Estrazione del DNA high-throughput e genotipizzazione delle larve di Zebrafish 3dpf di pinna Clipping
Summary
Zebrafish sono stati usati come organismi modello genetico affidabile nella ricerca biomedica, soprattutto con l’avvento delle tecnologie di modifica del gene. Quando sono previsti fenotipi larvali, identificazione di estrazione ed il genotipo di DNA può essere impegnativo. Qui, descriviamo una procedura efficiente genotipizzazione per larve di zebrafish, coda di ritaglio, più presto 72 h post-fertilizzazione.
Abstract
Zebrafish (Danio rerio) possiedono ortologhi per l’84% dei geni conosciuti per essere associati con malattie umane. Inoltre, questi animali hanno un tempo di generazione breve, sono facili da gestire, visualizzare un alto tasso riproduttivo, basso costo e sono facilmente suscettibili di manipolazioni genetiche di microiniezione di DNA negli embrioni. Gli avanzamenti recenti nel gene strumenti di editing consentono precisa introduzione di mutazioni e transgeni in zebrafish. Malattia di modellazione in zebrafish spesso porta a fenotipi larvali e morte precoce, che può essere difficile da interpretare se genotipi sono sconosciuti. Questa identificazione precoce dei genotipi è anche necessario negli esperimenti che richiedono la messa in comune di campione, come studi di gene expression o massa spettrometria. Tuttavia, vasta selezione genotipica è limitata dai metodi tradizionali, che nella maggior parte dei laboratori vengono eseguite solo su zebrafish adulto o nelle larve post mortem. Abbiamo affrontato questo problema adattando un metodo per l’isolamento di DNA genomic di PCR-pronto da larve di zebrafish live che può essere raggiunta anche prima, come la post-fecondazione 72h (hpf). Questo tempo e tecnica economica, migliorato da un protocollo di genotipizzazione precedentemente pubblicati, permette l’identificazione di genotipi da biopsie di pinna al microscopio. Le pinne rigenerano rapidamente come si sviluppano le larve. I ricercatori sono quindi in grado di selezionare e raccogliere i genotipi desiderati all’età adulta utilizzando questa procedura basata sulla PCR genotyping di alto-rendimento.
Introduction
Il danio zebrato (Danio rerio) è un organismo vertebrato ampiamente utilizzato come modello per le indagini di malattia anche per quanto riguarda il test preclinici di ipotesi terapeutiche1,2,3. Questi animali hanno un tempo di generazione breve, sono facili da gestire, visualizzare un alto tasso riproduttivo, basso costo e sono facilmente suscettibili di manipolazioni genetiche di microiniezione di DNA in embrioni4. Attraverso il crescente sviluppo del romanzo transgenico e gene editing tecnologie quali Zinc-Finger nucleasi (ZFN)5, TAL-come effettore nucleasi (TALENs)6,7e il cluster regolarmente intervallate breve Palindromo si ripete (CRISPR) / CRISPR-collegata 9 (Cas9) sistema8, zebrafish è pronta a migliorare sostanzialmente la comprensione delle diverse condizioni patologiche. Queste tecnologie sono state utilizzate per creare forature mirate in entrambi somatiche e cellule germinali in zebrafish, efficientemente nascimenti geneticamente modificati animali8. Esempi recenti nella letteratura includono lo sviluppo positivo di modelli genetici di epilessia e disturbi metabolici in zebrafish3,9,10,11,12 .
Con i progressi compiuti in zebrafish editing genomico, rapida e affidabile la genotipizzazione è diventato un innegabile punto dilimitazione. Identificazione delle specifiche mutazioni del DNA adiacente al luogo di destinazione prevista modifica del genoma è una fase essenziale del protocollo. Tradizionalmente, tecniche di genotipizzazione di ritaglio pinna sono di solito solo eseguita in zebrafish giovanile o adulta. Tuttavia, il tempo speso zebrafish sensibilizzazione all’età adulta (> 2 mesi) ritarda considerevolmente gli avanzamenti nella ricerca. In molti casi, l’età adulta non può essere realizzato a causa il Ko di geni essenziali (ad es., nella modellazione di malattia) o mutazioni con guadagno di funzione che conduce agli effetti nocivi fenotipici. Inoltre, diversi saggi richiedono la messa in comune delle larve, come estrazione RNA o metabolita e coinvolgono così l’identificazione preventiva dei genotipi, che può essere difficile quando sono disponibili solo post hoc, tecniche di genotipizzazione. Questi esempi di cui sopra evidenziano l’importanza delle tecniche di genotipizzazione larvale allo stesso tempo preciso e consentono il recupero completo e normale sviluppo delle larve. Genotipizzazione di zebrafish fase precoce non sembra attualmente essere ampiamente usato; Questo si riflette da recenti pubblicazioni dei modelli di malattia in cui larvali genotipi sono identificati tramite post mortem genotipizzazione anziché genotipizzazione prima dell’esecuzione dell’esperimento12,13,14. In questa carta, una strategia di clip pinna larvale è presentata con l’obiettivo di migliorare le procedure di genotipizzazione precedentemente stabilito.
In passato, strategie che impiegano la digestione della proteinasi K a genotipo live zebrafish larve hanno portato alla variabile della polimerasi reazione a catena (PCR) efficienza15. Anche se più recentemente pubblicato tecnica di biopsia della coda al microscopio fornito più promettenti risultati16, noi e altri gruppi non erano in grado di riprodurre l’alta efficienza e recupero di DNA segnalati dagli autori. Una grave battuta d’arresto del protocollo descritto da Wilkinson et al. 16 potrebbe essere il trasferimento del tessuto coda nella provetta PCR. Grazie alle sue dimensioni microscopiche, è difficile garantire che la pinna è stato correttamente raccolti e dispensata da pipettaggio. Per affrontare questa barriera, abbiamo sviluppato un protocollo migliore per grandi numeri di genotipizzazione di larve di zebrafish live con quasi il 100% di efficienza9. Utilizzando un microscalpel, la punta della coda pinna è rimosso e collocata su un pezzo di carta da filtro. Il pezzo di carta da filtro contenente il tessuto può essere visualizzato prontamente e correttamente inserito in un tubo PCR. Estrazione del DNA genomico viene quindi eseguita, seguita dall’amplificazione di PCR della regione di interesse al genotipo del campione. I vantaggi di questo metodo includono un alta efficienza PCR, un basso tasso di falsi positivi e un tasso di mortalità basso. Inoltre, la genotipizzazione di un gran numero di embrioni è possibile utilizzando questo protocollo. Il protocollo descritto nel presente documento consente pinna-ritaglio di centinaia di larve all’interno di 2-3 h utilizzando questo approccio e la corretta identificazione di pesce genotipizzati e rigenerazione di coda entro due giorni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gene strumenti di editing sono state impiegate per introdurre precisamente mutazioni e transgeni in zebrafish negli ultimi anni5,6,7,8. Durante la malattia di modellazione in zebrafish, primi fenotipi larvali o giovanili sono spesso osservati9,12,13,14. Il protocollo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare i rari modelli di malattia e meccanismo (RDMM) rete (finanziato da istituti canadesi di ricerca di salute (CIHR) e Genome Canada). CK è supportato da un premio di studio UROP (Università di Ottawa). DLJ è supportato da una borsa di studio di laurea Canada Vanier. IAP è supportato da un premio di postdoctoral fellowship istituti canadesi di ricerca di salute (CIHR). Gli autori ringraziano la genetica Society of America per la concessione dell’autorizzazione per pubblicare questo protocollo e utilizzare un adattamento della figura 5 supplementare da Pena, et al.
Materials
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
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