基于 crispr-cas9 的基因组工程, 用于生成 hiv-1 感染与选定的证明病毒整合点的 jurkat 报告模型
Summary
我们提出了一个基因组工程工作流程, 用于生成新的 hiv-1 感染体外模型, 在选定的基因组站点重新构建天际整合。利用 crispr-cas9 介导的、特定地点的基因组操作, 为针对艾滋病毒来源的记者提供了便利。提供了单细胞克隆生成、筛选和正确目标验证的详细协议。
Abstract
人类免疫缺陷病毒 (hiv) 将其非随机 dna 整合到复发地点和基因组热点的宿主细胞基因组中。在这里, 我们提出了一个详细的协议, 以生成新的体外模型的艾滋病毒感染与选定的基因组整合位点使用基于 crispr-cas9 的基因组工程技术。通过这种方法, 可以将选择的报告序列集成到有针对性的、选择的基因组位点中, 反映临床相关的整合位点。
该协议描述了 hiv 衍生记者的设计以及目标站点和 grna 序列的选择。构造了具有同源臂的靶向载体, 并将其转染到 jurkat t 细胞中。记者序列是针对选定的基因组位点的, 由在目标站点上的 cas9 介导的双链断裂促成的同源重组。通过流式细胞仪和 pcr 生成单细胞克隆并筛选靶向事件。然后展开选定的克隆体, 并通过 pcr、测序和南方印迹验证正确的靶向。分析了 crispr-cas9 介导的基因组工程的潜在离目标事件。
通过使用该协议, 可以生成在临床相关整合点模拟艾滋病毒感染的新细胞培养系统。尽管单细胞克隆的生成和正确的报告序列集成的验证是非常耗时的, 但由此产生的克隆线是功能上分析天方集成站点选择的强大工具。
Introduction
感染后将天分 dna 整合到宿主基因组中是人体免疫缺陷病毒 (hiv) 生命周期中的一个关键步骤。整合后, 艾滋病毒持续存在, 在长寿命 cd4+ t 细胞子集 (如记忆 cd4+ t 细胞) 中建立潜伏期。艾滋病毒的整合似乎不是随机的 1,2。通过对急性和慢性感染个体 2, 3,4的 整合位点进行测序, 在几项研究中发现了一些具有递归整合天方 dna 的基因组热点,5,6,7,8。有趣的是, 在其中一些整合位点中, 在很大一部分受感染的细胞中检测到相同的位点, 从而导致了在复发位点的整合可能会对克隆扩展 1产生积极影响的想法。
为了提高我们对经常性集成站点意义的认识, 必须探索天方集成站点的选择。然而, 若干技术方面阻碍了研究艾滋病毒整合地点的选择及其后果。广泛使用的用于艾滋病毒潜伏期的细胞培养模型, 如 jlat 细胞系, 并不反映临床相关的反复整合位点9。对初级患者衍生细胞的研究一方面, 可以通过测序来描述整合场地景观, 但不允许进行功能分析。据我们所知, 没有足够的实验模型可用于功能分析选定的临床相关的集成站点。
在这里, 我们提供了一个详细的工作流程, 以生成新的模型的艾滋病毒感染使用基于 crispr-cas9 为基础的基因组工程技术。本文描述的工作流程可用于生成 t 细胞衍生的病毒感染模型的记者细胞系, 在选定的集成站点携带基因整合的天方记者。因此, 它们是新的工具, 探讨天长整合站点如何影响艾滋病毒生物学, 以及天长如何应对不同的治疗策略 (例如,延迟反转剂的诱导性)。我们的方法利用了基于 crispr-cas9 的基因组工程的优势, 在目标位置上通过同源重组促进了记者序列的整合。根据对艾滋病毒感染者的研究和为 cas9 介导的基因组工程提供合适的 pam 图案的情况, 选择了整合的目标地点。
在我们的示范性结果中, 我们重点研究了 bach2 基因位点, 它编码为 btb 和 cnc 同源转录调节器2。在接受抗逆转录病毒治疗的慢性艾滋病毒感染者中, bach2 是显示艾滋病毒-1 综合序列3、6、7、8、10的丰富情况之一。我们选择了一个最低限度的艾滋病毒衍生的记者组成的 hiv-1-源长终端重复 (ltr), tdTomato 编码序列, 和牛生长激素 (bgh) 多腺苷信号 (pa), 我们已经针对两个特定的地点在 bovine 内含子5。该协议针对 jurkat 细胞进行了优化, jurkat 细胞是人类 cd4+ t 细胞衍生的悬浮细胞系, 但可以使用其他细胞系, 该协议也相应调整。我们提出了一个详细的工作流程, 选择目标地点, 构建目标载体与同源武器, crispr-cas9 介导的目标的记者进入选定的基因组站点, 生成和选择克隆线, 并进行综合验证新生成的、有针对性的记者细胞系。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里, 我们描述了一个协议, 以生成 hiv-1 衍生 jurkat 记者模型与选择的天方集成站点应用基于 crispr-cas9 的基因组工程。
在规划阶段, 议定书的几个要点需要认真注意。首先, 应仔细选择要针对的位点, 因为某些位点可能比其他位点更容易瞄准 (例如,取决于区域的染色质状态和目标序列本身)。重复序列很难克隆到靶向载体中, 在基因组中通常不是唯一的。用 crispr-cas9 系?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 britta wweeloh 和 bettina abel 的技术援助。我们还感谢 arne düsedau 和 jara hennesen (heinrich pette 研究所流式细胞术技术平台) 的技术支持。
Materials
| pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | vector for expression of SpCas9 and gRNA |
| pMK | GeneArt | mammalian expression vector for cloning | |
| cDNA3.1 | Invitrogen | V79020 | mammalian expression vector for cloning |
| BbsI | New England Biolabs | R0539S | restriction enzyme |
| NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Assembly cloning kit used for target vector generation |
| TaqPlus Precision PCR System | Agilent Technologies | 600210 | DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4) |
| 96-well tissue culture plate (round-bottom) | TPP | 92097 | tissue culture plates for dilution plating |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 L | DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D9170 | dimethyl sulfoxide as PCR additive |
| Magnesium Chloride (MgCl2) Solution | New England Biolabs | B9021S | MgCl2 solution as PCR additive |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions |
| 5PRIME HotMasterMix | 5PRIME | 2200400 | ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11) |
| QIAamp DNA blood mini kit | Qiagen | 51106 | DNA isolation and purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | PCR Purification Kit |
| RPMI 1640 without glutamine | Lonza | BE12-167F | cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum South Africa Charge | PAN Biotech | P123002 | cell culture medium supplement |
| L-glutamine | Biochrom | K 0282 | cell culture medium supplement |
| Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 µg/ml | Biochrom | A 2212 | cell culture medium supplement |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection |
| TransIT-Jurkat | Mirus Bio | MIR2125 | transfection reagent |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | cell culture reagent |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | cell culture reagent |
| Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 µm | Millex | SLGP033RB | filter unit for sterile filtration |
| Heracell 150i incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026280 | tissue culture incubator |
| Amershan Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN1520B | positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | UV crosslinker |
| High Prime | Roche | 11585592001 | kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers |
| illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | chromatography spin-columns for purification of labeled DNA |
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