml de Triton X-100, ajustez le volume à 500 ML en utilisant de l'eau distillée double). Stocker la solution tampon de sel élevée à 4 ° C.
- Juste avant l'utilisation, compléter une quantité appropriée de Triton-X et High Salt Buffer (
- Préparer 5 mM d'EDTA dans 1x PBS, pH 7,4. Pour faire 500 ml: agiter 5 ml d'EDTA 0,5 M dans 495 ml de 1x PBS, pH 7,4.
- Isoler différents organes de souris (cerveau, cœur, poumon, foie, pancréas, côlon, intestin, rein, rate) en utilisant des protocoles approuvés conformes aux directives vétérinaires et aux normes institutionnelles 23 . La procédure de collecte des tissus ne doit pas dépasser 5 minutes pour préserver l'intégrité de l'ARN et de la protéine des tissus riches en protéase ( par exemple, le pancréas doit être traité en premier).
- Couper une petite quantité de tissu (~ 5-20 mg) et placer dans une solution de stockage d'ARN, pour une extraction ultérieure de l'ARN, une synthèse d'ADNc et une analyse quantitative en temps réel de la PCR pour l'expression du gène IF. Placez les tubes de solution de stockage d'ARN avec des tissus à 4 ° C pendant la nuit et suivez le protocole du fabricant pour de plus amples informations.Torage et étapes d'isolement.
- Couper le reste du tissu en fragments plus petits ( par ex. 0,5 cm) et placer dans des cellules cryogéniques. Geler et stocker des flacons à -80 ° C ou de l'azote liquide pour un stockage à plus long terme.
2. IF Analyse d'expression génique
- Extraire l'ARN des tissus conservés dans le réactif de solution de stockage d'ARN. Utiliser toute méthode d'extraction d'ARN appropriée / préférée selon le protocole du fabricant.
- Quantifier la concentration d'ARN et utiliser 2 μg d'ARN pour générer de l'ADNc en utilisant un kit de transcription inverse approprié selon le protocole du fabricant.
- L'utilisation des amorces spécifiques du gène ADN spécifique de l'ADNc et de la souris IF met en place des réactions qPCR, y compris trois répétitions techniques de chaque échantillon ainsi qu'un contrôle en blanc selon le protocole du fabricant.
- Quantifier l'expression du gène IF comme changement de pli en comparant différentes conditions ( p. Ex. Tissu jeune ou ancien).
3. PRéparation des lysats totaux de tissu pour immunoblot
- Homogénéiser 25 mg de tissu dans 1 mL de 2x tampon d'échantillon SDS non réducteur. Omettre le colorant bleu de bromophénol à partir du tampon d'échantillon si un dosage de protéine colorimétrique doit être effectué pour quantifier la concentration de protéines.
- Ajouter 5% (v / v) de 2-mercaptoethanol (2-ME) pour faire des échantillons réduits. À 200 μL des échantillons non réducteurs, ajouter 10 μL de 2-ME.
- Déterminer la concentration de protéines en utilisant un dosage de protéines compatible avec les agents détergents et réducteurs. Si le colorant est déjà inclus dans le tampon d'échantillon, la quantité de protéine peut être estimée après avoir couru un gel via un certain nombre de techniques, y compris la tache à base de Coomassie 24 .
- Vortez tous les échantillons et chauffez à 95 ° C pendant 5 min.
- Effectuez le Western Blot sous des conditions réductrices et non réductrices. Exposer la membrane brièvement (<1 min) pour révéler les espèces monomères et plus longtemps (> 1 min) pour révéler des complexes de masse moléculaire élevéeNg de protéines IF. Si vous surveillez l'agrégation, examinez tout le gel / membrane (y compris le fond des puits de gel).
- Exécutez un gel parallèle et tachez avec une tache de protéine comme contrôle de chargement 24 . Dans les modèles de maladie ou les expériences sur les blessures, la tache de protéines totales doit être utilisée comme contrôle de chargement, par opposition aux immunoblots pour les protéines de «ménage» ( p . Ex. Actine, GAPDH) car celles-ci changent selon différentes conditions de stress.
4. Préparation des extraits solubles dans le sol et des extraits riches en sel des IF spécifiques des tissus
- Ajouter 1 ml de tampon Triton X-100 glacé dans un homogénéisateur à tube de verre et placez-le sur de la glace.
- Enlevez un petit morceau de tissu (~ 25 mg) à partir d'un stockage d'azote liquide et placez-le directement dans l'homogénéisateur de verre. Utilisez un pilon polytétrafluoroéthylène pour homogénéiser (50 coups) et évitez de faire des bulles. Conservez l'homogénéisateur et le lysat à tout moment.
- Transférer le lysat à un micron de 1,5 mLTube d'ocentrifugation sur glace et centrifuge à 20 000 xg pendant 10 minutes dans une centrifugeuse pré-refroidie (4 ° C).
- Recueillir la fraction surnageante dans un tube séparé. Il s'agit de la fraction soluble dans Triton X, qui peut être utilisée pour l'immunoprécipitation (ip) et l'analyse du pool de protéines IF soluble dans les détergents. Notez que les étapes 4.1-4.4 peuvent être répétées pour obtenir un extrait IF plus propre du tissu cérébral.
- Ajouter 1 mL de High Salt Buffer à la pastille de tissu, transférer à un homogénéisateur propre et lancer 100 traits. Transférer l'homogénat sur le tube de microcentrifugeuse et placer le tube sur un agitateur rotatif dans la chambre froide pendant 1 h.
- Centrifuger les homogénats à 20 000 xg pendant 20 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Ajouter 1 ml de tampon PBS / EDTA glacé à la pastille et homogénéiser la pastille (20 coups) dans un homogénéisateur propre comme étape finale de nettoyage *. Transférer dans un nouveau tube et centrifuger à 20 000 xg pendant 10 min à 4 ° C pour obtenir la protéine IF-Extrait riche en sel élevé (HSE).
* En option, vortex au lieu d'homogénéisation à cette étape. - Jeter le surnageant et dissoudre les pastilles dans 300 μL de tampon d'échantillon SDS non réducteur qui a été préchauffé. Décomposer la pastille initialement par pipettage et vortex, puis chauffer les échantillons pendant 5 min à 95 ° C.
- Vortex et pipette au besoin pour assurer la dissolution de la pastille. Il peut y avoir plusieurs minutes pour dissoudre complètement les pastilles.
- Conservez tous les échantillons à -20 ° C jusqu'à l'analyse.
5. Lysis automatisée des tissus pour l'extraction de la protéine IF dans les expériences en volume élevé
- Pour l'extraction de l'ARN, placer un tampon de lyse (600 μL de tampon par 25 mg de tissu) dans un tube contenant une matrice de lys D (utiliser de petites sphères de céramique) et l'impulsion deux fois pendant 25 s dans le lyser du tissu. Séparer le lysat de la matrice par centrifugation à 20 000 xg et passer à l'étape suivante isolément.
- Pour l'extraction des protéines, placez TritSur X-100 (ou tampon d'échantillon SDS si préparer le lysat total) dans un tube de lys avec matrice de lys SS (utiliser un seul cordon en acier inoxydable). Après avoir testé plusieurs matrices, cela a été sélectionné car il produit des extraits de protéines IF qui ont une qualité similaire à celle de la méthode traditionnelle de dounement. Notez que la méthode automatisée n'est pas optimale pour le pancréas et la rate, et le protocole d'homogénéisation standard doit être utilisé pour ces tissus.
- Pour procéder à la préparation d'un extrait de sel élevé, retirer le cordon en acier inoxydable du tube à l'aide d'un aimant et centrifuger les tubes à 20 000 xg pendant 10 minutes à 4 ° C.
- Continuez avec l'étape 4.4 (ci-dessus) du protocole manuel.
- Conservez tous les échantillons à -20 ° C jusqu'à l'analyse.
6. Immuno-enrichissement des protéines IF modifiées après la traduction
- Préparer le tampon PBST (0,02% de Tween-20 dans PBS). Pour préparer 50 mL, ajouter 10 μL de Tween-20 à 50 mL de PBS, pH 7.4.
- Préparer l'anticorps PTMSolution (1-10 μg d'anticorps dans 200 μL de PBST). En général, 3 μg d'anticorps / réaction est une bonne condition de départ qui peut être optimisée si nécessaire.
- Pour chaque réaction, aliquotez 50 μL de perles magnétiques dans un tube à microcentrifugeuse, placez-le sur l'aimant et aspiraz la solution de stockage de perles.
- Conjuger les perles à l'anticorps immunoprécipitant en le suspendant à nouveau dans la solution d'anticorps et en incubant sur le rotateur (extrémité supérieure, pour assurer un mélange de petits volumes) à température ambiante pendant 20 min.
- Placez les tubes sur l'aimant et aspirer la solution d'anticorps.
- Rincer les billes conjuguées à des anticorps une fois dans 200 μL de PBST et retirer le tampon de lavage.
- Ajouter 0,6-1 mL de lysat tissulaire sur les perles, mélanger par pipetage doux et incuber pendant 3 h sur un rotateur dans une chambre froide.
- Placer les tubes sur l'aimant, enlever le lysat et laver les billes cinq fois avec 200 μL de PBST. Après la dernière étape de lavage, ramasser les perles dans 100 _6; L de PBS (sans Tween-20) et transférer à un nouveau tube propre. Placez le tube sur l'aimant.
- Aspirer le PBS et ajouter 100 μL de tampon d'échantillon non réducteur. Retirez 50 μL et ajoutez 2-ME (5%) pour réaliser des échantillons réducteurs. Chauffer les échantillons à 95 ° C pendant 5 min.
- Séparez la fraction ip des perles sur l'aimant et la collectez dans un nouveau tube.
- Stocker les échantillons à -20 ° C jusqu'à l'analyse.
7. Préparation des échantillons de protéines IF pour l'analyse de spectrométrie de masse
- Organiser une consultation avec un expert en protéomique avant de lancer une étude, car il existe un temps et des coûts importants liés à l'analyse de la spectrométrie de masse.
- Prenez des précautions particulières pour éviter toute contamination. Manipuler tous les gels avec des gants propres et incuber dans des récipients propres, laver uniquement avec du ddH 2 O (éviter le savon).
- Exécuter 20-50 μL de l'échantillon HSE (des sections 4 et 5) sur un gel SDS-PAGE selon les conditions standard. Tachez avec une tache de protéine pendant 1 h. Rincer plusieurs fois et dé-tache dans ddH 2 O pendant la nuit. Les bandes de protéines IF doivent être facilement visibles après la décoloration.
- Placez le gel entre les protecteurs de feuilles en plastique, numérisez et marquez les bandes qui seront excisées et envoyées pour analyse.
- Accisez les bandes de protéines IF en utilisant un nouveau rasoir propre.
- Placez les bandes de gel dans des tubes de microcentrifugation propres et transférez-les dans une installation de spectrométrie de masse.
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Representative Results
Une nouvelle méthode rapide pour l'extraction à haute teneur en sel de protéines IF à partir de tissus de souris multiples utilisant une matrice de lysisation.
La méthode traditionnelle 25 , 26 d'isolement de la fraction de protéine de filament intermédiaire du tissu épithélial a été modifiée ici pour inclure 9 organes différents et une procédure plus rapide pour la lyse des tissus. Alors que 3 étapes d'homogénéisation manuelle sont requises pour la méthode traditionnelle, la procédure modifiée n'a que 1 étape d'homogénéisation manuelle, ce qui raccourcit la procédure de plusieurs heures, en particulier lors du traitement de plus de 6 échantillons. La figure 1A montre un résultat typique de HSE à partir de 9 tissus de souris, tandis que la table des protéines attendues dans le tissu et le poids moléculaire de chaque protéine est représentée sur la figure 1B
Le foie K8 et K18 sont fortement régulés à la hausse et subissent une phosphorylation accrue et une acétylation de lysine dans des foies de souris anciennes.
La figure 2 montre les résultats typiques de plusieurs des analyses décrites dans ce protocole. Le tableau A représente l'analyse d'expression des deux principaux gènes IF du foie, de la kératine 8 ( KRT8 )Et la kératine 18 ( KRT18 ), qui codent respectivement pour les protéines IF K8 et K18. Les kératines épithéliales sont fortement régulées selon diverses conditions de stress. Dans le résultat indiqué, cela se produit pendant le vieillissement , puisque KRT8 est significativement régulé à la hausse dans les foies de souris de 24 m contre 3 m de souris. Les résultats au niveau des protéines sont plus frappants, comme en témoigne l'augmentation spectaculaire du monomère K8 ainsi que des complexes de masse moléculaire élevée dans les vieux foies (24 m). La tache de protéines à base de coomassie sert ici de contrôle de chargement pour assurer un chargement égal de protéines à travers les échantillons. Notez qu'avec les lysats totaux du tissu, il est facile de surcharger les protéines sur un gel, car c'est dans ce cas. Le fait de charger un volume plus petit ou de diluer l'échantillon dans un tampon de dodécylsulfate de sodium (SDS) va alléger ce problème (surtout s'il semble visqueux et difficile à pipeter). Le panneau C représente un résultat typique d'un extrait de sel élevé de foie obtenu en utilisant le protocole automatiséOnstruisant le fort enrichissement des kératines 8 et 18 sur le gel. Les lignes rouges délimitent la zone qui a été excisée et soumises pour une analyse par spectrométrie de masse. Dans le tableau D, les résultats de l'analyse des spécifications de masse des échantillons dans le panneau C montrent que K8 et K18 dans l'ancien foie ont des sites multiples de phosphorylation et d'acétylation qui ne sont pas présents dans le jeune foie.
Le GFAP est fortement réglementé et la lysine acétylée dans le cerveau des anciennes souris.
La figure 3 démontre que les méthodes utilisées pour extraire des IF à partir d'épithélium peuvent également être utilisées sur des tissus non épithéliaux. En outre, les résultats révèlent un schéma général pour la régulation ascendante dépendante du vieillissement des gènes et des protéines de l'IF. Le résultat de qPCR dans la figure 2A révèle une induction 5 fois de l'ARNm de GFAP dans le cerveau de souris de 24 m contre 3 m de souris. Figure 2BRévèle des protéines totales présentes dans la fraction Triton X-100 et le HSE enrichi en IF. Notez l'augmentation de l'intensité de la bande à 50 kDa marquée par la flèche (correspondant au GFAP) dans l'ancien cerveau. L'analyse de transfert de Western dans la figure 2C révèle en outre la régulation positive du GFAP et une présence significative du monomère GFAP et du complexe potentiel de masse moléculaire potentielle dans la fraction Triton X-100 (tous deux marqués par des flèches). L'analyse Western Blot des mêmes échantillons avec un anticorps pan-acétyl-lysine montre que l'anticorps reconnaît une bande à ~ 50 kDa dans le HSE de l'ancien cerveau de souris et à ~ 250 kDa dans la fraction Triton X-100 ( Figure 2D ). L'immuno-enrichissement des protéines acétylées à partir des fractions Triton X-100 révèle une augmentation de la présence de protéines GFAP dans le lysat obtenu à partir de l'ancien cerveau. Des conditions de réduction et non réductrices montrent que les complexes de monomères GFAP et de masse moléculaire élevée sont mis en évidence. Analyse par spectrométrie de masse (similaire à la figure 1
Figure 1: lyse automatisée et extraction de protéines IF à partir de tissus de souris multiples. ( A ) Tache de gel à base de Coomassie de HSE à partir des tissus de souris désignés. Les tissus présentés ont été obtenus à partir d'une souris CBA mâle adulte (3 m). Les échantillons ont été traités comme décrit dans la section 5. Cerveau : notez que NFL, NFM et NFH sont fortement phosphorylés 27 et migrent plus lentement que prévu, respectivement à 70, 145 et 200 kDa. Coeur : en plus de la bande de 53 kDa correspondant à desmin et vimentin), les échantillons de coeur contiennent également une bande de ~ 42 kDa, représentant probablement l'actine, qui est connue pour co-purifier avec desmin 28 . LIntestin d'arge: l'identité des bandes proéminentes au-dessus de 25 kDa qui sont co-extraites avec K8 / K18 ne sont pas connues, mais ces bandes ne sont pas présentes si les tissus sont traités en utilisant la méthode traditionnelle d'homogénéisateur de dunch. Pancréas et rate : Notez que l'homogénéisation automatisée ne convient pas à l'isolement des kératines du pancréas et de la vimentine de la rate, vraisemblablement en raison de la sensibilité du lysat à la légère augmentation de la température pendant la pulsation dans le lyser du tissu. ( B ) Tableau montrant les principaux types de protéines IF présents dans les différents tissus et leur poids moléculaire prédit comme référence pour le panel A. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: MoleculEt des différences biochimiques dans les kératines du foie chez les souris jeunes et anciennes. ( A ) L'analyse de l'ARNm KRT8 et KRT8 en utilisant une procédure standard (Protocole 1) révèle une induction significative dans la transcription KRT8 dans les foies provenant de souris anciennes. N = 6 pour chaque condition (3 souris mâles et 3 femelles CBA ont été utilisées par groupe). ** p <0,01; ANOVA à sens unique. ( B ) Des lysats de foie totaux ont été obtenus auprès de 3 souris jeunes (3 mois) et 3 anciennes (24 mois) utilisant le Protocole 2 et les échantillons ont été analysés dans des conditions non réductrices. L'anticorps TS1 a été utilisé pour sonder l'expression de K8 et la tache de protéine à base de Coomassie a été utilisée comme témoin de chargement. ( C ) Des extraits riches en sel provenant de foies de souris jeunes et anciens, correspondant aux souris n ° 1 et n ° 4, respectivement du panneau B. Les deux flèches indiquent K8 et K18 sur le gel et la boîte rouge indique la partie du gel qui était Excisé et soumis pour analyse de spectrométrie de masse. ( D Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Différences moléculaires et biochimiques dans le GFAP du cerveau des souris jeunes et anciennes. ( A ) L'analyse de l'ARNm de GFAP en utilisant une procédure standard (Protocole 1) révèle une induction significative dans le cerveau des anciennes souris. N = 6 pour chaque condition (3 souris mâles et 3 femelles CBA ont été utilisées par groupe). ** p <0,01; ANOVA à sens unique. ( B ) Tache de protéines à base de coomassie de Triton X-100 et des fractions HSE à partir d'un tissu cérébral de souris jeune (3 mois) et ancienne (24 mois). Notez l'augmentation de la bande GFAP de ~ 50 kDa dans le HSE du cerveau ancien (flèche). ( C ) GFAP immunoblot (clone monoclonal de souris, GA5) des mêmes échantillons que le panneau B. ( D ) Immunotransctyle d'acétyl-lysine (polyclonale de lapin, Abcam ab80178) des mêmes échantillons que dans le panneau B. ( E ) Transfert de GFAP après immunoprécipitation avec de l'acétyl- Anticorps de lysine. Les échantillons ont été analysés dans des conditions non réductrices (NR) et réductrices (R) et les flèches indiquent une augmentation de la présence de GFAP dans l'immunoprécipité de l'ancien cerveau. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les méthodes qui permettent la caractérisation biochimique des protéines IF peuvent être utiles pour comprendre de nombreux phénomènes pathophysiologiques dans les systèmes de mammifères, car les protéines IF sont à la fois des marqueurs et des modulateurs du stress cellulaire et tissulaire 29 . Le principe de la méthode actuelle repose sur les procédures initiales développées dans les années 1970 et 1980 pour isoler, séparer et reconstituer les protéines IF des cellules et des tissus, en utilisant généralement des solutions salées faibles et élevées et du détergent Triton-X100 25 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 . Pour un aperçu historique des études qui ont soutenu l'isolement biochimique des protéines IF, veuillez consulter les commentaires récents 36 , 37 . La méthode actuelleEst basé sur des protocoles plus récents développés pour l'étude de kératines épithéliales simples 26 . L'avantage de la méthode est qu'il peut servir d'étape initiale pour permettre aux chercheurs qui sont nouveaux dans le champ IF d'isoler efficacement les protéines IF de la plupart des tissus de mammifères. Il représente un guide visuel des procédures connexes qui sont largement utilisés par les chercheurs dans le domaine pour étudier la régulation des protéines IF 21 , 38 .
Cette technique peut être utilisée pour étudier la régulation et la fonction des IF dans les mécanismes de communication du stress entre les tissus 39 , 40 des mammifères. Il est de plus en plus reconnaissant que le stress dans un tissu peut affecter le fonctionnement d'autres tissus, par exemple dans des conditions de stress nutritionnel 41 , de maltraitance de protéines 42 , de stress métabolique 43 et d'autresEr changements. Il est à noter que la plupart des travaux actuellement en cours dans ce domaine sont dans les modèles de Drosophila et C. elegans , alors que les études sur les réponses répandues au stress dans les systèmes de mammifères font défaut. En tant que principal régulateur du stress cellulaire 10 , le système IF peut débloquer des indices pour les réponses au stress au niveau de l'organisme, ce qui peut avoir des répercussions importantes sur la maladie. En tant que tel, le protocole actuel peut être utilisé pour étudier les mécanismes pathophysiologiques mondiaux dans divers modèles de souris du stress, des blessures et des maladies.
Une limitation de la technique actuelle est que les extraits à haute teneur en sel sont considérés comme des préparations IF "brutes" puisqu'ils contiennent également d'autres protéines associées à la FI, telles que la plectine, par exemple 44 . Comme montré précédemment, les HSE peuvent être dénaturés dans un tampon d'urée 8 M pour obtenir des protéines IF hautement puissantes qui sont capables de réassembler in vitro dans le tampon phosphate 44 . Après deux de ces cycles deLe désassemblage et le réassemblage, la stoechiométrie des protéines IF (isolées des cellules HeLa) est restée la même, alors que le traitement par l'urée a éliminé la plectine 44 . Pendant la purification du desmin, l'actine peut être éliminée par solubilisation du HSE dans l'acide acétique 45 . La question de savoir si des étapes de purification supplémentaires doivent être incluses dépend du but ultime de l'expérience. Par exemple, si l'objectif est de caractériser l'état d'assemblage et de générer des IFs reconstitués in vitro, l'étape d'urée est nécessaire pour obtenir des protéines IF hautement puissantes. D'autre part, si l'objectif est d'identifier les associations dépendantes du contexte entre les IF et d'autres protéines cellulaires, les préparations "brutes" peuvent être utilisées. Les protéines interagissant peuvent être identifiées par spectrométrie de masse en utilisant soit un digeste en gel pour des cibles d'abondance élevées visibles par une tache de gel, soit une digestion en solution pour des cibles à faible abondance. Études antérieures utilisant l'immunoprécipitation de FIs détergents solubles et HSEContenant des protéines IF identifiaient une interaction spécifique fonctionnellement importante entre les kératines 8/18 et la protéine de choc thermique 70 (Hsp70), qui est potentialisée après la contrainte thermique 46 , la protéine d'adaptateur 14-3-3 après la phosphorylation 47 et la kinase Raf-1 K8 / K18 Dans des conditions physiologiques normales 48 parmi d'autres. Le protocole actuel peut permettre des études similaires sur d'autres protéines IF.
L'utilisation de la matrice de lysage est une modification clé des méthodes précédentes et devrait permettre une extraction rapide des IF à partir de tissus multiples, à l'exception du pancréas et de la rate. L'automatisation des étapes initiales peut être particulièrement utile pour les expériences de souris à grand volume. Par exemple, l'isolement des protéines IF de 3 tissus différents de 10 souris par état ( par exemple , une forme normale et une forme quelconque de stress ou de maladie systémique) nécessitera le traitement de 60 tissus individuels. En utilisant la méthode manuelle traditionnelle, ce woIl faut faire plusieurs lots et peut prendre plusieurs jours. Cependant, en utilisant la méthode automatisée avec matrice de lysing, la procédure peut être effectuée en quelques heures seulement. Les étapes essentielles de la procédure sont les suivantes: s'assurer que l'échantillon reste froid tout au long de la procédure; Incubation dans un tampon salé élevé pendant 1 heure (étape 4.5); En utilisant un tampon chaud et un vortex étendu pour assurer une remise en suspension complète de la pastille avant analyse (étape 4.8); Et prendre toutes les précautions nécessaires pour éviter la contamination des échantillons par une spectrométrie de masse (étape 7.2).
L'inconvénient majeur de l'identification par spectrométrie de masse des sites PTM est que cela fonctionne très bien pour certains PTM - la phosphorylation et l'acétylation de la lysine étant des exemples primitifs - mais d'autres, comme la résoélation, sont beaucoup plus difficiles 49 . Néanmoins, la protéomique est un outil puissant pour étudier la régulation des protéines dans les tissus normaux et malades. Agnetti et al. Compilé un exhaustifUn aperçu actuel des techniques protéiniques de pointe utilisées actuellement pour étudier diverses PTM dans le contexte des protéines exprimées en tissu 50 . Le but de la méthode actuelle est de générer des échantillons qui peuvent être appliqués pour différents types d'analyses. Par exemple, la sommation in vitro peut être effectuée sur des protéines IF précipitées par l'immunité, et la sommation globale peut être évaluée sur des FI isolés dans des préparations HSE en utilisant des anticorps spécifiques au sumo 18 , 21 . Par conséquent, l'application de cette méthode ne se limite pas à la génération d'échantillons uniquement pour l'analyse par spectrométrie de masse mais peut être utilisée pour sonder plusieurs propriétés IF en utilisant diverses techniques en aval.
Les protéines IF sont largement régulées par de nombreux PTM dans des sites conservés, ce qui entraîne une modification de la solubilité, de l'assemblage des filaments et des interactions protéiques 17 . Des progrès technologiques récents ont été dévoilésLa magnitude incroyable, la complexité et la signification de la maladie des modifications post-traductionnelles (PTM) sur les protéines cellulaires 51 , 52 , 53 . L'amélioration des méthodes de détection des PTM communs, telles que la phosphorylation 54 et l'acétylation 51 , a donné de vastes catalogues de données, mais la compréhension de leur signification biologique - le craquement du «code PTM» - est un défi majeur à relever 55 , 56 . Une façon d'évaluer les rôles fonctionnels et l'importance relative de chaque PTM est de déterminer dans quelle mesure il est conservé chez plusieurs membres de la famille de protéines IF. Par exemple, l'identification d'un nouveau site de phospho-tyrosine sur K8 a révélé que ce site est contenu dans un motif QYE trouvé dans essentiellement toutes les protéines IF cytoplasmiques et critique pour la régulation de la solubilité de la protéine IF et du filament dyNalias 57 . Il est important de noter que la mutation du résidu de tyrosine conservé sur le GFAP à un acide aspartique "phosphomimique" à charge négative (Y242D) provoque Alexander Disease 58 . Les données représentatives montrées ici montrent comment deux types différents de protéines IF spécifiques aux tissus (K8 et GFAP) subissent un modèle similaire de régulation positive et une acétylation accrue pendant le vieillissement, ce qui peut être un effet du métabolisme altéré 22 , 51 . Cet exemple illustre l'utilité de la méthode pour comprendre la fonction des protéines IF à une échelle physiologique globale.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le NIH octroie au NI R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] et P30 DK034987 [à UNC-Chapel Hill]. Les auteurs remercient Deekshita Ramanarayanan pour l'assistance avec les expériences qPCR et Western Blot.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads Protein G | ThermoFisher Scientific | 10009 | immunoprecipitation beads |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for buffers |
| Purelink RNA mini kit | ThermoFisher Scientific | 12183018 | RNA extraction from tissue |
| Purelink DNAse set | ThermoFisher Scientific | 12185010A | on column DNA digestion |
| Dynamag-2 | ThermoFisher Scientific | 12321D | magnet for use with dynabeads |
| GelCode Blue Stain Reagent | ThermoFisher Scientific | 24592 | mass spectrometry-compatible gel stain |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher Scientific | 32106 | for use in western blot |
| High Capacity cDNA reverse transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4368813 | for use in gene expression analysis |
| Proflex 3 x 32-well PCR System | ThermoFisher Scientific | 4484073 | PCR system |
| PVDF transfer membrane | ThermoFisher Scientific | 88520 | for western blot |
| Power Up SYBR master mix | ThermoFisher Scientific | A25778 | for qPCR analysis |
| RNAlater | ThermoFisher Scientific | AM7020 | solution for tissue storage prior to RNA isolation |
| Novex 4-20% Tris Glycine Gel | ThermoFisher Scientific | XP04205BOX | Precast protein gel |
| Anti-Keratin 8 antibody (TS1) | ThermoFisher Scientific | MA514428 | for western blot detection of K8 |
| Anti-Vimentin | ThermoFisher Scientific | MA511883 | for western blot detection of vimentin |
| Tris Glycine Transfer Buffer (25x) | ThermoFisher Scientific | LC3675 | for wet transfer of protein gels |
| 2x SDS Sample Buffer | ThermoFisher Scientific | LC2676 | for preparing protein gel samples |
| Tris Glycine SDS Running Buffer (10x) | ThermoFisher Scientific | LC26755 | for running protein gels |
| Lysing beads - Matrix D | MP Biomedicals | 116913100 | Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction |
| Lysing beads - Matrix SS | MP Biomedicals | 116921100 | Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-LITE | measurement of protein and nucleic acid |
| Precellys 24 homogenizer | Bertin Instruments | EQ03119 | Automated tissue homogenizer |
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