ハイスループット DNA の抽出およびフィン クリッピングが 3dpf ゼブラフィッシュ仔のジェノタイピング
Summary
ゼブラフィッシュは、遺伝子編集技術の登場により、特に、生物医学研究における信頼性の高い遺伝モデル有機体として使用されています。幼虫の表現型の場合は、DNA 抽出と遺伝子型同定は挑戦できます。ここでは、尾クリッピング、早ければ 72 時間後受精によるゼブラフィッシュの幼虫、効率的なジェノタイピング手順について述べる.
Abstract
ゼブラフィッシュ (動脈分布) では、人間の病気と関連付けられる知られていた遺伝子の 84% 第オーソロガスを所有しています。さらに、これらの動物は、短い世代時間を持っているし、簡単処理、高い繁殖率、低コストを表示にして胚における DNA の微量注射による遺伝子操作に簡単に適しています。遺伝子編集ツールの最近の進歩は、ゼブラフィッシュの遺伝子と変異の正確な導入を迎えました。ゼブラフィッシュのモデリング病気幼虫の表現型と遺伝子型が不明な場合の解釈に挑戦することができますの早期死亡に します。遺伝子表現または質量分析法の研究など、サンプルのプールを必要とする実験に必要な遺伝子型のこの早期発見しています。ただし、遺伝的スクリーニングは、ほとんどのラボでのみ大人ゼブラフィッシュや死後の幼虫で実行される従来の方法によって制限されます。我々 は早ければ 72 時間後受精 (hpf) 達成することができる生きたゼブラフィッシュ幼虫からゲノム DNA を PCR 用の隔離のための方法を適応させることによってこの問題に対処します。この時間とコスト効果の高い手法、以前発行したジェノタイピング プロトコルから微細フィン バイオプシーから遺伝子の同定をことができます。フィンは、幼虫を開発に迅速に再生成します。研究者を選択し、この高速 PCR に基づくジェノタイピング プロシージャを用いた成人に必要な遺伝子型を上げることができます。
Introduction
ゼブラフィッシュ (動脈分布)治療仮説1,2,3の前臨床試験としてだけでなく病調査のためのモデルとして広く脊椎動物の生物します。これらの動物が短い世代時間、簡単処理、高い繁殖率、低コストを表示にして、胚4dna マイクロインジェクションにより遺伝子操作に簡単に従うです。新規トランスジェニック遺伝子の増加開発を通じて亜鉛指核酸 (ZFN)5タルのようなエフェクター核酸分解酵素 (TALENs)6,7、および、クラスター化定期的に空間短いなどの技術の編集回文を繰り返す (CRISPR)/CRISPR 関連 9 (Cas9) システム8ゼブラフィッシュは大幅にいくつかの病態の理解を改善するために態勢を整えています。これらの技術は、体細胞の両方のターゲットを絞ったノックアウトを作成する使用されている、ゼブラフィッシュ、効率的に遺伝子を醸成の生殖細胞変更動物8。本邦の最近の例は、ゼブラフィッシュ3,9,10、11,12 てんかん、代謝性疾患の遺伝学的モデルの開発に成功.
ゼブラフィッシュ ゲノム編集でなされる進歩、迅速かつ信頼性の高い遺伝子型別否定の律速段階となっています。予測されたゲノム編集ターゲット サイトに隣接する特定の DNA の突然変異の同定は、プロトコルの重要な段階です。伝統的に、フィン クリッピングによる遺伝子型解析技術は、通常のみで実行される少年や大人のゼブラフィッシュです。ただし、時間は成年期に引き上げゼブラフィッシュ (> 2 ヶ月) はかなり研究の進歩を遅らせます。多くの場合、必須遺伝子 (例えば、疾患モデル) または表現型の有害な影響につながる機能獲得変異のノックアウトによる成人期を実現できません。さらに、いくつかの試金は RNA または代謝物抽出のような幼虫のプールを必要とし、したがってジェノタイピング テクニックのホックの記事だけが利用できるときに挑戦できる遺伝子型の事前の同定が必要があります。これらの前述の例は、正確な同じ時に、完全復旧モデルと幼虫の正常な発展を有効にする幼虫検出技術の重要性を強調します。初期段階のゼブラフィッシュの遺伝子型が現在広く使用されるに表示されません。実験12,13,14の実行前に遺伝子型ではなく、事後のジェノタイピングによる幼虫の遺伝子型を識別する疾患モデルの最近の出版物に反映されます。本稿では以前に確立された遺伝子型のやり方を改善することを目指して幼虫フィン クリップ戦略を提案します。
過去には、遺伝子型にプロティナーゼ K 消化を採用戦略は幼虫が可変のポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 効率15につながっているゼブラフィッシュを住んでいます。もっと最近より有望な結果16を提供顕微鏡尾生検手法を公開、我々 と他のグループができませんでした高効率、著者によって報告された DNA の回復を再現します。ウィルキンソンらによって記述されたプロトコルの主要な後退16は、PCR チューブに尾組織を転送可能性があります。その顕微鏡サイズのため、フィンは正しく収集、ピペッティングにより調剤を確保するは難しいです。この障壁に対処するため遺伝子型9のほぼ 100% の効率で生きたゼブラフィッシュ幼虫数が多いため改良されたプロトコルを開発しました。Microscalpel を使用して、フィン尾の先端が削除され、フィルター紙の上に配置します。組織を含むフィルター紙の作品は、容易に視覚化し、PCR チューブに正しく配置できます。ゲノム DNA の抽出が実行されます、続いて遺伝子試料への関心領域の PCR の拡大。このメソッドの利点には、PCR 効率、低偽陽性率と低い死亡率率があります。さらに、多数の胚の遺伝子型は、このプロトコルを使用可能です。ここ記載されているプロトコルは、このアプローチと誘因の魚と 2 日以内尻尾再生の正しい id を使用して 2-3 h 内幼虫数百人のフィン クリッピングを使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
過去の突然変異とゼブラフィッシュの遺伝子を正確に紹介する編集ツールが採用されている遺伝子年5,6,7,8。病ゼブラフィッシュ モデルを実行すると、初期の幼虫や少年の表現型に9,12,13,14多く観察さ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、まれな疾患モデルと機構 (RDMM) ネットワーク (カナダ協会の健康研究 (機構) とゲノム カナダによって拠出された) に感謝したいと思います。CK は、支給奨学金授与 (オタワ大学) によってサポートされます。DLJ は、ヴァニエ カナダ大学院奨学金によってサポートされます。IAP はカナダ協会の健康研究 (機構) ポスドク ・ フェローシップ賞を受賞しています。作者に感謝、遺伝学協会許可からペナ、補足図 5 の適応を使用してこのプロトコルを公開するら。
Materials
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
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