هندسة الجينوم كريسبر-Cas9-تعتمد لتوليد نماذج مراسل جوركات للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 مع مواقع مختارة من التكامل بروفيرال
Summary
نقدم جينوم سير عمل الهندسي لتوليد نماذج جديدة في المختبر للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 أن الخص التكامل بروفيرال في مواقع مختارة الجينوم. استهداف الصحفيين المستمدة من فيروس نقص المناعة البشرية يسهل التلاعب جينوم كريسبر-Cas9-بوساطة، والمعينة للموقع. يتم توفير بروتوكولات مفصلة لتوليد استنساخ الخلايا المفردة والفحص والتحقق الاستهداف الصحيح.
Abstract
فيروس نقص المناعة البشرية (فيروس الإيدز) يدمج الحمض النووي بروفيرال غير عشوائي في جينوم الخلية المضيفة في مواقع المتكررة، والنقاط الساخنة الجينوم. هنا نقدم بروتوكول مفصل لتوليد نماذج في المختبر رواية للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية مع مواقع التكامل الجينوم الذي تم اختياره باستخدام الجينوم كريسبر-Cas9-تعتمد تكنولوجيا الهندسة. مع هذا الأسلوب، تسلسل مراسل الاختيار يمكن إدماج محور الجينوم المستهدف، والذي تم اختياره، تعكس مواقع التكامل ذات الصلة سريرياً.
ويرد في البروتوكول، تصميم مراسل المستمدة من فيروس نقص المناعة البشرية واختيار الهدف تسلسل الموقع وجرنة. ناقل استهداف مع الأسلحة التماثل التي شيدت وترانسفيكتيد في خلايا تي جوركات. التسلسل مراسل يستهدفها إلى موقع جينومي المحدد جزئ مثلى سهلت من كسر مزدوج-حبلا بوساطة Cas9 في الموقع المستهدف. استنساخ الخلايا المفردة التي تم إنشاؤها وفرزهم لاستهداف الأحداث بالتدفق الخلوي وبكر. ثم يتم توسيع استنساخ المحدد، واستهداف الصحيح يمكن التحقق منه ببكر وتسلسلها والنشاف جنوبي. ويتم تحليل الأحداث المحتملة خارج الهدف من هندسة الجينوم كريسبر-Cas9-بوساطة.
باستخدام هذا البروتوكول، ونظم الثقافة الخلية رواية يمكن أن تتولد أن الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية النموذجي في المواقع ذات الصلة سريرياً التكامل. ورغم أن توليد استنساخ الخلايا المفردة، والتحقق من تكامل التسلسل الصحيح مراسل مضيعة للوقت، خطوط الاستنساخ الناتجة أدوات قوية لتحليل وظيفيا اختيار موقع التكامل بروفيرال.
Introduction
إدماج الحمض النووي بروفيرال في جينوم مضيف عند الإصابة خطوة حاسمة في دورة حياة فيروس نقص المناعة البشرية (HIV). وبعد الاندماج، استمرت فيروس نقص المناعة البشرية بوضع الكمون في خلايا CD4 + “تي” خلية فرعية المعمرة مثل خلايا CD4 + T الذاكرة. إدماج فيروس نقص المناعة البشرية، على ما يبدو، غير عشوائية1،2. تم الكشف عن عدد من النقاط الساخنة الجينوم مع الحمض النووي بروفيرال المتكاملة متكرر في عدة دراسات عن طريق تسلسل مواقع التكامل في الأفراد المصابين حادة ومزمنة2،،من34 ،،من56،،من78. من المثير للاهتمام، في بعض من هذه المواقع التكامل، تم الكشف عن المكان نفسه في جزء كبير من الخلايا المصابة، مما يؤدي إلى فكرة أن التكامل في المواقع المتكررة قد تؤثر تأثيراً إيجابيا على التوسع في الاستنساخ1.
المضي قدما في فهمنا لأهمية مواقع التكامل المتكررة، يجب استكشاف خيار التكامل بروفيرال الموقع. ومع ذلك، العديد من الجوانب التقنية تعيق دراسة إدماج فيروس نقص المناعة البشرية الموقع الاختيار والعواقب. تستخدم على نطاق واسع نماذج ثقافة الخلية لزمن انتقال فيروس نقص المناعة البشرية مثل خطوط الخلايا جلات لا تعكس التكامل المتكررة ذات الصلة سريرياً مواقع9. دراسات على الخلايا الأولية المستمدة من المريض، من ناحية، تمكين وصف للتكامل الموقع المشهد بالتسلسل ولكن لا تسمح للتحليلات الفنية. على حد علمنا، يتوفر لا نموذج تجريبي كافية لتحليل المواقع المختارة ذات الصلة سريرياً الاندماج وظيفيا.
نقدم هنا سير عمل مفصلة لإنشاء نماذج جديدة بعدوى فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام تكنولوجيا الجينوم كريسبر-Cas9-تعتمد الهندسة. يمكن استخدام سير العمل الموضحة هنا لإنشاء خطوط الخلايا المشتقة من الخلايا T مراسل أن نموذج الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، تحمل مراسل بروفيرال جينوميكالي متكاملة في موقع تكامل الذي تم اختياره. وهكذا يقضون كأدوات جديدة لاستكشاف كيف يمكن أن تؤثر موقع التكامل بروفيرال بيولوجيا فيروس نقص المناعة البشرية، وكيف بروفيروس يستجيب لاستراتيجيات علاجية مختلفة (مثل، إيندوسيبيليتي بعكس وكلاء الكمون). يستخدم أسلوب لدينا مزايا هندسة الجينوم كريسبر-Cas9-تعتمد، في أي اندماج المراسل يسر تسلسل من جزئ مثلى فاصل مزدوج-حبلا المستحثة نوكلاس Cas9 في الموقع المستهدف. ويتم اختيار المواقع المستهدفة للاندماج وفقا لقربها من مواقع وصف التكامل المتكررة من الدراسات المتعلقة بالأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية، ووجود زخارف بام مناسبة للهندسة Cas9 بوساطة الجينوم.
في نتائج مثالية، وركزنا على موضع الجينات BACH2، أي رموز للجهة النسخي BTB والتماثل باستخدام الحاسب الآلي 2. في الأفراد المصابين بأمراض مزمنة على العلاج المضاد للفيروسات الرجعية، BACH2 واحد من المكاني عرض تخصيب المتكاملة فيروس نقص المناعة البشرية-1 تسلسل3،6،7،،من810. وقد اخترنا مراسل المستمدة من فيروس نقص المناعة البشرية الحد أدنى تتكون مشتقة من فيروس نقص المناعة البشرية-1 طويلة طرفية تكرار (لاتينية) وتسلسل ترميز تدتوماتو وهرمون النمو البقري (محكمة العدل الاتحادية) بوليادينيليشن إشارة (السلطة الفلسطينية)، التي كنا قد استهدفت موقعين من مواقع محددة في إنترون BACH2 5. البروتوكول المقدم هو الأمثل للخلايا جوركات والبشرية CD4 + خط الخلية المستمدة من الخلايا T تعليق، ولكن خلية أخرى يمكن أن تستخدم خطوط وبروتوكول تكييفها تبعاً لذلك. نقدم سير عمل مفصلة لاختيار الموقع المستهدف، بناء ناقلات الأمراض المستهدفة مع الأسلحة التماثل، كريسبر-Cas9-بوساطة استهداف المراسل في موقع جينومي المختار، وتوليد واختيار الخطوط الاستنساخ، وشاملة التحقق خطوط الخلية مراسل المستهدف، والذي تم إنشاؤه حديثا.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهنا يصف لنا وضع بروتوكول لإنشاء نماذج مراسل جوركات مشتقة من فيروس نقص المناعة البشرية-1 مع المواقع المختارة التكامل بروفيرال تطبيق هندسة الجينوم كريسبر-Cas9-تعتمد.
نقاط عدة من البروتوكول تتطلب عناية فائقة أثناء مرحلة التخطيط. أولاً، موضع استهداف ينبغي أن تختار بعناية، كما ب…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر ويسيلوه Britta وهابيل بيتينا للمساعدة التقنية. كما نشكر أرني Düsedau وجانا هنسن (التدفق الخلوي منصة التكنولوجيا، معهد بيت هاينريش) لتقديم الدعم التقني.
Materials
| pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | vector for expression of SpCas9 and gRNA |
| pMK | GeneArt | mammalian expression vector for cloning | |
| cDNA3.1 | Invitrogen | V79020 | mammalian expression vector for cloning |
| BbsI | New England Biolabs | R0539S | restriction enzyme |
| NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Assembly cloning kit used for target vector generation |
| TaqPlus Precision PCR System | Agilent Technologies | 600210 | DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4) |
| 96-well tissue culture plate (round-bottom) | TPP | 92097 | tissue culture plates for dilution plating |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 L | DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D9170 | dimethyl sulfoxide as PCR additive |
| Magnesium Chloride (MgCl2) Solution | New England Biolabs | B9021S | MgCl2 solution as PCR additive |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions |
| 5PRIME HotMasterMix | 5PRIME | 2200400 | ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11) |
| QIAamp DNA blood mini kit | Qiagen | 51106 | DNA isolation and purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | PCR Purification Kit |
| RPMI 1640 without glutamine | Lonza | BE12-167F | cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum South Africa Charge | PAN Biotech | P123002 | cell culture medium supplement |
| L-glutamine | Biochrom | K 0282 | cell culture medium supplement |
| Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 µg/ml | Biochrom | A 2212 | cell culture medium supplement |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection |
| TransIT-Jurkat | Mirus Bio | MIR2125 | transfection reagent |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | cell culture reagent |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | cell culture reagent |
| Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 µm | Millex | SLGP033RB | filter unit for sterile filtration |
| Heracell 150i incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026280 | tissue culture incubator |
| Amershan Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN1520B | positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | UV crosslinker |
| High Prime | Roche | 11585592001 | kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers |
| illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | chromatography spin-columns for purification of labeled DNA |
Riferimenti
- Hughes, S. H., Coffin, J. M. What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence. Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).
- Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
- Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells. Nature Communications. 8 (1), 498 (2017).
- Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection. Cell. 160 (3), 420-432 (2015).
- Han, Y., Lassen, K., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
- Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy. The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).
- Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection. Science. 345 (6196), 570-573 (2014).
- Maldarelli, F., Wu, X., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
- Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro. The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).
- Mack, K. D., Jin, X., et al. HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).
- Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).
- CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website Available from: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf (2013)
- Gibson Assembly Protocol. Addgene website Available from: https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/ (2009)
- Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website Available from: https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/ (2014)
- Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website Available from: https://www.addgene.org/protocols/subcloning/ (2013)
- Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool. Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).
- Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection. Virus Research. 249, (2018).
- Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems. PloS ONE. 11 (6), e0158294 (2016).
- Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity. Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).
- Jensen, K. T., Fløe, L., et al. Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency. FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).
- Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).
- Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. Position effects influence HIV latency reversal. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).
