Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme
Summary
Zebra balığı güvenilir genetik canlılar arasında gen düzenleme teknolojileri advent ile özellikle Biyomedikal araştırma olarak kullanılmıştır. Larva fenotipleri bekleniyor, DNA ekstraksiyon ve genotip kimlik zor olabilir. Burada, biz bir verimli Genotipleme zebra balığı larva için kuyruk, 72-h sonrası döllenme gibi erken kırpma tarafından açıklayınız.
Abstract
Zebra balığı (Danio rerio) insan hastalıkları ile ilişkili olduğu bilinen genlerin % 84 için orthologues sahip. Buna ek olarak, bu hayvanlar bir kısa oluşturma süresi var, kolay işlemek, yüksek bir üreme oranı, düşük maliyetli, görüntülemek ve embriyo içinde DNA’ın mikroenjeksiyon tarafından genetik manipülasyonlar kolayca mükellef bulunmaktadır. Son gelişmeler düzenleme araçları gen mutasyonlar ve zebra balığı transgenes kesin giriş etkinleştirme. Hastalık içinde zebra balığı kez modelleme larva fenotipleri ve genotip bilinmeyen varsa yorumlamak zor olabilir erken ölüme yol açar. Bu erken genotip Ayrıca tanımlamasıdır örnek havuzu gerektiren deneylerde gerekli, gen ifade veya kütle spektrometresi çalışmaları gibi. Ancak, geniş genotypic tarama çoğu labs sadece yetişkin zebra balığı ya da öldükten sonra larva gerçekleştirilen geleneksel yöntemler ile sınırlıdır. Biz bu sorunu bir yöntem gibi erken 72 h sonrası döllenme (hpf) elde edilebilir canlı zebra balığı larva PCR-hazır genomik DNA izolasyonu için adapte tarafından ele. Bu zaman ve maliyet-etkin tekniği, daha önce yayımlanmış Genotipleme Protokolü geliştirilmiş sağlar genotip mikroskobik fin biyopsi üzerinden tanımlaması. Larvalar geliştirdikçe yüzgeçleri hızlı bir şekilde yeniden. Araştırmacılar daha sonra seçin ve istenen genotip yetişkinliğe bu yüksek-den geçerek PCR tabanlı Genotipleme yordamı kullanarak yetiştirmek edebiliyoruz.
Introduction
Zebra balığı (Danio rerio) yaygın preklinik tedavi hipotezler1,2,3test gelince de hastalık soruşturma için bir model olarak kullanılan omurgalı bir organizma. Bu hayvanlar kısa oluşturma süresi var, kolay işlemek, yüksek bir üreme oranı, düşük maliyetli, görüntülemek ve DNA’ın mikroenjeksiyon embriyo4tarafından genetik manipülasyonlar kolayca mükellef bulunmaktadır. Teknolojik öyle aynı derecede çinko-parmak enzimler (ZFN)5, TAL benzeri efektör enzimler (TALENs)6,7ve kümelenmiş düzenli olarak Interspaced kısa roman transgenik ve gen artan geliştirilmesi yoluyla düzenleme Palindromik yineler (CRISPR) / CRISPR ilişkili 9 (Cas9) sistem8, zebra balığı önemli ölçüde birkaç patolojik koşulları anlayış geliştirmek için hazırlanıyor. Hedeflenen renkleri çakıştırma hem de somatik oluşturmak için kullanılan bu teknolojiler ve verimli bir şekilde genetik olarak duyumsatan zebra balığı, hücrelerde germline hayvanlar8değiştirilebilir. Son literatürde epilepsi ve metabolik bozukluklar genetik modellerini başarılı gelişimi zebra balığı3,9,10,11‘,12 örnekler .
Zebra balığı genom düzenleme içinde ilerleme ile hızlı ve güvenilir Genotipleme yadsınamaz bir hızı sınırlaması adım haline gelmiştir. Belirli DNA mutasyonları öngörülen genom düzenleme hedef siteye bitişik tanımlaması Protokolü’nün önemli bir aşamadır. Geleneksel olarak, Genotipleme fin kırpma tarafından genellikle sadece içinde gerçekleştirilen çocuk ya da yetişkin zebra balığı tekniklerdir. Ancak, harcanan zaman yetişkinliğe yükselterek zebra balığı (> 2 ay) önemli ölçüde araştırma gelişmeler geciktirir. Birçok durumda, yetişkinlik gerekli genler (Örneğin, hastalık modelleme) veya zararlı fenotipik etkileri için önde gelen işlev kazanç mutasyonlar nakavt nedeniyle elde edilemez. Ayrıca, çeşitli deneyleri larva, RNA veya metaboliti ayıklama gibi havuzu gerektirir ve böylece sadece post hoc Genotipleme teknikleri kullanılabilir olduğunda hangi zor olabilir genotip, önceden tanımlanması dahil. Söz konusu bu örnekler aynı zamanda hassas ve tam kurtarma ve larvalar normal gelişimini olanaklı kılmak larva Genotipleme teknikleri önemini vurgulayın. Erken sahne zebra balığı Genotipleme Şu anda yaygın olarak kullanılan görünmüyor; Bu hastalık modelleri larva genotip Genotipleme çalıştırmadan önce deneme12,13,14yerine öldükten sonra Genotipleme üzerinden tespit edilir son yayınlar yansıtır. Bu yazıda, daha önce kurulan Genotipleme yordamlar geliştirmek amaçlayan bir larva fin küçük strateji sunulur.
Geçmişte, İndinavir K sindirim genotip için istihdam stratejileri larva değişken polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) verimlilik15‘ e açmıştır zebra balığı yaşamak. Daha son zamanlarda mikroskobik kuyruk biyopsi tekniği daha umut verici sonuçları16sağlanan yayınlanan rağmen biz ve diğer grupları yüksek verimlilik ve yazarlar tarafından bildirilen DNA kurtarma çoğaltmak mümkün değildi. Wilkinson ve ark. tarafından açıklanan Protokolü’nün büyük bir başarısızlık 16 kuyruk doku transferi PCR tüp için olabilir. Mikroskobik onun büyüklüğü nedeniyle, fin düzgün toplanan ve pipetting tarafından reçete emin olmak zordur. Bu bariyer adrese, Genotipleme canlı zebra balığı larvaları yaklaşık % 100 verim9ile çok sayıda için geliştirilmiş bir protokol geliştirdik. Bir microscalpel kullanarak, fin kuyruk ucu kaldırılır ve bir filtre kağıt parçası yerleştirilir. Filtre kağıt dokusu içeren kolayca görselleştirildiği ve doğru bir PCR tüp içine yerleştirilir. Genomik DNA ekstraksiyon ardından, genotip örnek ilgi bölgesinin PCR güçlendirme tarafından takip gerçekleştirilir. Bu yöntemin avantajları, yüksek bir PCR verim, düşük bir yanlış pozitif oranı ve düşük ölüm oranı içerir. Ayrıca, çok sayıda embriyo Genotipleme bu iletişim kuralını kullanan mümkündür. Burada açıklanan protokol fin-kırpma, larva bu yaklaşım ve genotyped balık ve kuyruk rejenerasyon iki gün içinde doğru kimlik kullanarak 2-3 saat içinde yüzlerce sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Son mutasyonlar ve zebra balığı transgenes tam olarak tanıtmak istihdam düzenleme araçları Gene yıl5,6,7,8. Zebra balığı içinde modelleme hastalığı gerçekleştirirken, erken larva veya Juvenil fenotipleri9,12,13,14kez gözlenir. Burada sunulan Protokol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar nadir hastalık modelleri ve mekanizması (RDMM) ağ (in arayan Sağlık Kanada Enstitüleri araştırma (CIHR) ve genom Kanada tarafından finanse edilir) teşekkür etmek istiyorum. CK UROP burs ödülü (University of Ottawa) tarafından desteklenir. DLJ Vanier Kanada Yüksek Lisans Burs tarafından desteklenir. IAP, arayan Sağlık Kanada Enstitüleri araştırma (CIHR) doktora sonrası bursu ödülü tarafından desteklenir. Yazarlar genetik Society of izin verme için America tamamlayıcı Şekil 5 Pena, üzerinden bir uyarlaması kullanılacak ve bu protokol yayımlamak için teşekkür ederiz ve ark.
Materials
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Stewart, A. M., Kalueff, A. V. Developing better and more valid animal models of brain disorders. Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).
- Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
- Bedell, V. M., et al. In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Pena, I. A., et al. Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency. Genetics. 207, 1501-1518 (2017).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, 2410 (2013).
- Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135, 249-260 (2015).
- Scheldeman, C., et al. Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).
- Zabinyakov, N., et al. Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology. PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).
- Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), (2016).
- Kawakami, K., Hopkins, N. Rapid identification of transgenic zebrafish. Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).
- Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
- Zhu, X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 4, 6420 (2014).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).
- Ewing, B., Green, P. Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 8, 175-185 (1998).
