Extraction d’ADN de haut débit et le génotypage des larves de poisson zèbre 3dpf de découpage Fin
Summary
Poisson zèbre ont été utilisés comme des organismes modèle génétique fiable dans la recherche biomédicale, en particulier avec l’avènement des techniques de modification génétique. Lorsque les larves phénotypes sont supposés, identification de l’ADN d’extraction et de génotype peut être difficile. Ici, nous décrivons une procédure efficace de génotypage pour les larves de poisson zèbre, par coupure de queue, dès 72 h après la fécondation.
Abstract
Poisson zèbre (Danio rerio) possèdent des orthologues pour 84 % des gènes connus pour être associés à des maladies humaines. En outre, ces animaux ont un temps de génération court, facile à manipuler, afficher un taux de reproduction élevé, faible coût et se prêtent facilement à des manipulations génétiques par microinjection de DNA dans les embryons. Les progrès récents en gène outils d’édition permettent introduction précise de mutations et de transgènes chez le poisson zèbre. Maladie chez le poisson zèbre de modélisation souvent conduit à des phénotypes larvaires et mort prématurée qui peut être difficile à interpréter si génotypes ne sont pas connus. Cette identification précoce des génotypes est également nécessaire dans les expériences nécessitant une mise en commun par exemple, comme gene expression ou masse spectrométrie études. Cependant, une vaste dépistage génotypique est limitée par des méthodes traditionnelles, qui, dans la plupart des laboratoires sont effectuées uniquement sur le poisson-zèbre adulte ou chez les larves post-mortem. Nous avons abordé ce problème en adaptant une méthode d’isolement de l’ADN génomique PCR-prêt de larves de poisson zèbre direct qui peut être réalisé dès la fécondation après 72 h (hpf). Cette fois et une technique rentable, améliorée, passant d’un protocole de génotypage publiées antérieurement, permet l’identification des génotypes de biopsies de nageoire microscopiques. Les ailettes de régénèrent rapidement, car les larves se développent. Les chercheurs sont ensuite en mesure de sélectionner et élever les génotypes désirées à l’âge adulte en utilisant cet procédure de génotypage basées sur la PCR haut-débit.
Introduction
Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un organisme vertébré largement utilisé comme modèle pour l’enquête de la maladie ainsi que pour les essais précliniques d’hypothèses thérapeutiques1,2,3. Ces animaux ont un temps de génération court, facile à manipuler, afficher un taux de reproduction élevé, faible coût et se prêtent facilement à des manipulations génétiques par microinjection de DNA dans des embryons de4. Par le développement croissant du roman transgénique et gène édition des technologies telles que les doigts de Zinc nucléases (ZFN)5, TAL-comme effecteur nucléases (TAPS)6,7et le cluster régulièrement entrecoupées court Palindromique répète (CRISPR) / associée à CRISPR 9 (Cas9) système8, le poisson-zèbre est prête à améliorer considérablement la compréhension de plusieurs conditions pathologiques. Ces technologies ont été utilisées pour créer débouchures ciblées à la fois somatique et cellules germinales chez le poisson zèbre, efficacement engendering génétiquement modifiés animaux8. Des exemples récents dans la littérature notamment la mise au point de modèles génétiques d’épilepsie et de troubles métaboliques dans le poisson-zèbre3,9,10,11,12 .
Avec les progrès réalisés dans l’édition de génome du poisson-zèbre, rapide et fiable de génotypage est devenu une étape limitante indéniable. Identification des mutations de l’ADN spécifiques adjacentes au site de cible prédit édition de génome est une étape essentielle du protocole. Traditionnellement, techniques de génotypage par découpage fin sont généralement seulement joué dans zebrafish juvénile ou adulte. Cependant, le temps passé à élever poisson zèbre à l’âge adulte (> 2 mois) retarde considérablement les progrès dans la recherche. Dans de nombreux cas, l’âge adulte ne peut être atteint en raison de l’élimination directe des gènes essentiels (par exemple, dans la modélisation de la maladie) ou gain de fonction mutations entraînant des effets phénotypiques préjudiciables. En outre, plusieurs essais nécessitent la mise en commun des larves, comme dans l’extraction de l’ARN ou de métabolite et impliquent donc une identification préalable des génotypes, qui peut être difficile quand un seul post hoc des techniques de génotypage sont disponibles. Ces exemples susmentionnés mettent en évidence l’importance des techniques de génotypage larves qui sont à la fois précise et permettre la récupération complète et un développement normal des larves. Génotypage de poisson-zèbre stade précoce ne semble pas actuellement être largement utilisé ; Ceci se matérialise par des publications récentes de modèles de maladies dans lequel larvaires génotypes sont identifiés par génotypage post-mortem plutôt que le génotypage avant l’exécution de l’expérience12,13,14. Dans cet article, une stratégie de clip de nageoire larvaire est présentée afin d’améliorer les procédures préétablies de génotypage.
Dans le passé, stratégies employant la digestion de la protéinase K au génotype vivent zebrafish larves ont conduit à la variable polymerase chain reaction (PCR) efficacité15. Bien que plus récemment publié technique de biopsie de queue microscopique fourni plus prometteurs résultats16, nous et les autres groupes n’étaient pas en mesure de reproduire le rendement élevé et la récupération de l’ADN par les auteurs. Un revers majeur du protocole décrit par Wilkinson et al. 16 pourrait être le transfert du tissu queue au tube PCR. En raison de sa taille microscopique, il est difficile de s’assurer que la nageoire a été correctement recueillie et distribuée par pipetage. Pour remédier à cet obstacle, nous avons développé un protocole amélioré pour un grand nombre de génotypage des larves de poisson zèbre direct avec près de 100 % d’efficacité9. À l’aide d’un microscalpel, l’extrémité de la queue de la nageoire est enlevée et placée sur un morceau de papier filtre. Le morceau de papier filtre contenant le tissu peut être facilement visualisé et correctement placé dans un tube PCR. Extraction de l’ADN génomique est ensuite effectuée, suivie par amplification par PCR de la région d’intérêt au génotype du spécimen. Les avantages de cette méthode incluent une haute efficacité PCR, un faible taux de faux positifs et un faible taux de mortalité. En outre, le génotypage d’un grand nombre d’embryons est possible en utilisant ce protocole. Le protocole décrit ci-après permet de nageoire-découpage des centaines de larves dans les 2-3 h à l’aide de cette approche et l’identification correcte des poissons génotypés et régénération de la queue dans les deux jours.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gène des outils d’édition ont été utilisées pour introduire précisément les mutations et les transgènes chez le poisson zèbre au cours des dernières années5,6,7,8. Lorsque vous effectuez la maladie chez le poisson zèbre de modélisation, des phénotypes larvaires ou juvéniles précoces sont souvent aperçus9,12,</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient remercier le réseau de mécanisme (RDMM) (financée par les instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) et Génome Canada) et les modèles de maladies rares. CK est soutenu par une bourse de t (Université d’Ottawa). DLJ est soutenu par une bourse d’études supérieures du Canada Vanier. IAP est soutenu par une bourse postdoctorale d’instituts de recherche en santé du Canada (IRSC). Les auteurs remercient la Genetics Society of America pour l’octroi de l’autorisation de publier le présent protocole et d’utiliser une adaptation de la Figure 5 supplémentaire de Pena, et al.
Materials
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
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