Основанный ТРИФОСФАТЫ Cas9 генома инженерии для создания модели Jurkat репортер для инфекции ВИЧ-1 с выбранной Proviral интеграции сайтов
Summary
Мы представляем генома инженерных рабочих процессов для создания новых моделей в пробирке для инфекции ВИЧ-1, что итог proviral интеграции на отдельных участках генома. Нападения на журналистов ВИЧ производный облегчается манипуляция ТРИФОСФАТЫ-Cas9-опосредованной, участкам генома. Предоставляются подробные протоколы для одной ячейки клонов поколения, скрининг и правильной ориентации проверки.
Abstract
Вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) не случайно интегрирует его proviral ДНК генома клетки хоста на текущих сайтах и геномных горячих точках. Здесь мы представляем подробный протокол для поколения роман в пробирке моделей для ВИЧ-инфекции с выбранной геномной интеграции сайтов с использованием генома, основанный ТРИФОСФАТЫ-Cas9 техника. С помощью этого метода репортер последовательность выбора могут быть интегрированы в целенаправленной, выбранной геномной локус, отражающие клинически значимых интеграции сайтов.
В протоколе описаны дизайн ВИЧ производные репортер и выбор целевого сайта и gRNA последовательности. Ориентации вектора с гомологии оружия построен и transfected в клетки Jurkat T. Репортер последовательность ориентирован на выбранный сайт геномной гомологичная рекомбинация, при содействии Cas9-опосредованной двухручьевой перерыв на целевом сайте. Клоны одной ячейки создаются и экранируется проточной цитометрии и ПЦР для ориентации событий. Выбранный клоны затем расширяется, и правильной ориентации подтверждена ПЦР, последовательности и Южный blotting. Проанализированы потенциальные пробить события ТРИФОСФАТЫ-Cas9-опосредованной генома техники.
Используя этот протокол, Роман клетки культуры системы, модель ВИЧ-инфекции в клинически значимых интеграции сайты могут быть созданы. Хотя поколение одной ячейки клонов и проверка правильного репортер последовательность интеграции является длительным, результирующий клоновых линий являются мощными инструментами, функционально анализировать выбор сайта proviral интеграции.
Introduction
Интеграция proviral ДНК в геноме хоста после инфекции является важным шагом в жизненном цикле вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). После интеграции ВИЧ сохраняется путем установления задержку в долгоживущих подмножеств клеток CD4 + T например CD4 + Т-клеток памяти. Интеграции ВИЧ, по-видимому, не случайные1,2. Ряд очагов геномной с периодически комплексной proviral ДНК была обнаружена в нескольких исследованиях через последовательность интеграции сайтов в остро и хронически инфицированных лиц2,3,4 ,5,6,,78. Интересно, что в некоторых из этих сайтов интеграции, же Локус был обнаружен в большой доли инфицированных клеток, приводит к идее, что интеграции на текущих сайтах может положительно повлиять на клоновых расширения1.
Для продвижения нашего понимания значимости периодических интеграции сайтов, необходимо изучить выбор сайта proviral интеграции. Однако, несколько технических аспектов препятствуют изучению интеграции ВИЧ сайт выбор и последствия. Широко используется модели культуры клеток для задержки ВИЧ как JLat клеточных линий не отражают клинически значимых периодически интеграции сайтов9. Исследования на первичной клетки пациента производные, с одной стороны, включить описание интеграции сайта ландшафта путем sequencing но не позволяют для функционального анализа. Насколько нам известно не адекватные Экспериментальная модель доступна для функционально анализировать выбранный клинически значимых интеграции сайтов.
Здесь мы представляем подробный рабочий процесс для создания новых моделей для ВИЧ-инфекции с использованием генома, основанный ТРИФОСФАТЫ-Cas9 техника. Рабочий процесс описан здесь может использоваться для создания Т клеток, полученных репортер клеточных линий, которые моделируют ВИЧ-инфекции, перевозящих genomically комплексных proviral репортер на сайте выбранного интеграции. Таким образом, они выступают в качестве новых инструментов для изучения влияния на сайте proviral интеграции биологии ВИЧ и как Провирус реагирует на различные лечения (например, inducibility, задержка обратного агентами). Наш метод использует преимущества инженерства основанный ТРИФОСФАТЫ-Cas9 генома, в котором интеграции репортер последовательности гомологичная рекомбинация облегчается Cas9 Нуклеаза индуцированной двухручьевой перерыв на целевом сайте. Целевые объекты для интеграции выбираются по близости от описанных периодических интеграции сайтов от исследований на ВИЧ инфицированных лиц и наличие подходящих PAM мотивы для машиностроения Cas9-опосредованной генома.
В наши образцовые результаты мы сосредоточились на BACH2 Локус гена, который коды для BTB и CNC гомологии transcriptional регулятор 2. В хронически ВИЧ инфицированных людей на антиретровирусной терапии BACH2 является одним из локусов, показаны обогащения комплексных ВИЧ-1 последовательности3,6,,78,10. Мы выбрали минимальная ВИЧ производные репортер, состоящий из ВИЧ-1-производные длинные концевые повторить (LTR), tdTomato кодирующая последовательность и гормон роста крупного рогатого скота (BGH) сплайсингу сигнала (ПА), которые мы избрали двух определенных сайтов в BACH2 Интрон 5. Представленные протокол оптимизирован для Jurkat клеток, человека CD4 + Т клеток, полученных подвеска клеток линии, но другие ячейки, строки могут быть использованы и протокола, адаптированными таким образом. Мы представляем подробную рабочего процесса для выбора целевого сайта, строительство целевой вектора с гомологии оружия, ТРИФОСФАТЫ-Cas9-опосредованной против репортера в выбранный геномной сайт, поколения и выбор клоновых линий и всеобъемлющей проверки созданный, целенаправленных репортер клеточных линий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем протокол для создания ВИЧ-1-производные Jurkat репортер модели с выбранной proviral интеграции сайтов применения ТРИФОСФАТЫ-Cas9-основанные геном инженерии.
Несколько точек протокола требуют пристального внимания на этапе планирования. Во-первых, локус напра?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Бритта Weseloh и Bettina Абель для оказания технической помощи. Мы также благодарим Арне Düsedau и Яна Hennesen (поток цитометрии технологическая платформа, Генриха Pette Institut) для технической поддержки.
Materials
| pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | vector for expression of SpCas9 and gRNA |
| pMK | GeneArt | mammalian expression vector for cloning | |
| cDNA3.1 | Invitrogen | V79020 | mammalian expression vector for cloning |
| BbsI | New England Biolabs | R0539S | restriction enzyme |
| NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Assembly cloning kit used for target vector generation |
| TaqPlus Precision PCR System | Agilent Technologies | 600210 | DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4) |
| 96-well tissue culture plate (round-bottom) | TPP | 92097 | tissue culture plates for dilution plating |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 L | DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D9170 | dimethyl sulfoxide as PCR additive |
| Magnesium Chloride (MgCl2) Solution | New England Biolabs | B9021S | MgCl2 solution as PCR additive |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions |
| 5PRIME HotMasterMix | 5PRIME | 2200400 | ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11) |
| QIAamp DNA blood mini kit | Qiagen | 51106 | DNA isolation and purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | PCR Purification Kit |
| RPMI 1640 without glutamine | Lonza | BE12-167F | cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum South Africa Charge | PAN Biotech | P123002 | cell culture medium supplement |
| L-glutamine | Biochrom | K 0282 | cell culture medium supplement |
| Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 µg/ml | Biochrom | A 2212 | cell culture medium supplement |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection |
| TransIT-Jurkat | Mirus Bio | MIR2125 | transfection reagent |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | cell culture reagent |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | cell culture reagent |
| Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 µm | Millex | SLGP033RB | filter unit for sterile filtration |
| Heracell 150i incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026280 | tissue culture incubator |
| Amershan Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN1520B | positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | UV crosslinker |
| High Prime | Roche | 11585592001 | kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers |
| illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | chromatography spin-columns for purification of labeled DNA |
Riferimenti
- Hughes, S. H., Coffin, J. M. What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence. Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).
- Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
- Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells. Nature Communications. 8 (1), 498 (2017).
- Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection. Cell. 160 (3), 420-432 (2015).
- Han, Y., Lassen, K., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
- Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy. The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).
- Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection. Science. 345 (6196), 570-573 (2014).
- Maldarelli, F., Wu, X., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
- Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro. The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).
- Mack, K. D., Jin, X., et al. HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).
- Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).
- CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website Available from: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf (2013)
- Gibson Assembly Protocol. Addgene website Available from: https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/ (2009)
- Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website Available from: https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/ (2014)
- Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website Available from: https://www.addgene.org/protocols/subcloning/ (2013)
- Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool. Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).
- Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection. Virus Research. 249, (2018).
- Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems. PloS ONE. 11 (6), e0158294 (2016).
- Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity. Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).
- Jensen, K. T., Fløe, L., et al. Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency. FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).
- Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).
- Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. Position effects influence HIV latency reversal. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).
