CRISPR-Cas9-basierte Genom Engineering Jurkat Reporter Modelle für HIV-1-Infektion mit ausgewählten proviralen Integration Websites generieren
Summary
Wir präsentieren einen Genom engineering Workflow für die Generation der neuen in-vitro-Modelle für HIV-1-Infektion, die proviralen Integration an ausgewählten genomischen Standorten zu rekapitulieren. Ausrichtung der HIV-abgeleitete Reporter wird durch CRISPR-Cas9-vermittelten, ortsspezifische Genom Manipulation erleichtert. Detaillierte Protokolle für einzellige Klon-Generierung, Screening und richtige targeting Überprüfung stehen zur Verfügung.
Abstract
Human Immunodeficiency Virus (HIV) integriert seine proviralen DNA nicht zufällig in das Wirtsgenom Zelle an wiederkehrenden Standorten und genomische Hotspots. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die Generation der neuartige in-vitro-Modelle für HIV-Infektion mit ausgewählten genomischen Integration Websites mit CRISPR-Cas9-basierte Genom-engineering-Technologie. Mit dieser Methode eine Reporter-Sequenz der Wahl in eine gezielte, ausgewählten genomischen Locus, integrierbar klinisch relevante Integration Websites widerspiegeln.
In das Protokoll werden das Design ein HIV-abgeleitete Reporter und Auswahl der Zielsequenz Website und gRNA beschrieben. Ein Targetingvektor mit Homologie Armen gebaut und transfizierten Jurkat T-Zellen. Die Reporter-Sequenz richtet sich an den ausgewählten genomischen Standort durch homologe Rekombination durch eine Cas9-vermittelten Doppel-Strang-Pause an der Ziel-Site erleichtert. Einzellige Klone erzeugt und für die Ausrichtung von Veranstaltungen mit Durchflusszytometrie und PCR durchleuchtet. Ausgewählten Klone werden dann erweitert und korrekte Ausrichtung von PCR und Sequenzierung Southern blotting überprüft. Potenzielle Ziel Veranstaltungen CRISPR-Cas9-vermittelten Genom Engineering werden analysiert.
Mithilfe dieses Protokolls, neuartige Zellkultursysteme kann dieses Modell HIV-Infektion bei klinisch relevanten Integration Websites generiert werden. Obwohl die Generation der einzelligen Klone und Überprüfung der korrekten Reporter Sequenz Integration zeitaufwändig ist, sind die daraus resultierenden klonalen Linien mächtige Werkzeuge funktional proviralen Integration Website Wahl analysieren.
Introduction
Integration der proviralen DNA in das Wirtsgenom nach Infektion ist ein entscheidender Schritt im Lebenszyklus des menschlichen Immunodeficiencyvirus (HIV). Nach Integration bleibt HIV durch die Gründung der Latenz in langlebigen CD4 + T Zelle Teilmengen wie Speicher-CD4 + T-Zellen. HIV-Integration scheint nicht zufällig1,2. In mehreren Studien durch die Sequenzierung der Integration Websites in akut und chronisch infizierten Personen2,3,4 wurde eine Reihe von genomischen Hotspots mit immer wieder integrierte proviralen DNA festgestellt. ,5,6,7,8. Interessanterweise wurde auf einige dieser Integration Seiten der gleichen Locus erkannt, in ein großer Teil der infizierten Zellen, was zu der Idee, dass Integration an wiederkehrenden Standorten klonalen Expansion1positiv beeinflussen könnte.
Um unser Verständnis von der Bedeutung der wiederkehrenden Integration Websites zu gelangen, muss proviralen Integration Website Wahl geprüft werden. Jedoch einige technische Aspekte behindern studieren HIV Integration site-Wahl und die Folgen. Im großen und ganzen Zellmodelle Kultur für HIV Latenz verwendet, wie JLat Zelllinien nicht klinisch relevante wiederkehrende Integration Websites9entsprechen. Studien zur primären Patienten gewonnenen Zellen, auf der einen Seite Beschreibung der Integration Website Landschaft durch Sequenzierung zu aktivieren aber lassen keine Funktionsanalysen. Nach unserem Kenntnisstand steht keine ausreichende Versuchsmodell funktional ausgewählte klinisch relevante Integration Websites analysieren.
Hier präsentieren wir Ihnen einen detaillierte Workflow um neuartige Modelle für HIV-Infektion mit CRISPR-Cas9-basierte Genom-engineering-Technologie zu generieren. Die hierin beschriebene Workflow lässt sich T-Zell-derived Reporter Zelllinien zu generieren, die HIV-Infektion, genomisch integrierten proviralen Reporter bei einem gewählten Integrationsort trägt zu modellieren. Sie dienen somit als neue Werkzeuge wie der proviralen Integrationsort HIV Biologie auswirken kann und wie das Provirus reagiert auf unterschiedliche Behandlungsstrategien (z. B., Inducibility von Latenz Umkehr Agenten) zu erforschen. Unsere Methode nutzt die Vorteile der CRISPR-Cas9-basierte Genom-Technik, bei der Integration des Reporters Sequenz durch homologe Rekombination durch eine Cas9 Nuklease-induzierten Doppel-Strang Pause an der Ziel-Site erleichtert wird. Ziel-Sites für die Integration werden je nach Nähe zu den beschriebenen wiederkehrende Integration Websites von Studien über die HIV-infizierten Personen und das Vorhandensein von geeigneten PAM-Motiven für Cas9-vermittelten Genom Engineering ausgewählt.
In unserem exemplarische Ergebnisse haben wir uns auf die BACH2-gen-Locus, welche Codes für die BTB und CNC-Homologie transcriptional Regler 2 konzentriert. BACH2 bei chronisch HIV-infizierten Personen antiretrovirale Therapie gehört zu den Loci zeigt Anreicherung von integrierten HIV-1 Sequenzen3,6,7,8,10. Wir haben uns entschieden einen minimale HIV abgeleitet Reporter aus HIV-1-derived lange Terminal repeat (LTR), TdTomato kodierende Sequenz und Rinderwachstumshormon (BGH) Polyadenylation Signal (PA), die wir auf zwei bestimmte Websites in BACH2 Intron 5 ausgerichtet haben. Die vorgestellte Protokoll ist optimiert für Jurkat Zellen, eine menschliche CD4 + T-Zell-abgeleitete Fahrwerk-Zell-Linie, aber andere Zelle Linien verwendet werden können und das Protokoll entsprechend angepasst. Wir präsentieren Ihnen einen detaillierten Workflow für die Auswahl der Ziel-Site, Bau von Ziel-Vektor mit Homologie Arme, CRISPR-Cas9-vermittelten Ausrichtung des Reporters in ausgewählten genomischen Website, Generierung und Auswahl von klonalen Linien und umfassende Überprüfung der neu erstellte, zielgerichtete Reporter-Zell-Linien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll, um HIV-1-derived Jurkat Reporter Modelle mit ausgewählten proviralen Integration Websites Anwendung CRISPR-Cas9-basierte Genom Engineering generieren.
Mehrere Punkte des Protokolls erfordert besondere Aufmerksamkeit bei der Planung. Erstens der Lokus ins Visier genommen werden gewählt werden sorgfältig, wie einige Loci leichter zum Ziel als andere sein könnte (z. B., je nach dem Chromatin-Status der Region und das Ziel-Sequenz selbst). Repetitiv…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Britta Weseloh und Bettina Abel für technische Hilfe. Wir danken auch Arne Düsedau und Jana Hennesen (Flow Cytometry Technologieplattform, Heinrich-Pette-Institut) für den technischen Support.
Materials
| pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | vector for expression of SpCas9 and gRNA |
| pMK | GeneArt | mammalian expression vector for cloning | |
| cDNA3.1 | Invitrogen | V79020 | mammalian expression vector for cloning |
| BbsI | New England Biolabs | R0539S | restriction enzyme |
| NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Assembly cloning kit used for target vector generation |
| TaqPlus Precision PCR System | Agilent Technologies | 600210 | DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4) |
| 96-well tissue culture plate (round-bottom) | TPP | 92097 | tissue culture plates for dilution plating |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 L | DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D9170 | dimethyl sulfoxide as PCR additive |
| Magnesium Chloride (MgCl2) Solution | New England Biolabs | B9021S | MgCl2 solution as PCR additive |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions |
| 5PRIME HotMasterMix | 5PRIME | 2200400 | ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11) |
| QIAamp DNA blood mini kit | Qiagen | 51106 | DNA isolation and purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | PCR Purification Kit |
| RPMI 1640 without glutamine | Lonza | BE12-167F | cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum South Africa Charge | PAN Biotech | P123002 | cell culture medium supplement |
| L-glutamine | Biochrom | K 0282 | cell culture medium supplement |
| Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 µg/ml | Biochrom | A 2212 | cell culture medium supplement |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection |
| TransIT-Jurkat | Mirus Bio | MIR2125 | transfection reagent |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | cell culture reagent |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | cell culture reagent |
| Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 µm | Millex | SLGP033RB | filter unit for sterile filtration |
| Heracell 150i incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026280 | tissue culture incubator |
| Amershan Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN1520B | positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | UV crosslinker |
| High Prime | Roche | 11585592001 | kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers |
| illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | chromatography spin-columns for purification of labeled DNA |
Riferimenti
- Hughes, S. H., Coffin, J. M. What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence. Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).
- Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
- Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells. Nature Communications. 8 (1), 498 (2017).
- Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection. Cell. 160 (3), 420-432 (2015).
- Han, Y., Lassen, K., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
- Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy. The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).
- Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection. Science. 345 (6196), 570-573 (2014).
- Maldarelli, F., Wu, X., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
- Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro. The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).
- Mack, K. D., Jin, X., et al. HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).
- Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).
- CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website Available from: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf (2013)
- Gibson Assembly Protocol. Addgene website Available from: https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/ (2009)
- Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website Available from: https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/ (2014)
- Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website Available from: https://www.addgene.org/protocols/subcloning/ (2013)
- Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool. Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).
- Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection. Virus Research. 249, (2018).
- Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems. PloS ONE. 11 (6), e0158294 (2016).
- Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity. Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).
- Jensen, K. T., Fløe, L., et al. Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency. FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).
- Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).
- Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. Position effects influence HIV latency reversal. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).
