מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין
Summary
דג זברה שימשו מודל גנטי אמין האורגניזמים במחקר ביו-רפואי, במיוחד עם כניסתו של טכנולוגיות לעריכת ג’ין. כאשר הזחל פנוטיפים צפויים, זיהוי ה-DNA החילוץ, גנוטיפ יכול להיות מאתגר. כאן, אנו מתארים הליך genotyping יעיל עבור הזחלים דג זברה, מאת הזנב מסיכה, מוקדם ככל 72-h שלאחר ההפריה.
Abstract
דג זברה (רזבורה rerio) בעלי orthologues 84% של הגנים הידועים להיות מזוהה עם מחלות אנושיות. בנוסף, בעלי חיים אלה יש זמן דור קצר, קל לטפל, להציג שיעור הרבייה גבוה, בעלות נמוכה, ואת נתונות בקלות שינויים גנטיים על-ידי microinjection של ה-DNA של העוברים. התפתחויות אחרונות ג’ין כלי עריכה מפעיל את הקדמה מדויק של מוטציות, transgenes של דג זברה. מחלת דוגמנות בשנת דג זברה לעיתים קרובות מוביל פנוטיפים זחל ומוות מוקדם, אשר עשויה להיות מאתגרת לפרש אם אחרים אינם ידועים. זה זיהוי מוקדם של אחרים הוא גם הצורך בניסויים הדורשים מדגם איגום, כגון גנים ביטוי או מסה ספקטרומטר מחקרים. עם זאת, ההקרנה נרחב genotypic מוגבל באמצעות שיטות מסורתיות, אשר במעבדות רוב מבוצעות רק על דג זברה למבוגרים או הזחלים לאחר המוות. אנחנו פתרנו בעיה זו על ידי התאמת שיטת הבידוד של DNA גנומי מוכן-PCR הזחלים חיים דג זברה ניתן להשיג מוקדם ככל 72 h שלאחר ההפריה (hpf). הזמן הזה, טכניקה חסכונית, השתפרו מפרוטוקול genotyping שפורסמו בעבר, מאפשר זיהוי אחרים מן מיקרוסקופיים פין. ביופסיות. הסנפירים במהירות להתחדש כאשר הזחלים מתפתחים. חוקרים יכולים ואז בחר ולגדל את אחרים הרצוי לבגרות על ידי ניצול זה תפוקה גבוהה הליך genotyping מבוססי ה-PCR.
Introduction
דג זברה (רזבורה rerio) הוא יצור חוליות בשימוש נרחב כמודל לחקירה המחלה, כמו גם לגבי בדיקות פרה של השערות טיפולית-1,–2,–3. בעלי חיים אלה יש זמן דור קצר, קל לטפל, להציג שיעור הרבייה גבוה, בעלות נמוכה, ולא נתונות בקלות שינויים גנטיים על-ידי microinjection של ה-DNA עוברי4. דרך ההתפתחות הגוברת של הרומן הטרנסגניים וג’ין עריכה טכנולוגיות כגון אבץ-אצבע nucleases (ZFN)5,6,Nucleases אפקטור כמו טל (TALENs)7, וקצר את מקובצים באופן קבוע Interspaced Palindromic חוזר (CRISPR) / CRISPR-הקשורים 9 (Cas9) מערכת8, דג זברה צפוי באופן משמעותי לשפר את ההבנה של מספר תנאים פיפטות. טכנולוגיות אלה שימשו כדי ליצור כיסויים ממוקד בשני סומאטית ולשנות germline בתאים דג זברה, ביעילות מחורזות גנטית בעלי חיים8. הדוגמאות האחרונות בספרות כוללות פיתוח מוצלח של דגמים גנטיים של אפילפסיה, הפרעות מטבוליות דג זברה3,9,10,11,12 .
עם ההתקדמות בעריכת הגנום דג זברה, מהיר ואמין genotyping הפך צעד הגבלת קצב מוטל בספק. זיהוי מוטציות DNA ספציפיים סמוכים לאתר החזוי לעריכת הגנום היעד היא שלב חיוני של הפרוטוקול. באופן מסורתי, טכניקות genotyping מאת פין מסיכה בדרך כלל רק שבוצעו בנער או מבוגר דג זברה. עם זאת, הזמן בילה דג זברה העלאת לבגרות (> 2 חודשים) מעכב במידה ניכרת התקדמות במחקר. במקרים רבים, לבגרות אינה יכולה להיות מושגת בשל הסתרה באמצעות גנים חיוניים (למשל, בדוגמנות מחלה) או רווח-של-פונקציה מוטציות שמוביל פנוטיפי השפעות מזיקות. בנוסף, מספר מבחני דורשים איגום של הזחלים, כגון ה-RNA או מטבוליט החילוץ, ולערב ובכך זיהוי מראש של אחרים, אשר עשויה להיות מאתגרת כאשר רק פוסט הוק genotyping טכניקות זמינים. את הדוגמאות הנ ל מדגישים את החשיבות של טכניקות genotyping זחל אשר נמצאים באותו זמן מדויק ולאפשר החלמה מלאה, התפתחות תקינה של הזחלים. Genotyping דג זברה בשלב מוקדם לא מופיע כעת כדי להיות בשימוש נרחב; זה משתקף על ידי פרסומים אחרונים של מודלים מחלה שבה הזחל אחרים מזוהים באמצעות פוסט-מורטם genotyping ולא genotyping לפני ביצוע הניסוי12,13,14. בנייר זה, אסטרטגיה קליפ פין זחל מוצגת במטרה לייעל את ההליכים genotyping שנוצרו קודם לכן.
בעבר, אסטרטגיות העסקת מערכת העיכול proteinase K גנוטיפ חיים דג זברה הזחלים הובילו פולימראז משתנה-תגובת שרשרת (PCR)-יעילות-15. למרות יותר שפורסם לאחרונה טכניקה ביופסיה הזנב מיקרוסקופיים סיפק תוצאות מבטיחות יותר16, אנחנו וארגונים אחרים לא היו מסוגלים להפיק את נצילות גבוהה והתאוששות DNA שדווחו על-ידי המחברים. עיכוב העיקריים של פרוטוקול מתוארת על ידי ווילקינסון. et al. 16 יכול להיות ההעברה של הרקמה זנב אל הצינור ה-PCR. בשל גודלו מיקרוסקופיים, קשה להבטיח הנוסח היה כראוי שנאספו על ידי pipetting. כדי לטפל מחסום זה, פיתחנו פרוטוקול משופרת עבור מספרים גדולים genotyping של הזחלים חיים דג זברה עם כמעט 100% יעילות9. שימוש של microscalpel, קצה הזנב סנפיר הוסר, להציב על גבי פיסת נייר סינון. פיסת נייר סינון המכיל את הרקמה יכול להיות בקלות דמיינו והניח כהלכה לתוך צינור ה-PCR. הפקת דנ א גנומי מתבצע לאחר מכן, ואחריו PCR הגברה של האזור בעל עניין עד גנוטיפ הדגימה. היתרונות של שיטה זו כוללים PCR יעילות גבוהה, קצב נמוך חיובי כוזב, התמותה נמוכה. בנוסף, genotyping מספר גדול של עוברי אפשרי באמצעות פרוטוקול זה. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מאפשר סנפיר-מסיכה של מאות הזחלים בתוך 2-3 h באמצעות גישה זו ועל זיהוי נכון של דגים genotyped והתחדשות הזנב בתוך יומיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ג’ין כלי עריכה יש כבר מועסקים בדיוק להציג מוטציות, transgenes של דג זברה האחרונות שנים5,6,7,8. בעת ביצוע המחלה דוגמנות בשנת דג זברה, פנוטיפים זחל או ילדותי המוקדמות הם נצפו לעתים קרובות9,12,<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות מודלים מחלה נדירה ורשת מנגנון (RDMM) (במימון את קנדי מוסדות של הבריאות מחקר (CIHR) ואת הגנום קנדה). CK נתמכת על ידי פרס מלגת UROP (מאוניברסיטת אוטווה). DLJ נתמך על ידי מלגה לתואר שני של קנדה וניהר. חוג ידידי הפקולטה נתמכת על ידי פרס בתר קנדי מוסדות של הבריאות מחקר (CIHR). המחברים תודה על גנטיקה החברה של אמריקה למתן הרשאה לפרסם פרוטוקול זה וכדי להשתמש עיבוד של 5 איור משלים מ פנה, ואח.
Materials
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Stewart, A. M., Kalueff, A. V. Developing better and more valid animal models of brain disorders. Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).
- Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
- Bedell, V. M., et al. In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Pena, I. A., et al. Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency. Genetics. 207, 1501-1518 (2017).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, 2410 (2013).
- Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135, 249-260 (2015).
- Scheldeman, C., et al. Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).
- Zabinyakov, N., et al. Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology. PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).
- Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), (2016).
- Kawakami, K., Hopkins, N. Rapid identification of transgenic zebrafish. Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).
- Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
- Zhu, X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 4, 6420 (2014).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).
- Ewing, B., Green, P. Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 8, 175-185 (1998).
