CRISPR-Cas9 מבוססי הגנום הנדסה ליצירת מודלים Jurkat כתב להידבקות ב- HIV-1 עם אתרים שנבחרו אינטגרציה Proviral

Summary

אנו מציגים הגנום הנדסה זרימת עבודה עבור הדור של הדגמים החדשים במבחנה להידבקות ב- HIV-1 זה מסכם את הדברים proviral אינטגרציה באתרים גנומית שנבחרו. פילוח של עיתונאים HIV-derived בהנחייתם של מניפולציה הגנום CRISPR Cas9-בתיווך, הספציפיות-לאתר. פרוטוקולים מפורט דור שיבוט תא בודד, הקרנה של אימות המטרה הנכונה הינם מסופקים.

Abstract

וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) משלב ה-DNA שלו proviral שאינה אקראית לתוך הגנום התא המארח-חוזרים ונשנים אתרים ונקודות גנומית. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדור של הרומן מודלים במבחנה הידבקות ב- HIV עם אתרי אינטגרציה הגנומי שבחרת באמצעות טכנולוגיית ההנדסה הגנום המבוססות על CRISPR-Cas9. בשיטה זו, כתב רצף של הבחירה שניתן לשלב לוקוס גנומית יישוב, שבחרת, המשקף הרלוונטית קלינית שילוב אתרים.

בפרוטוקול, מתוארים העיצוב של הכתב HIV-derived ובחירה של רצף באתר, gRNA היעד. וקטור מיקוד בזרועות הומולוגיה נבנה, transfected לתוך תאי Jurkat T. הרצף כתב לאוכלוסייה אתר גנומית שנבחר על ידי רקומבינציה הומולוגית בהנחייתם של הפסקה כפולה-strand בתיווך Cas9 באתר היעד. תא בודד שיבוטים שנוצר, הוקרן הכוונת האירועים על ידי cytometry זרימה ו- PCR. שיבוטים שנבחרו ואז מורחבות, פילוח נכון מאומתת על ידי ה-PCR, רצף סופג הדרומי. ניתוח אירועים פוטנציאליים את המטרה של הגנום CRISPR Cas9-בתיווך הנדסה.

באמצעות פרוטוקול, מערכות התרבות התא הרומן הזה ניתן להפיק את הידבקות ב- HIV דגם באתרים אינטגרציה הרלוונטית קלינית. למרות הדור של תא בודד שיבוטים ואימות של שילוב רצף כתב הנכונה היא גוזלת זמן, הקווים המשובטים וכתוצאה מכך הם כלים רבי-עוצמה לנתח באופן פונקציונלי אינטגרציה proviral אתר הבחירה.

Introduction

שילוב של proviral ה-DNA הגנום המארח בעת זיהום הוא שלב קריטי במחזור החיים של וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV). בעקבות שילוב, HIV נמשכת על-ידי יצירת השהיה של קבוצות משנה תאי CD4 + T חיים ארוכים כגון זיכרון CD4 + T תאים. HIV שילוב שנראה שאינן אקראיות^1,2. מספר נקודות חמות גנומית עם ה-DNA proviral משולב שהדו-שיח זוהתה במספר מחקרים באמצעות הרצף של שילוב אתרים אנשים נגועים בחריפות, באופן כרוני^{2,3,4 ,5,}–^6,–^7,–⁸. מעניין, על שילוב אתרים מסויימים, מיקומה באותו זוהה שבר גדול של תאים נגועים, שמוביל הרעיון כי אינטגרציה באתרים חוזרים ונשנים עלול להשפיע באופן חיובי משובט הרחבה¹.

כדי לקדם את ההבנה שלנו של המשמעות של שילוב חוזר ונשנה אתרים, שילוב proviral אתר הבחירה חייב להיחקר. עם זאת, מספר היבטים טכניים ה”בלתי אינטגרציה HIV לימוד באתר הבחירה ואת ההשלכות. בשימוש רחב תא תרבות מודלים של השהיה HIV, כמו שורות תאים JLat אינן משקפות את שילוב חוזר ונשנה הרלוונטית קלינית אתרי⁹. מחקרים על תאים נגזר החולה הראשי, מצד אחד, מאפשרים תיאור של שילוב האתר נוף על ידי רצף אך אינם מאפשרים ניתוחים פונקציונליים. ידיעתנו אין דגם ניסיוני נאותה זמין לנתח אתרים נבחרים הרלוונטית קלינית אינטגרציה פונקציונלית.

כאן אנו מציגים נתונים היסטוריים זרימת עבודה כדי ליצור מודלים חדשניים הידבקות ב- HIV באמצעות טכנולוגיית ההנדסה הגנום המבוססות על CRISPR-Cas9. זרימת העבודה המתוארת במסמך זה יכול לשמש כדי ליצור קווים תא תא T-derived כתב דגם הידבקות ב- HIV, נושא כתב proviral genomically משולב באתר שבחרת שילוב. הם משרתים וכך גם כלים חדשים לחקור איך האתר אינטגרציה proviral יכולים להשפיע ביולוגיה HIV ואת איך provirus מגיבה אסטרטגיות טיפול שונה (למשל, inducibility על ידי סוכנים היפוך השהיה). השיטה שלנו משתמשת את היתרונות של הגנום CRISPR-Cas9 מבוססי הנדסה, בשילוב אשר כתב רצף מאת רקומבינציה הומולוגית בהנחייתם של Cas9 הנוצרות על-ידי נוקלאז כפול-strand הפסקה באתר היעד. אתרי היעד עבור שילוב נבחרו על פי קרבה לאתרים שילוב חוזר ונשנה שתואר ממחקרים על אנשים נגועים ב- HIV ואת נוכחותם של מוטיבים מתאימים פאם הגנום בתיווך Cas9 הנדסה.

התוצאות המופת שלנו, אנחנו התמקדו מיקומה ג’ין BACH2, אשר הקודים המתקן תעתיק BTB ו CNC הומולוגיה 2. אצל אנשים באופן כרוני נגוע ב- HIV על טיפול תרופתי, BACH2 הוא אחד לוקוסים מציג העשרה משולב HIV-1 רצפים של^3,6,7,8,10. בחרנו עיתונאי HIV-derived מינימלי של HIV-1-derived זמן מסוף חוזר (משמאל לימין), רצף קידוד tdTomato, הורמון גדילה (BGH) הסימן פוליאדנילציה (PA), אשר בוחר לשני אתרים ספציפיים באינטרון BACH2 5. פרוטוקול הציג ממוטב Jurkat תאים, אנושי CD4 + תא T-derived ההשעיה תא קו, אבל תא שני קווים עשוי לשמש, פרוטוקול הותאם בהתאם. אנו מציגים זרימת עבודה מפורט באתר היעד, בניית היעד וקטור בזרועות הומולוגיה, CRISPR Cas9-בתיווך פילוח של הכתב לתוך האתר גנומית שבחרת, הדור ואת הבחירה של קווי המשובטים, ומקיף מבחר אימות של שורות תאים הכתב החדש שנוצר, ממוקד.

Protocol

1. אסטרטגיה מכוונת הגנום הנדסה והיעדים עיצוב וקטור (טלוויזיה) הערה: הצעד הראשון של הגנום הנדסה כרוך בחירה ויצירת הכלים הדרושים עבור CRISPR Cas9-בתיווך מיקוד. מבחר של לוקוס באתר אינטגרציה הגנומי, בחירה של סוג התא הכוונת, ועיצוב כתב HIV-derived לשילוב צריך להקדים שלב זה. פרוטוקול …

Representative Results

בניסוי זה נציג בחרנו להתמקד עיתונאי HIV-1-derived מינימלי המורכב LTR, tdTomato-קידוד רצף, תיקים עשויים. האות רצף מנחלת שני באינטרון 5 של ג’ין BACH217. לוקוסים עבור המיקוד נבחרו על פי קרבה לאתרי שילוב חוזר ונשנה שפורסמו שנמצאו במחקרים שונים על ראשי T תאים נגועים ב- HIV2<…

Discussion

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ליצירת מודלים לכתבת HIV-1-נגזר Jurkat עם האתרים שבחרת שילוב proviral החלת בהנדסת הגנום המבוססות על CRISPR-Cas9.

מספר נקודות של הפרוטוקול דורשים תשומת לב רבה במהלך שלב התכנון. ראשית, מיקומה כדי להיות ממוקד יש לבחור בקפידה, כמו לוקוסים מסוימים ייתכן שיהיה קל יותר ?…

Materials

pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9	Addgene	42230	vector for expression of SpCas9 and gRNA
pMK	GeneArt		mammalian expression vector for cloning
cDNA3.1	Invitrogen	V79020	mammalian expression vector for cloning
BbsI	New England Biolabs	R0539S	restriction enzyme
NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit	New England Biolabs	E5520S	Assembly cloning kit used for target vector generation
TaqPlus Precision PCR System	Agilent Technologies	600210	DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4)
96-well tissue culture plate (round-bottom)	TPP	92097	tissue culture plates for dilution plating
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530 L	DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D9170	dimethyl sulfoxide as PCR additive
Magnesium Chloride (MgCl2) Solution	New England Biolabs	B9021S	MgCl2 solution as PCR additive
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447S	dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions
5PRIME HotMasterMix	5PRIME	2200400	ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11)
QIAamp DNA blood mini kit	Qiagen	51106	DNA isolation and purification kit
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106	PCR Purification Kit
RPMI 1640 without glutamine	Lonza	BE12-167F	cell culture medium
Fetal Bovine Serum South Africa Charge	PAN Biotech	P123002	cell culture medium supplement
L-glutamine	Biochrom	K 0282	cell culture medium supplement
Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 µg/ml	Biochrom	A 2212	cell culture medium supplement
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media	Thermo Fisher Scientific	31985062	cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection
TransIT-Jurkat	Mirus Bio	MIR2125	transfection reagent
phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139-1MG	cell culture reagent
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I0634-1MG	cell culture reagent
Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 µm	Millex	SLGP033RB	filter unit for sterile filtration
Heracell 150i incubator	Thermo Fisher Scientific	51026280	tissue culture incubator
Amershan Hybond-N+	GE Healthcare	RPN1520B	positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting
Stratalinker 1800	Stratagene	400072	UV crosslinker
High Prime	Roche	11585592001	kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers
illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns	GE Healthcare	28-9034-08	chromatography spin-columns for purification of labeled DNA