Экстракции ДНК высокой пропускной способностью и генотипирования 3dpf личинки у рыбок данио путем отсечения Fin
Summary
Данио рерио были использованы как надежные генетических модельные организмы в биомедицинских исследований, особенно с появлением гена редактирования технологий. Когда личинки фенотипов, как ожидается, добыча и генотип идентификации ДНК может быть сложным. Здесь мы описывают процедуру эффективного генотипирования данио рерио личинок, путем отсечения хвост, 72-h после оплодотворения в кратчайшие сроки.
Abstract
Данио рерио (Danio рерио) обладают orthologues 84% генов, известно, что связано с заболеваниями человека. Кроме того эти животные имеют короткий поколения время, легко обрабатывать, показать высокий уровень репродуктивного, низкая стоимость и легко поддаются генетических манипуляций путем микроинъекции ДНК в эмбрионов. Последние достижения в гене, инструменты редактирования позволяют точного внедрения мутаций и трансгенов в данио рерио. Моделирование в zebrafish часто заболевание приводит к личиночной фенотипы и ранней смерти, которая может быть сложным для интерпретации если генотипы неизвестны. Это раннее выявление генотипов также является необходимой в экспериментах, требующих объединения образцов, таких, как ген выражение или масс спектрометрии исследования. Однако обширные генотипической проверки ограничено традиционными методами, которые в большинстве лаборатории выполняются только на взрослых рыбок данио или в посмертных личинки. Мы решили эту проблему путем адаптации метод для изоляции ПЦР готовые геномной ДНК от живой данио рерио личинки, которые могут быть достигнуты в кратчайшие сроки 72 ч после оплодотворения (hpf). Это время и экономически эффективные техники, по сравнению с ранее опубликованной генотипирования протокол, позволяет идентификации генотипов из микроскопических плавник биопсии. Плавники быстро регенерировать как развиваются личинки. Затем исследователи способны выбрать и поднять желаемого генотипов к взрослой жизни, используя этот высокой пропускной способностью на основе ПЦР генотипирования процедуры.
Introduction
Данио рерио (данио рерио) позвоночных организм, широко используется в качестве модели для проведения расследования болезни, а также для Доклинические испытания терапевтических гипотез1,2,3. Эти животные имеют короткий поколения время, легко обрабатывать, показать высокий уровень репродуктивного, низкая стоимость и легко поддаются генетических манипуляций путем микроинъекции ДНК в4эмбрионов. Через все большее развитие Роман трансгенных и Джин редактирования технологии, такие как Цинк-пальцевый nucleases (ZFN)5, Таль как эффекторных Nucleases (Таленс)6,7и кластерные регулярно Interspaced короткие Рецидивирующий повторяет (ТРИФОСФАТЫ) / связанные ТРИФОСФАТЫ 9 (Cas9) системы8, данио рерио poised для того чтобы существенно улучшить понимание некоторых патологических условий. Эти технологии были использованы для создания целевых нокауты в обоих соматических и микрофлорой ячейки в данио рерио, эффективно порождает генетически изменены животных8. Последние в литературе примерами успешного развития генетической модели эпилепсии и метаболических расстройств в zebrafish3,9,10,11,12 .
С прогресс, достигнутый в zebrafish изменения генома быстрый и надежный генотипирования стал неоспоримым тариф ограничивая шаг. Выявление специфических мутаций ДНК, прилегающих к прогнозируемого изменения генома целевой сайт является важным этапом протокола. Традиционно методов генотипирования плавник отсечения, как правило, только при исполнении несовершеннолетних или взрослых рыбок данио. Однако, время, затраченное поднимая данио рерио до зрелого возраста (> 2 месяца) значительно замедляет прогресс в научных исследованиях. Во многих случаях нельзя достичь совершеннолетия за выбивание важно генов (например, в моделировании болезни) или получить из функция мутаций приводит к пагубным фенотипические эффектам. Кроме того несколько анализов требуют объединения личинок, такие как извлечение RNA или метаболита и таким образом включают предварительной идентификации генотипов, которые может быть сложной задачей, когда доступны только пост Специального генотипирования методы. Эти вышеупомянутые примеры подчеркивают важность личиночной генотипирования методов, которые в то же время точного и полного восстановления и нормального развития личинок. Ранние стадии данио рерио генотипирования не представляется в настоящее время широко использоваться; Это отражено в последних публикациях болезни моделей, в которых определяются личиночной генотипов через post-mortem генотипирования, вместо того, чтобы генотипирования до выполнения эксперимента12,,1314. В этом документе стратегия клип личиночной плавник представлены стремилась улучшить генотипирования ранее установленных процедур.
В прошлом стратегии, используя протеиназы K пищеварения генотип живут данио рерио, личинки привели к переменной полимеразной цепной реакции (ПЦР) эффективности15. Хотя более недавно опубликовал микроскопических хвост биопсии технику предоставляется более многообещающие результаты16, мы и другие группы не смогли воспроизвести высокой эффективностью и восстановления ДНК, сообщили авторы. Серьезный удар протокола, описываемого Уилкинсон и др. 16 может быть передача ткани хвост ПЦР-пробирку. Из-за микроскопических размеров трудно обеспечить надлежащим образом собраны и поворотного закупорить плавника. Для решения этого барьера, мы разработали более протокол для генотипирования большого количества личинки живут рыбки данио рерио с почти 100% эффективность9. С помощью microscalpel, кончик плавник хвоста удаляется и помещены на кусок фильтровальной бумаги. Кусок фильтровальной бумаги, содержащий ткань можно легко визуализировать и правильно помещен в ПЦР-пробирку. Затем выполняется геномной ДНК добыча, следуют амплификации PCR региона интерес к генотип образца. Преимущества этого метода включают высокую эффективность ПЦР, низкий уровень ложных положительных и низкой смертности. Кроме того Генотипирование большого количества эмбрионов можно с помощью этого протокола. Протокол, описываемые позволяет плавник отсечения сотен личинок в течение 2-3 ч, используя этот подход и правильной идентификации генотипируемого рыбы и хвост регенерации в течение двух дней.
Protocol
Representative Results
Discussion
Джин, инструменты редактирования применялись точно ввести мутации и трансгенов в zebrafish в последние лет5,6,,78. При выполнении болезни, моделирование в данио рерио, ранних личиночных или несовершеннолетних фенотипов ча?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить редких болезней модели и сетевой механизм (RDMM) (финансируется Канадским институтов здравоохранения исследований (КНИИЗ) и геном Канада). CK поддерживается стипендия премии UROP (Университет Оттавы). DLJ поддерживается Ванье Канада Магистратура стипендии. ИАП поддерживается премию докторантура стипендий Канадского институтов здравоохранения исследований (КНИИЗ). Авторы благодарят генетики общества Америки для предоставления разрешения опубликовать этот протокол и использовать адаптация дополнительная цифра 5 от пена, и др.
Materials
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Stewart, A. M., Kalueff, A. V. Developing better and more valid animal models of brain disorders. Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).
- Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
- Bedell, V. M., et al. In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Pena, I. A., et al. Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency. Genetics. 207, 1501-1518 (2017).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, 2410 (2013).
- Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135, 249-260 (2015).
- Scheldeman, C., et al. Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).
- Zabinyakov, N., et al. Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology. PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).
- Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), (2016).
- Kawakami, K., Hopkins, N. Rapid identification of transgenic zebrafish. Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).
- Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
- Zhu, X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 4, 6420 (2014).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).
- Ewing, B., Green, P. Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 8, 175-185 (1998).
