High-throughput DNA-extractie en de genotypering van 3dpf Zebrafish larven door Fin knippen
Summary
Zebravis als betrouwbare genetische modelorganismen in biomedisch onderzoek, vooral met de komst van gen-bewerken technologieën zijn gebruikt. Wanneer larvale fenotypen verwachting, kan DNA-extractie en genotype identificatie worden uitdagende. Hier beschrijven we een efficiënte genotypering procedure voor zebrafish larven, door de staart knippen, zo spoedig 72 uur na bevruchting.
Abstract
Zebrafish (Danio rerio) bezitten orthologues voor 84% van de genen geassocieerd te worden met ziekten bij de mens bekend. Bovendien, deze dieren hebben een korte generatietijd, zijn eenvoudig te verwerken, weer een reproductieve hoog, lage kosten, en zijn gemakkelijk vatbaar voor genetische manipulaties door microinjection van DNA in embryo’s. Recente vooruitgang in gen bewerkingsgereedschappen zijn precieze invoering van mutaties en transgenen in zebrafish inschakelen. Ziekte modelleren in zebrafish vaak leidt tot larvale fenotypes en vroege dood die kan lastig zijn om te interpreteren als genotypen onbekend zijn. Deze vroege identificatie van genotypen is ook nodig in experimenten waarbij monster bundelen, zoals gen expressie of massa spectrometrie studies. Uitgebreide genotypische screening wordt echter beperkt door traditionele methoden, die in de meeste laboratoria alleen op volwassen zebrafish of in postmortem larven worden uitgevoerd. We hebben behandeld dit probleem door aanpassing van een methode voor de isolatie van de genomic DNA PCR-klaar uit levende zebrafish larven die zo spoedig 72 h na bevruchting (hpf) kan worden bereikt. Deze tijd en de rendabele techniek, verbeterd ten opzichte van een eerder gepubliceerde genotypering-protocol, kunt de identificatie van genotypen van microscopische fin biopsieën. De vinnen regenereren snel naarmate de larven zich ontwikkelen. Onderzoekers kunnen vervolgens te selecteren en de gewenste genotypen naar volwassenheid verhogen door gebruik te maken van deze high-throughput genotypering PCR-gebaseerde procedure.
Introduction
De zebravis (Danio rerio) is een gewervelde organisme gebruikte als een model voor onderzoek van de ziekte zo goed als voor preklinische testen van therapeutische hypothesen1,2,3. Deze dieren hebben een korte generatietijd, zijn eenvoudig te verwerken, weer een reproductieve hoog, lage kosten, en zijn gemakkelijk vatbaar voor genetische manipulaties door microinjection van DNA in embryo’s4. Door de toenemende ontwikkeling van transgene roman en gene technologieën zoals zink-vinger nucleasen (ZFN)5TAL-achtige Effector nucleasen (TALENs)6,7en de geclusterde regelmatig Interspaced korte bewerken Palindromische herhaalt (CRISPR) / CRISPR-geassocieerde 9 (Cas9) systeem8, de zebravis is klaar om een aanzienlijke verbetering van het inzicht van verscheidene pathologische voorwaarden. Deze technologieën zijn gebruikt voor het maken van gerichte uitsparingen in zowel somatische en germline cellen in zebrafish, efficiënt teweegbrengt genetisch gemodificeerde dieren8. Recente voorbeelden in de literatuur zijn de succesvolle ontwikkeling van genetische modellen van epilepsie en metabole aandoeningen in zebrafish3,9,10,11,12 .
Met de vooruitgang die is geboekt in de zebravis genoom bewerken, snelle en betrouwbare genotypering uitgegroeid tot een onmiskenbare snelheidslimieten stap. Identificatie van specifieke DNA-mutaties, grenzend aan de voorspelde genoom-bewerken doelsite is een essentiële fase van het protocol. Traditioneel zijn genotypering technieken door fin knippen meestal alleen uitgevoerd in jonge of volwassen zebrafish. Echter, de tijd doorgebracht verhogen zebrafish naar volwassenheid (> 2 maanden) vertragingen aanzienlijk vooruitgang in onderzoek. In veel gevallen zijn volwassenheid niet haalbaar als gevolg van het knockout van essentiële genen (bijvoorbeeld in ziekte modellering) of winst-van-functie mutaties leidt tot fenotypische schadelijk. Bovendien verschillende tests vereisen bundeling van larven, zoals de extractie van RNA of metaboliet, en dus het betrekken van eerdere behoefteanalyses van de genotypes, die kan lastig zijn wanneer slechts post hoc genotypering technieken beschikbaar zijn. Deze bovengenoemde voorbeelden wijzen op het belang van larvale genotypering technieken die tegelijkertijd nauwkeurig en volledig herstel en normale ontwikkeling van het larven inschakelen. Vroege fase zebrafish genotypering momenteel niet op grote schaal worden gebruikt; Dit wordt weerspiegeld door recente publicaties van ziekte modellen waarin larvale genotypen zijn geïdentificeerd met behulp van post mortem genotypering in plaats van genotypering voorafgaande aan de uitvoering van het experiment12,13,14. In deze paper wordt een larvale fin clip strategie gepresenteerd ter verbetering van tevoren vastgelegde genotypering procedures.
In het verleden leven strategieën dienst proteïnase K spijsvertering aan genotype zebrafish larven hebben geleid tot variabele polymerase kettingreactie (PCR) efficiëntie15. Hoewel een meer onlangs gepubliceerd microscopische staart biopsie techniek verstrekt meer belovende resultaten16, waren wij en andere groepen niet in staat om de hoge efficiëntie en DNA herstel gemeld door de auteurs te reproduceren. Een grote tegenslag voor het protocol beschreven door Wilkinson et al. 16 zou de overdracht van het weefsel van de staart aan de PCR-buis. Als gevolg van de microscopische grootte is het moeilijk om ervoor te zorgen dat de fin is behoorlijk opgehaald en afgeleverd door pipetteren. Om deze barrière, hebben we een verbeterde protocol voor genotypering grote aantallen levende zebrafish larven met bijna 100% rendement9ontwikkeld. Met behulp van een microscalpel, is het puntje van de staart van de fin verwijderd en op een stuk papier van de filter geplaatst. Het stuk filtreerpapier met het weefsel kan worden gemakkelijk gevisualiseerd en correct geplaatst in een PCR-buis. Genomic DNA-extractie wordt vervolgens uitgevoerd, gevolgd door PCR versterking van de regio van belang naar genotype het model. De voordelen van deze methode zijn een hoog rendement van PCR, een laag valse positieve tarief en een laag sterftecijfer. Bovendien is genotypering van grote aantallen embryo’s mogelijk met behulp van dit protocol. Het protocol hierin beschreven kunt fin-knippen van honderden larven binnen 2-3 uur met behulp van deze aanpak en een correcte identificatie van gegenotypeerde vis en staart regeneratie binnen twee dagen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gen het uitgeven hulpmiddelen hebben gewerkt om juist mutaties en transgenen in zebrafish in de afgelopen jaren5,,6,,7,8. Bij het uitvoeren van ziekte modelleren in zebrafish, zijn vroege larvale of juveniele fenotypen vaak waargenomen9,12,13,14. Het hier gepresenteer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank de zeldzame ziekte modellen en mechanisme (RDMM) Network (gefinancierd door de Canadese instituten van gezondheid onderzoek (CIHR) en het genoom Canada). CK wordt ondersteund door een UROP scholarship award (Universiteit van Ottawa). DLJ wordt ondersteund door een Vanier Canada Graduate beurs. IAP wordt ondersteund door een Canadese instituten van gezondheid onderzoek (CIHR) postdoctoral fellowship award. De auteurs bedanken de Genetics Society of America voor het verlenen van toestemming voor publiceren van dit protocol en het gebruiken van een aanpassing van de aanvullende figuur 5 van Pena, et al..
Materials
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Stewart, A. M., Kalueff, A. V. Developing better and more valid animal models of brain disorders. Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).
- Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
- Bedell, V. M., et al. In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Pena, I. A., et al. Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency. Genetics. 207, 1501-1518 (2017).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, 2410 (2013).
- Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135, 249-260 (2015).
- Scheldeman, C., et al. Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).
- Zabinyakov, N., et al. Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology. PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).
- Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), (2016).
- Kawakami, K., Hopkins, N. Rapid identification of transgenic zebrafish. Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).
- Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
- Zhu, X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 4, 6420 (2014).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).
- Ewing, B., Green, P. Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 8, 175-185 (1998).
