Basati su CRISPR-Cas9 genoma ingegneria per generare modelli di Jurkat Reporter per infezione da HIV-1 con integrazione Proviral selezionati siti

Summary

Vi presentiamo un flusso di lavoro ingegneria di genoma per la generazione di nuovi modelli in vitro per infezione da HIV-1 che ricapitolano integrazione proviral a selezionati siti genomici. Targeting dei reporter HIV-derivato è facilitato dalla manipolazione del genoma CRISPR-Cas9-mediata, site-specific. Sono disponibili protocolli dettagliati per cella singola clone generazione, lo screening e la corretta verifica targeting.

Abstract

Virus di immunodeficenza umana (HIV) integra il DNA provirale non casualmente nel genoma della cellula ospite alle ricorrenti siti e genomico hotspot. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per la generazione di nuovi modelli in vitro per l’infezione da HIV con siti di integrazione genomica selezionate utilizzando la tecnologia di ingegneria basati su CRISPR-Cas9 genoma. Con questo metodo, una sequenza di reporter di scelta può essere integrata in un locus genomico mirato, selezionato, riflettendo siti di integrazione clinicamente rilevanti.

Nel protocollo, la progettazione di un reporter di HIV-derivato e scegliendo di una sequenza di destinazione sito e gRNA sono descritti. Un vettore targeting con braccia di omologia è costruito e transfected nelle cellule di T di Jurkat. La sequenza di reporter si rivolge al sito genomico selezionato tramite la ricombinazione omologa, facilitata da una pausa di doppio filo Cas9-mediata al sito di destinazione. Cloni unicellulari sono generati e proiettati per ottimizzazione degli eventi mediante citometria a flusso e PCR. Cloni selezionati vengono quindi espansi e targeting corretta viene verificato mediante PCR, sequenziamento e macchiare del sud. Vengono analizzati potenziali eventi fuori bersaglio di ingegneria CRISPR-Cas9-mediata del genoma.

Utilizzando questo protocollo, sistemi di coltura cellulare romanzo può essere generato l’infezione da HIV tale modello presso siti di integrazione clinicamente rilevanti. Anche se la generazione di cloni unicellulari e verifica dell’integrazione sequenza corretta reporter è lunghe, le linee clonali risultante sono potenti strumenti per analizzare in modo funzionale scelta del sito di integrazione proviral.

Introduction

Integrazione del DNA provirale nel genoma ospite al momento dell’infezione è un passo fondamentale nel ciclo di vita del virus di immunodeficenza umana (HIV). A seguito di integrazione, l’HIV persiste attraverso la definizione di latenza in sottoinsiemi di cellule T CD4 + longevi come cellule T CD4 + di memoria. Integrazione di HIV sembra essere non casuale^1,2. Un numero di hotspot genomico con DNA provirale ricorrentemente integrato è stato rilevato in parecchi studi attraverso il sequenziamento dei siti di integrazione in individui acutamente e cronicamente infettati^{2,3,4 ,5,6,7,8}. È interessante notare che, in alcuni di questi siti di integrazione, stesso locus è stato rilevato in una grande frazione delle cellule infettate, che conduce all’idea che integrazione alle ricorrenti siti potrebbe influenzare positivamente l’espansione clonale¹.

Per avanzare la nostra comprensione del significato dei siti di integrazione ricorrenti, scelta del sito di integrazione proviral deve essere esplorata. Tuttavia, diversi aspetti tecnici ostacolano lo studio integrazione HIV sito scelta e le conseguenze. Ampiamente utilizzati modelli di coltura cellulare per latenza di HIV come linee cellulari JLat non riflettono clinicamente rilevante integrazione ricorrenti siti⁹. Studi su cellule primarie derivate dal paziente, da un lato, attivare la descrizione di integrazione sito paesaggio dall’ordinamento ma non consentono analisi funzionali. A nostra conoscenza, nessun modello sperimentale adeguato è disponibile per analizzare i siti selezionati clinicamente rilevante integrazione funzionalmente.

Qui presentiamo un flusso di lavoro dettagliato per generare nuovi modelli per l’infezione da HIV usando tecnologia di ingegneria basati su CRISPR-Cas9 genoma. Il flusso di lavoro descritto nel presente documento può essere utilizzato per generare linee cellulari derivati da cellule T reporter che modellano l’infezione da HIV, che trasportano un reporter proviral genomicamente integrato in un sito di integrazione selezionate. Servono così come nuovi strumenti per esplorare come il sito di integrazione proviral può influenzare la biologia di HIV e come provirus risponde a diverse strategie terapeutiche (ad esempio, 270ms dagli agenti inversione di latenza). Il nostro metodo utilizza i vantaggi dell’ingegneria basati su CRISPR-Cas9 genoma, in quale integrazione del reporter sequenza di ricombinazione omologa è facilitato da una pausa di doppio filo indotta da nucleasi Cas9 al sito di destinazione. Siti di destinazione per l’integrazione sono scelti secondo la vicinanza ai siti integrazione ricorrente descritto da studi su individui affetti da HIV e la presenza di motivi di PAM adatti per ingegneria Cas9-mediata del genoma.

Nei nostri risultati di esemplare, ci siamo concentrati sul luogo del gene BACH2, che codifica per il regolatore trascrizionale di BTB e CNC omologia 2. In individui HIV-infettati cronicamente sulla terapia antiretrovirale, BACH2 è uno dei loci risultati arricchimento di HIV-1 integrato sequenze^3,6,7,8,10. Abbiamo scelto un reporter HIV-derivato minimo costituito da HIV-1-derivati lungo terminale di ripetizione (LTR), sequenza di codificazione di tdTomato e ormone della crescita bovina (BGH) segnale di poliadenilazione (PA), che siamo presi di mira a due siti specifici in BACH2 introne 5. Il protocollo presentato è ottimizzato per Jurkat cellule, un’umano CD4 + linea cellulare T cellula-derivati sospensione, ma altri cell le linee possono essere utilizzate e il protocollo adattato di conseguenza. Vi presentiamo un flusso di lavoro dettagliato per la selezione del sito di destinazione, costruzione del vettore di destinazione con le braccia di omologia, CRISPR-Cas9-mediata di targeting del reporter nel sito genomico scelto, la generazione e la selezione di linee clonali e complete verifica delle varietà di cellula di reporter appena generato, mirati.

Protocol

1. strategia di targeting per genoma ingegneria e Targeting disegno vettoriale (tv) Nota: Il primo passo di ingegneria genoma prevede selezione e generazione degli strumenti necessari per il CRISPR-Cas9-mediated targeting. Selezione di un locus di sito di integrazione genomica, scelta del tipo di cella per il targeting e progettazione di un reporter di HIV-derivati per l’integrazione deve precedere questo passaggio. Questo protocollo descrive il targeting di un reporter di minim…

Representative Results

In questo esperimento rappresentanza abbiamo scelto di indirizzare un reporter di HIV-1-derivati minimo composta un LTR, la sequenza tdTomato-codificazione e la sequenza di polyA-segnale a due loci in introne 5 del gene BACH217. I loci per il targeting sono stati scelti secondo la vicinanza ai siti pubblicati integrazione ricorrenti trovato in diversi studi su cellule T primarie da pazienti HIV-infettati2,4…

Discussion

Qui, descriviamo un protocollo per generare modelli di HIV-1-derivati Jurkat reporter con siti di integrazione proviral selezionate l’applicazione di ingegneria basati su CRISPR-Cas9 genoma.

Alcuni punti del protocollo richiedono attenzione durante la fase di pianificazione. In primo luogo, il luogo di destinazione dovrebbe essere scelto con attenzione, come alcuni loci potrebbero essere più facile bersaglio di altri (ad es., a seconda dello stato della cromatina della regione e la d…

Materials

pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9	Addgene	42230	vector for expression of SpCas9 and gRNA
pMK	GeneArt		mammalian expression vector for cloning
cDNA3.1	Invitrogen	V79020	mammalian expression vector for cloning
BbsI	New England Biolabs	R0539S	restriction enzyme
NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit	New England Biolabs	E5520S	Assembly cloning kit used for target vector generation
TaqPlus Precision PCR System	Agilent Technologies	600210	DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4)
96-well tissue culture plate (round-bottom)	TPP	92097	tissue culture plates for dilution plating
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530 L	DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D9170	dimethyl sulfoxide as PCR additive
Magnesium Chloride (MgCl2) Solution	New England Biolabs	B9021S	MgCl2 solution as PCR additive
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447S	dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions
5PRIME HotMasterMix	5PRIME	2200400	ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11)
QIAamp DNA blood mini kit	Qiagen	51106	DNA isolation and purification kit
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106	PCR Purification Kit
RPMI 1640 without glutamine	Lonza	BE12-167F	cell culture medium
Fetal Bovine Serum South Africa Charge	PAN Biotech	P123002	cell culture medium supplement
L-glutamine	Biochrom	K 0282	cell culture medium supplement
Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 µg/ml	Biochrom	A 2212	cell culture medium supplement
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media	Thermo Fisher Scientific	31985062	cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection
TransIT-Jurkat	Mirus Bio	MIR2125	transfection reagent
phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139-1MG	cell culture reagent
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I0634-1MG	cell culture reagent
Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 µm	Millex	SLGP033RB	filter unit for sterile filtration
Heracell 150i incubator	Thermo Fisher Scientific	51026280	tissue culture incubator
Amershan Hybond-N+	GE Healthcare	RPN1520B	positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting
Stratalinker 1800	Stratagene	400072	UV crosslinker
High Prime	Roche	11585592001	kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers
illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns	GE Healthcare	28-9034-08	chromatography spin-columns for purification of labeled DNA