CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom Engineering voor het genereren van Jurkat verslaggever modellen voor HIV-1 infectie met geselecteerde proviraal integratie Sites

Summary

We presenteren een genoom engineering workflow voor de generatie van nieuwe in vitro modellen voor HIV-1 infectie die recapituleren proviraal integratie op geselecteerde genomic sites. Doelgerichtheid van HIV-afgeleide verslaggevers wordt vergemakkelijkt door CRISPR-Cas9-gemedieerde, site-specific genoom manipulatie. Gedetailleerde protocollen voor eencellige kloon generatie, screening en juiste targeting verificatie worden geleverd.

Abstract

Humaan immunodeficiëntie virus (HIV) integreert zijn proviraal DNA niet-willekeurig in het genoom van de cel host op terugkerende sites en genomische hotspots. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het genereren van nieuwe in vitro modellen voor HIV-infectie met gekozen genomic integratie sites met behulp van CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom engineering technologie. Met deze methode kan een verslaggever opeenvolging van keuze worden geïntegreerd in een gerichte, gekozen genomic locus, als gevolg van de integratie van klinisch relevante sites.

In het protocol, worden het ontwerp van een HIV-afgeleide verslaggever en kiezen voor een doel-site en gRNA-sequence beschreven. Een targeting vector met homologie armen is gebouwd en in Jurkat T cellen transfected. De verslaggever-reeks is gericht op de geselecteerde genomic site door homologe recombinatie vergemakkelijkt door een Cas9-gemedieerde dubbel-strand break op de doelsite. Eencellige klonen zijn gegenereerd en gescreend voor het targeten van gebeurtenissen door stroom cytometry en PCR. Geselecteerde klonen zijn dan uitgebreid en de juiste targeting is geverifieerd door PCR, sequencing en Southern blotting. Potentiële uit doelsoort zijn gebeurtenissen van CRISPR-Cas9-gemedieerde genoom engineering worden geanalyseerd.

Met behulp van dit protocol, de nieuwe cel cultuur systemen kan dat model HIV-infectie op klinisch relevante integratie sites worden gegenereerd. Hoewel de generatie van eencellige klonen en verificatie van de juiste verslaggever reeks integratie tijdrovend is, zijn de resulterende klonale lijnen krachtige hulpmiddelen voor het analyseren van functioneel proviraal integratie site keuze.

Introduction

Integratie van proviraal DNA in het genoom van de host na infectie is een cruciale stap in de levenscyclus van het humaan immunodeficiëntie virus (HIV). Na de integratie, HIV blijft door de oprichting van latentie in langlevende CD4 + T cel subsets zoals geheugen CD4 + T cellen. HIV integratie lijkt te zijn non-random^1,2. Een aantal genomic hotspots met productlevering geïntegreerde proviraal DNA is vastgesteld in verschillende studies door de sequencing van integratie sites in acuut en chronisch geïnfecteerde individuen^{2,3,4 ,5,6,7,8}. Interessant, werd sommige van deze sites van de integratie, de zelfde locus gedetecteerd in een groot deel van de geïnfecteerde cellen, wat leidt tot het idee dat integratie op terugkerende sites klonale uitbreiding¹positief kan beïnvloeden.

Om te gaan ons begrip van de betekenis van terugkerende integratie sites, moet proviraal integratie site keuze worden onderzocht. Echter, verschillende technische aspecten bestuderen HIV integratie belemmeren site keuze en de gevolgen. In grote lijnen gebruikt cel cultuur modellen voor HIV latentie zoals JLat cellijnen niet klinisch relevante terugkerende integratie sites^{9 weerspiegelen}. Studies over primaire patiënt-afgeleide cellen, aan de ene kant, beschrijving van integratie site landschap inschakelen door sequentiebepaling maar laat niet voor functionele analyses. Om onze kennis is geen voldoende experimentele model beschikbaar voor de geselecteerde klinisch relevante integratie sites functioneel te analyseren.

Hier presenteren we een gedetailleerd workflow voor het genereren van nieuwe modellen voor HIV-infectie met behulp van CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom engineering technologie. De hierin beschreven werkstroom kan worden gebruikt voor het genereren van verslaggever T cel-afgeleide cellijnen die model van HIV-infectie, uitvoering van een genomically geïntegreerde proviraal verslaggever bij een gekozen integratie-site. Ze zijn dus nieuwe instrumenten te onderzoeken hoe de site proviraal integratie kan invloed hebben op HIV biologie en hoe de provirus reageert op verschillende behandelingsstrategieën (b.v., inducibility door latency achteruitrijlicht agenten) bijeenkomen. Onze methode maakt gebruik van de voordelen van CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom techniek, in welke integratie van de verslaggever opeenvolging van homologe recombinatie wordt vergemakkelijkt door een Cas9 nuclease-geïnduceerde dubbele-strand break op de doelsite. Doel sites voor integratie zijn gekozen op basis van nabijheid van de sites beschreven terugkerende integratie van studies over HIV-geïnfecteerde individuen en de aanwezigheid van geschikte PAM motieven voor Cas9-gemedieerde genoom engineering.

In onze voorbeeldige resultaten, hebben we gericht op de BACH2 gen locus, welke codes voor de BTB en CNC homologie transcriptionele regulator 2. In chronisch HIV-geïnfecteerde individuen op antiretrovirale therapie is BACH2 een van de loci verrijking van geïntegreerde HIV-1 sequenties^3,6,7,8,10te tonen. Wij hebben een minimale HIV-afgeleide verslaggever bestaande van HIV-1-afgeleide lange terminal herhalen (LTR), tdTomato codering sequentie, en groeihormoon voor runderen (BGH) polyadenylatie signaal (PA), die we hebben gericht op twee specifieke sites in BACH2 intron 5 gekozen. Het gepresenteerde protocol is geoptimaliseerd voor Jurkat cellen, een menselijke CD4 + T cel-afgeleide schorsing cellijn, maar andere cel lijnen kunnen worden gebruikt en het protocol aangepast. We presenteren een gedetailleerde workflow voor selectie van de doelsite, bouw van doel vector met homologie armen, CRISPR-Cas9-gemedieerde doelgerichtheid van de verslaggever in de gekozen genomic locatie, de generatie en de selectie van klonen lijnen en uitgebreide verificatie van de nieuw gegenereerde, gerichte verslaggever cellijnen.

Protocol

1. gericht op de strategie voor genoom Engineering en Targeting Vector (tv)-ontwerp Opmerking: De eerste stap van genoom engineering impliceert selectie en generatie van de nodige instrumenten voor CRISPR-Cas9-gemedieerde targeting. Selectie van een genomic integratie site locus, keuze van celtype voor targeting, en het ontwerp van een HIV-afgeleide verslaggever voor integratie moeten voorafgaan aan deze stap. Dit protocol beschrijft doelgerichtheid van een HIV-LTR_tdTomato_BGH-…

Representative Results

In dit representatieve experiment hebben wij besloten te richten op een minimale HIV-1-afgeleide verslaggever die bestaat uit een LTR, volgorde tdTomato-codering en polyA-signaal volgorde naar twee loci in intron 5 van de BACH2 gen17. De loci voor targeting werden gekozen op basis van nabijheid naar gepubliceerde terugkerende integratie sites gevonden in verschillende studies op primaire T-cellen van HIV-geïnfecteerde patiënten2,</sup…

Discussion

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van HIV-1-afgeleide Jurkat verslaggever modellen met gekozen proviraal integratie sites CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom engineering toe te passen.

Verschillende punten van het protocol vereist zorgvuldige aandacht tijdens de planningsfase. Ten eerste de locus worden gericht moet worden zorgvuldig gekozen, zoals sommige loci gemakkelijker te richten dan anderen wellicht (bijvoorbeeld, afhankelijk van de status van de chromatine van de r…

Materials

pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9	Addgene	42230	vector for expression of SpCas9 and gRNA
pMK	GeneArt		mammalian expression vector for cloning
cDNA3.1	Invitrogen	V79020	mammalian expression vector for cloning
BbsI	New England Biolabs	R0539S	restriction enzyme
NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit	New England Biolabs	E5520S	Assembly cloning kit used for target vector generation
TaqPlus Precision PCR System	Agilent Technologies	600210	DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4)
96-well tissue culture plate (round-bottom)	TPP	92097	tissue culture plates for dilution plating
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530 L	DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D9170	dimethyl sulfoxide as PCR additive
Magnesium Chloride (MgCl2) Solution	New England Biolabs	B9021S	MgCl2 solution as PCR additive
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447S	dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions
5PRIME HotMasterMix	5PRIME	2200400	ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11)
QIAamp DNA blood mini kit	Qiagen	51106	DNA isolation and purification kit
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106	PCR Purification Kit
RPMI 1640 without glutamine	Lonza	BE12-167F	cell culture medium
Fetal Bovine Serum South Africa Charge	PAN Biotech	P123002	cell culture medium supplement
L-glutamine	Biochrom	K 0282	cell culture medium supplement
Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 µg/ml	Biochrom	A 2212	cell culture medium supplement
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media	Thermo Fisher Scientific	31985062	cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection
TransIT-Jurkat	Mirus Bio	MIR2125	transfection reagent
phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139-1MG	cell culture reagent
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I0634-1MG	cell culture reagent
Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 µm	Millex	SLGP033RB	filter unit for sterile filtration
Heracell 150i incubator	Thermo Fisher Scientific	51026280	tissue culture incubator
Amershan Hybond-N+	GE Healthcare	RPN1520B	positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting
Stratalinker 1800	Stratagene	400072	UV crosslinker
High Prime	Roche	11585592001	kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers
illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns	GE Healthcare	28-9034-08	chromatography spin-columns for purification of labeled DNA