3dpf 斑马鱼幼虫的高通量 DNA 提取及基因分型研究
Summary
斑马鱼在生物医学研究中被用作可靠的遗传模型有机体, 特别是随着基因编辑技术的出现。当幼虫表型预计, DNA 提取和基因的鉴定可能是挑战。在这里, 我们描述了一个有效的基因分型程序的斑马鱼幼虫, 通过尾部修剪, 早在72小时后受精。
Abstract
斑马鱼 (斑马斑马) 拥有 orthologues 已知与人类疾病相关的84% 的基因。此外, 这些动物有短的世代时间, 容易处理, 显示高繁殖率, 低成本, 并且容易地接受基因操作通过微注射 DNA 在胚胎。基因编辑工具的最新进展使斑马鱼的突变和转基因得到精确的引入。在斑马鱼的疾病建模往往导致幼虫表型和早期死亡, 这可能是挑战, 以解释, 如果基因的未知。在需要样本池的实验中也需要这种早期的基因型鉴定, 例如基因表达或质谱研究。然而, 广泛的基因型筛选受传统方法的限制, 在大多数实验室仅对成年斑马鱼或死后幼虫进行。我们解决这个问题的方法是, 采用一种分离 PCR 现成的基因组 DNA 从活斑马鱼幼虫, 可以达到早在72小时后受精 (hpf)。这一时间和成本效益的技术, 改进了从以前公布的基因分型协议, 允许鉴定的基因, 从微观鳍活检。随着幼虫的发育, 鳍迅速再生。然后, 研究人员可以利用这种高通量 PCR 的基因分型方法, 选择并提高所期望的成年期。
Introduction
斑马鱼 (斑马斑马)是一种脊椎动物有机体, 广泛用作疾病调查的模型, 以及治疗假说1,2,3的临床前检验。这些动物有短的世代时间, 容易处理, 显示高繁殖率, 低费用, 并且容易地接受基因操作通过显微注射 DNA 在胚胎4。通过新的转基因和基因编辑技术的不断发展, 如锌指核酸 (ZFN)5, 核酸 (TALENs)6,7和聚集定期 Interspaced 短回文重复 (CRISPR)/CRISPR 相关 9 (Cas9) 系统8, 斑马鱼准备大大提高对几个病理条件的理解。这些技术已经被用来在斑马鱼的体细胞和生殖细胞中产生靶向性的挖空, 有效地培养转基因动物8。最近在文献中的例子包括成功地开发了癫痫的遗传模型和代谢紊乱在斑马鱼3,9,10,11,12.
随着斑马鱼基因组编辑的进展, 快速而可靠的基因分型已成为不可否认的限速步骤。在预测基因组编辑目标站点附近的特定 DNA 突变的识别是该协议的一个重要阶段。传统上, 鳍片修剪的基因分型技术通常只在青少年或成年斑马鱼身上进行。然而, 将斑马鱼饲养到成年 (> 2 月) 的时间大大延缓了研究的进展。在许多情况下, 由于关键基因的挖空 (例如疾病建模) 或功能突变导致的表型效应, 成年无法实现。此外, 一些化验需要收集幼虫, 如在 RNA 或代谢物提取, 从而涉及事先鉴定的基因型, 这可能是挑战时, 只有特殊的基因组技术可用。上述例子突出了幼虫基因分型技术的重要性, 同时也是精确的, 能够充分恢复和正常发育的幼虫。早期斑马鱼的基因分型目前似乎没有得到广泛应用;最近的一些疾病模型的出版物反映了这一点, 其中幼虫基因型是通过验尸后基因类型确定的, 而不是在实验12、13、14的执行之前分基因。本文提出了一种幼虫夹鳍策略, 旨在改进以前建立的基因分型程序。
过去, 采用蛋白酶 K 消解基因型活斑马鱼幼虫的策略导致了变聚合酶链反应 (PCR) 效率15。虽然最近公布的显微尾部活检技术提供了更有希望的结果16, 我们和其他小组无法重现的高效率和 DNA 恢复报告的作者。威尔金森等所描述的协议的一个重大倒退。16可能是尾巴组织的转移到 PCR 管。由于其显微尺寸, 很难确保鳍被正确收集和配发的吹打。为了解决这一障碍, 我们开发了一种改进的协议, 用于对大量活斑马鱼幼虫进行基因分型, 其效率为 100%9。使用 microscalpel, 鳍尾的尖端被移除并放置在一张滤纸上。该片含有组织的滤纸可以很容易地可视化, 并正确地放入 PCR 管。然后进行基因组 DNA 提取, 然后进行 PCR 扩增的感兴趣区域基因型的标本。该方法的优点有: PCR 效率高, 假阳性率低, 死亡率低。另外, 使用该协议可以对大量胚胎进行基因分型。本文所述的协议允许在 2-3 小时内用这种方法对数以百计的幼虫进行翅片修剪, 并在两天内正确识别 genotyped 鱼和尾再生。
Protocol
Representative Results
Discussion
基因编辑工具已经被用来精确地引入突变和转基因在过去几年斑马鱼5,6,7,8。在斑马鱼进行疾病建模时, 早期幼虫或幼年表型通常观察到9、12、13、14。这里提出的协议描述了从小斑马鱼幼虫尾活检中提取 PC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者希望感谢稀有疾病模型和机制 (RDMM) 网络 (由加拿大卫生研究所 (卫生研究院) 和加拿大基因组资助)。CK 获得 UROP 奖学金 (渥太华大学) 的支持。DLJ 得到加拿大 Vanier 研究生奖学金的支持。由加拿大卫生研究院 (卫生研究院) 博士后奖学金奖资助。作者感谢美国遗传学学会批准发布这项协议, 并使用修改的补充图5的修订,等等。
Materials
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
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