Génie de génome CRISPR dotés de Cas9 pour produire des modèles de Jurkat Reporter pour l’Infection à VIH-1 avec les Sites d’intégration Proviral sélectionnés
Summary
Nous présentons un flux de travail de génie du génome pour la génération de nouveaux modèles in vitro pour l’infection à VIH-1 qui récapitulent l’intégration provirale dans certains sites génomiques. Ciblage des journalistes dérivé du VIH est facilitée par la manipulation du génome CRISPR Cas9-médiation, in situ. Des protocoles détaillés pour la génération de cellule unique clone, dépistage et vérification de ciblage correcte sont fournis.
Abstract
Virus de l’immunodéficience humaine (VIH) intègre son ADN proviral non aléatoirement dans le génome de cellule hôte sites récurrents et génomiques hotspots. Nous présentons ici un protocole détaillé pour la génération de nouveaux modèles in vitro d’infection à VIH avec des sites choisis intégration génomique à l’aide des technologies d’ingénierie génomique CRISPR dotés de Cas9. Avec cette méthode, une séquence de journaliste de choix peut être intégrée dans un locus génomique ciblé et choisi, reflétant des sites d’intégration cliniquement pertinente.
Dans le protocole, la conception d’un journaliste dérivé du VIH et en choisissant une séquence cible de site et gRNA sont décrites. Un vecteur de ciblage avec les bras de l’homologie est construit et transfecté dans des cellules T Jurkat. La séquence de journaliste s’adresse au site génomique sélectionné par recombinaison homologue, facilitée par une médiation Cas9 bicaténaires pause sur le site cible. Clones de cellules individuelles sont générées et projetés pour le ciblage des événements par cytométrie en flux et par PCR. Clones sélectionnés sont ensuite développées, et un ciblage correct est vérifiée par PCR, séquençage et de Southern. Événements hors-cible du génie de génome CRISPR Cas9-médiation sont analysés.
En utilisant ce protocole, les systèmes de cultures cellulaires roman cette infection à VIH modèle à sites d’intégration cliniquement pertinente peut être générée. Bien que la génération de clones de cellules individuelles et la vérification de l’intégration de séquence correcte journaliste prend du temps, les lignées clonales qui en résultent sont des outils puissants pour analyser fonctionnellement choix site intégration proviral.
Introduction
Intégration de l’ADN proviral dans le génome de l’hôte à l’infection est une étape essentielle dans le cycle de vie du virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Après intégration, VIH persiste en établissant la latence en sous-ensembles de cellules T CD4 + vivaces telles que les cellules T CD4 + mémoire. Intégration du VIH semble être non aléatoire1,2. On a décelé un certain nombre de hotspots génomiques avec l’ADN proviral intégré de manière récurrente dans plusieurs études à travers le séquençage des sites d’intégration aux personnes infectées de manière aiguë et chronique2,3,4 ,5,6,7,8. Fait intéressant, à certains de ces sites d’intégration, un même locus a été détecté dans une grande partie des cellules infectées, conduisant à l’idée que l’intégration aux sites récurrents pourrait affecter positivement expansion clonale1.
Pour faire progresser notre compréhension de l’importance des sites d’intégration récurrente, choix du site intégration proviral doit être explorée. Cependant, plusieurs aspects techniques entravent étudie l’intégration du VIH du site choix et les conséquences. Largement utilisé des modèles de culture de cellules pour la latence du VIH comme les lignées cellulaires JLat ne reflètent pas cliniquement pertinente intégration récurrente sites9. Études sur des cellules primaires dérivés de patient, d’une part, permettent la description du paysage du site intégration par séquençage mais ne permettent pas d’analyses fonctionnelles. À notre connaissance, aucun modèle expérimental adéquat n’est disponible pour analyser fonctionnellement certains sites d’intégration cliniquement pertinente.
Nous présentons ici un flux de travail détaillé pour générer de nouveaux modèles pour l’infection par le VIH en utilisant des technologies d’ingénierie génomique CRISPR dotés de Cas9. Le flux de travail décrit ci-après peut être utilisé pour générer des lignées de cellules de culture cellulaire T journaliste qui modélisent l’infection par le VIH, transportant un journaliste proviral génomiquement intégré à un site d’intégration choisie. Ils servent ainsi que de nouveaux outils pour explorer comment le site intégration proviral peut avoir un impact biologie le VIH et comment le provirus répond aux différentes stratégies de traitement (p. ex., inductibilité par inversion des agents de latence). Notre méthode utilise les avantages du génie de génome CRISPR dotés de Cas9, dans laquelle intégration du reporter séquence par recombinaison homologue est facilitée par une pause de bicaténaires induite par la nucléase Cas9 sur le site cible. Les sites cibles pour l’intégration sont choisis selon la proximité avec les sites décrits intégration récurrente d’études sur les personnes infectées par le VIH et la présence de motifs de PAM appropriés pour l’ingénierie du génome induite par le Cas9.
Dans nos résultats exemplaires, nous avons mis l’accent sur le locus du gène BACH2, qui code pour le régulateur transcriptionnel BTB et CNC homologie 2. Chez les personnes chroniquement infectées par le VIH sous traitement antirétroviral, BACH2 est un des locus montrant l’enrichissement du integrated HIV-1 séquences3,6,7,8,10. Nous avons choisi un journaliste dérivé du VIH minimal consistant en dérivés du VIH-1 long terminal repeat (LTR), tdTomato séquence codante et signal de polyadénylation de l’hormone de croissance bovine (BGH) (PA), dont nous avons ciblé deux sites spécifiques dans l’intron BACH2 5. Le protocole présenté est optimisé pour Jurkat cellules, une lignée de cellules humaine CD4 + suspension dérivé de lymphocytes T, mais autre cellule lignées peuvent être utilisées et le protocole adapté en conséquence. Nous présentons un flux de travail détaillé pour la sélection du site cible, construction du vecteur de la cible avec les bras de l’homologie, CRISPR Cas9-médiation ciblant le reporter dans le site choisi de génomique, la génération et la sélection des lignées clonales et complètes vérification des lignées cellulaires de journaliste nouvellement généré et ciblées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici un protocole visant à générer des modèles de journaliste Jurkat dérivés du VIH-1 avec des sites d’intégration proviral choisi appliquant le génie du génome CRISPR dotés de Cas9.
Plusieurs points du protocole nécessitent une attention particulière durant la phase de planification. Tout d’abord, le locus d’être la cible doit être choisi avec soin, car certains loci pourrait être plus facile à la cible que d’autres (par exemple, selon l’état…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Britta Weseloh et Bettina Abel pour l’assistance technique. Nous remercions également Arne Düsedau et Jana Hennesen (plate-forme de technologie dans la cytométrie en flux, Heinrich Pette Institut) pour le support technique.
Materials
| pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | vector for expression of SpCas9 and gRNA |
| pMK | GeneArt | mammalian expression vector for cloning | |
| cDNA3.1 | Invitrogen | V79020 | mammalian expression vector for cloning |
| BbsI | New England Biolabs | R0539S | restriction enzyme |
| NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Assembly cloning kit used for target vector generation |
| TaqPlus Precision PCR System | Agilent Technologies | 600210 | DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4) |
| 96-well tissue culture plate (round-bottom) | TPP | 92097 | tissue culture plates for dilution plating |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 L | DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D9170 | dimethyl sulfoxide as PCR additive |
| Magnesium Chloride (MgCl2) Solution | New England Biolabs | B9021S | MgCl2 solution as PCR additive |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions |
| 5PRIME HotMasterMix | 5PRIME | 2200400 | ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11) |
| QIAamp DNA blood mini kit | Qiagen | 51106 | DNA isolation and purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | PCR Purification Kit |
| RPMI 1640 without glutamine | Lonza | BE12-167F | cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum South Africa Charge | PAN Biotech | P123002 | cell culture medium supplement |
| L-glutamine | Biochrom | K 0282 | cell culture medium supplement |
| Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 µg/ml | Biochrom | A 2212 | cell culture medium supplement |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection |
| TransIT-Jurkat | Mirus Bio | MIR2125 | transfection reagent |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | cell culture reagent |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | cell culture reagent |
| Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 µm | Millex | SLGP033RB | filter unit for sterile filtration |
| Heracell 150i incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026280 | tissue culture incubator |
| Amershan Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN1520B | positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | UV crosslinker |
| High Prime | Roche | 11585592001 | kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers |
| illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | chromatography spin-columns for purification of labeled DNA |
Riferimenti
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