Summary
I dette manuskript er en protokol præsenteret for at udføre FACS-baserede måling af BK-Polyomavirus transkriptional aktivitet ved hjælp af HEK293T celler transficeret med en tovejs reporter plasmid udtrykker tdtomato og egfp. Denne metode giver yderligere mulighed for at kvantitativt bestemme indflydelsen af nye forbindelser på viral transkriptionen.
Abstract
Polyomaviruser, ligesom BK-Polyomavirus (BKPyV), kan forårsage alvorlige patologier hos immunkompromitterede patienter. Men da der i øjeblikket ikke findes meget effektive antivirale lægemidler, er det nødvendigt at måle, hvilke virkninger potentielle antivirale agenser har. Her blev en dual fluorescens reporter, der tillader analyse af BKPyV non-Coding Control-region (NCCR) drevet tidlig og sen promotor aktivitet, konstrueret til at kvantificere virkningen af potentielle antivirale lægemidler på viral genekspression via tdTomato og eGFP Udtryk. Hertil kommer, ved at klone bkpyv-nccr amplikoner, som i denne protokol er blevet eksemplarisk opnået fra det blod-afledte DNA af immunkompromitterede Nyretransplanterede patienter, virkningen af nccr-rearrangementerne på viral gen udtryk kan bestemmes. Efter kloning af de patient afledte amplicons blev HEK293T celler transficeret med reporter-plasmiderne og behandlet med potentielle antivirale midler. Efterfølgende blev cellerne underkastet FACS-analyse til måling af de gennemsnitlige fluorescens intensiteter 72 h post transfection. For også at teste analysen af lægemidler, der har en potentiel celle cyklus hæmmende virkning, kun transficeret og dermed fluorescerende celler anvendes. Da denne analyse udføres i store T-antigen, der udtrykker celler, kan virkningen af tidlig og sen ekspression analyseres på en gensidigt uafhængig måde.
Introduction
Polyomaviruser repræsenterer en uafhængig familie af små dobbeltstrenget DNA (dsDNA) vira med Simian virus 40 (SV40) som en prototype art. Den primære infektion opstår hovedsageligt i barndommen, som normalt fortsætter uden sygdomssymptomer og normalt forårsage latente infektioner i immunkompetente værter. BK-Polyomavirus (BKPyV) fortsætter hovedsageligt i renale tubuli celler uden at forårsage nefropatologier, men i tilfælde af svækkelse af immun-kompetence efter nyretransplantation virus kan genaktivere og forårsage alvorlige skader og nedsat transplantat Når der opnås en høj observeres (1 x 104 bkpyv DNA-kopier/ml)1,2. Hos ca. 10% af Nyretransplanterede patienter, reaktivering af BK-Polyomavirus (bkpyv) resulterer i en Polyomavirus associeret nefropati (pyvan), som var op til 80% forbundet med en høj risiko for renal allograft fejl3,4 . Da der ikke findes godkendte antivirale midler, er den aktuelle behandling baseret på reduktion af immunsuppression. Interessant, mTOR-hæmmere synes at have en antiviral effekt; således, at skifte den Immunsuppressive behandling til MTOR-baseret immunsuppression kan repræsentere en alternativ tilgang til at forhindre progression af bkpyv observeres5,6,7. Men den mTOR-baserede antiviral mekanisme er i øjeblikket stadig ufuldstændigt forstået. Der kræves således metoder til måling af virkningen af potentielle antivirale stoffer i klinisk relevante koncentrationer.
Bkpyv's cirkulære genom består af ca. 5 KB, der harkedeligt et ikke-kodende kontrolområde (NCCR), som fungerer som et udgangspunkt for replikation og samtidig en tovejs promotor, som kører ekspressionen af tidlige og sene fase mRNA-udskrifter. Da spontant forekommende nccr-rearrangementer, sletninger og duplikationer findes i patogene bkpyv8 og signifikant akkumuleret hos patienter, der lider af pvan5,9, en sammenligning af arketetypiske (WT) og omarrangerede (RR) NCCR-aktiviteter er nyttige til at karakterisere viral replikerende fitness.
Som opsummeret i figur 1beskriver denne protokol en almindeligt anvendt metode til at måle BKPyV NCCR transkriptional aktivitet ved at kvantificere fluorescensen af to fluorophores tdTomato og egfp udtrykt fra en reporter plasmid5, 9,10,11. Proceduren udføres i nærværelse af SV40 store T-antigen (lTAg), som gør det muligt at analysere virkningen af potentielle antivirale midler på den tidlige og sene NCCR-aktivitet separat5. Denne analyse analyserer yderligere virkningen af rearrangementerne på nccr-aktiviteten og sammenligningen med WT-nccrs5,9. Reporter plasmid huser det SV40 sene polyadenyleringssignal nedstrøms for hver fluoroforet åben læse ramme for at sikre sammenlignelig og effektiv behandling af begge udskrifter for henholdsvis tdtomato og egfp. Sammenlignet med QRT-PCR baserede metoder5,12, denne FACS-baserede tilgang repræsenterer en lav pris og høj gennemløb kompatibelt alternativ, da ingen komplicerede ekstraktions protokoller for inficeret cellekultur og ingen dyre antistoffer mod immunfluorescens farvning er nødvendige. Da en defineret mængde fluorescerende celler analyseres via flowcytometri, er analysen af celle cyklus hæmmende midler også mulig på en kvantitativ måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger de retningslinjer for menneskelig forskning, som er godkendt af Ethic Committee af det medicinske fakultet ved universitetet i Duisburg-Essen (14-6028-BO).
1. indsamling af blod-eller urinprøver og isolering af Polyomavirus DNA
- Saml mindst 3 mL blod i EDTA-rør eller urin i erhvervelses rørene.
- Prøven centrifugeres ved 2.500 x g i 15 minutter. Hvis det er nødvendigt, skal du pipettere plasmaet i et nyt rør og opbevare plasmaprøverne ved 4 °C i flere dage eller fryse ved-20 °C for længere opbevaring.
- Forbered 40 μL proteinase K i et 1,5 mL mikrocentrifuge glas, og tilsæt 400 μL plasma ved pipettering.
- Prøven lyse ved tilsætning af 400 μL lysis-buffer, vortex i 15 s og Inkuber i 10 min ved 56 °C.
- Isoler DNA'ET ved hjælp af et DNA-blodudsugnings sæt som beskrevet i producentens anvisninger. Tilsæt kortvarigt alkohol, og læg lysaterne på en spin kolonne, der indeholder en DNA-binding silica-baseret membran. Vask kolonnerne flere gange for at give rent DNA.
- Elute den viste DNA i 30-50 μL TE buffer.
2. forstærkning af ikke-kodnings kontrolområdet (NCCR)
- Udfør følgende procedure i fysisk adskilte rum. Brug et isoleret rum til at tilberede reagenserne og distribuere blandingen til PCR-rørene.
- Forbered Master blandingen til præ-PCR ved hjælp af primer pair A (tabel 1) i et samlet volumen på 50 μl, og brug det tidligere isolerede DNA fra trin 1,6. Pipette Rings skemaet til klargøring af masterblandingen for den præ-og indlejrede PCR er trykt i tabel 2.
- Fordel 45 μL af masterblandingen i PCR-rørene.
- Tilsæt 5 μL af det isolerede DNA i PCR-rørene.
Bemærk: Brug et andet rum end det til Master Mix præparatet for at undgå kontaminering. - Kør PCR med reaktionsbetingelserne som vist i tabel 3. Gentag denaturering, annealing, og udvidelse i 35 cyklusser.
- For den indlejrede forstærkning skal du bruge primer pair B til at harbore begrænsnings stederne for AgeI og SpeI (tabel 1).
- Kør den indlejrede PCR med reaktionsbetingelserne som beskrevet i trin 2,2 til 2,5 ved hjælp af 5 μL af præ-PCR.
- Bland 10 μL af PCR-produktet med 2 μL 6x gel-indlæsnings farve. Læg 10 μL af blandingen på en 1,5% agopstået gel, og Kør gelen i 30 minutter ved 60 mA.
- Visualiser gelen ved hjælp af et passende UV-dokumentationssystem.
Bemærk: størrelsen af amplikonen forventes at være mellem 300-500 BP afhængigt af, om der forekom omsætninger (sletninger, indsættelser eller gentagelser) (figur 2c). - Rense PCR amplikoner ved hjælp af et PCR oprensningssæt i henhold til producentens anvisninger. Elute PCR amplikoner i 30 μl eluering buffer.
- Send amplikoner til sanger sekvensering ved hjælp af primer pair B.
3. kloning af NCCR til dual fluorescens reporter
- De oprensede amplikoner (trin 2,10) fordøje med agei og Spei i 2 timer ved 37 °c som beskrevet i tabel 4.
- Gentag trin 2,10 og rense de fordøjet amplicons.
- Samtidig fordøje også plasmid backbone (1,5 μg) med AgeI og SpeI for 2 h ved 37 °C som beskrevet i tabel 5. Dette trin skal kun udføres én gang. Ved efterfølgende reaktioner fryses fordøjelsen ved-20 °C.
- Analysér det fordøjet plasmid backbone på en 0,8% Low melt aghas gel.
Bemærk: du må ikke køre gelen med en strøm, der er højere end 40 mA. Den forventede indsættelse af spacer-regionen stammer oprindeligt fra plasmid pEX-K4 2-LTR CD313 er 128 BP (figur 2c). - Visualiser DNA-fragmenter ved hjælp af lang bølge UV-lys (320 nm) og skær backbone-båndet ud ved hjælp af en ren skalpel. Overføre Low melt gel-fragmentet til et nyt 1,5 mL mikrocentrifuge glas. Undgå lange UV-eksponeringstider for at forhindre DNA-skader.
Bemærk: da lavsmelte agopstået anvendes, er det ikke nødvendigt at rense DNA før ligationen. - Opvarm rygraden, der indeholder det lavtsmelt ende stykke, i 10 min ved 65 °C for at smelte gelstykket og bland hver 2 min ved blid vortexing. Den smeltede gel kan anvendes direkte til ligering.
- Ligate rygraden og den fordøjet amplikonen ved hjælp af T4 DNA ubiquitinligase over natten ved 16 °c ved hjælp af skemaet vist i tabel 6.
- Udfør transformation i E. coli ved hjælp af varmechok metode, plade bakterier på LB-amp plader, og kultur ved 37 °c i løbet af natten.
- På den næste dag skal du vælge tre positive kloner og forberede natten over E. coli -kulturer (5 ml LB-amp) og kultur ved 37 °c.
- Isoler plasmid-DNA ved hjælp af standardprotokoller som beskrevet andetsteds14, udføre Agei og Spei fordøjelse for at kontrollere for positive kloner og visualisere skåret ud fragmenter på en 1% agopstået gel. Spacer-båndet (128 BP) vil blive erstattet af den større NCCR-sekvens (300-500 BP, se ovenfor).
- Send plasmid til sanger sekvensering ved hjælp af primer EGFP-N eller primer pair B (tabel 1).
- Da mutationer kan forekomme spontant, Sammenlign sekvensering resultater med sekvensering resultater opnået med amplicon. Brug kun kloner, der indeholder identiske sekvenser sammenlignet med amplicon.
- Brug et molekyle Workbench-software (f. eks. freeware GENtle 1.9.4 eller andre sekvens redigeringsprogrammer) til at justere og redigere de opnåede sekvenser (figur 3).
- Start blid 1.9.4 og Importer DNA-sekvenserne ved at klikke på knappen Importer (grøn pil ned).
- Næste Klik på værktøjet og vælg justering fra menuen (Brug CTRL + G som en genvej) og vælg DNA-sekvenser til justering.
- Tilføj en sekvens til justeringen ved at klikke på Tilføj eller fjern en sekvens ved at klikke på Fjern. Medtag en arketetypisk NCCR konsensus sekvens som JN19243815, brug ikke nccr-sekvens fra den almindeligt anvendte Dunlop-stamme16, da det havne omarrangementer og duplikationer andre end den Arketetypiske bkpyv Stammer.
Bemærk: NCCR indeholder allerede den translationelle start codon (figur 3). - Vælg en metode til justering ved at klikke på algoritme i værktøjslinjen og vælg Clustal W. Indstil justerings parametrene til at matche 2; Gap Extension sanktion-1; Gap straf-2 og klik på OK for at køre tilpasningen.
4. forbigående transfektering af HEK293T celler med indberetteren plasmid og behandling med potentielle antivirale midler
- For at forberede tilstrækkelige mængder plasmid DNA til efterfølgende transfektering eksperimenter forberede en 150 ml overnight kultur. Isoler plasmid-DNA ved hjælp af et plasmid-isolationssæt. Alternativt kan andre plasmid oprensningssæt anvendes.
- Frø 1 x 105 HEK293T celler i DMEM indeholdende 10% FCS, penicillin og streptomycin (1x) pr. brønd af en 12-brønd plade 24 h før transfektering og Inkubér natten over ved 37 °c og 5% Co2 for at opretholde aktiv spredning under transfektering.
Bemærk: cellerne skal være ca. 80% flydende ved transfection. - Placer 250 μL reducerede serum medier i et sterilt rør, og tilsæt 1 μg af hver reporter plasmid-DNA, og bland forsigtigt ved pipettering.
- Tilsæt 3 μl transfektering reagens til DNA-blandingen, bland forsigtigt ved pipettering og Inkuber i 15 min. før varme transfektering reagens til den omgivende temperatur på 22 °c og vortex forsigtigt før brug.
- Tilsæt blandingen drop-Wise til brøndene og forsigtigt distribuere til brønden.
- Efter 4 h, Udskift supernatanten med frisk medium indeholdende test agenter og solvent Control. Inkuber ved 37 °C indtil analyse. I dette eksempel blev mTOR-hæmmere INK128 (100 ng/mL) og Rapamycin (100 ng/mL) anvendt.
5. Fluorescens mikroskopi og strømnings cytometri
- Kontroller cellerne for den røde og grønne fluorescens under fluorescens mikroskop (figur 4).
Bemærk: rød og grøn fluorescens svarer til henholdsvis det tidlige og sene BKPyV-genekspression. - Efter 72 h post transfection, aspirere supernatanten og vaske cellerne to gange med 1 mL kold PBS.
- Tilsæt forsigtigt 500 μL trypsin, og drej pladen en smule for at undgå for tidlig løsrivelse af cellerne. Dette trin er vigtigt for at undgå celle doublets.
- Efter tilsætning fjernes trypsin direkte med samme pipettespids.
- Cellerne inkubates i mindst 5 minutter ved 37 °C.
- Opslæmning af trypsinerede celler med 1 mL PBS indeholdende 3% FCS og overførsel af suspensionen i præ-mærkede FACS-rør.
- Tilføj DAPI (1 μg/mL) før FACS-analysen.
- Analysér cellerne ved hjælp af et flow-cytometer. For hver prøve måles mindst 10.000 levende celler, som er negative for DAPI-farvning.
6. data analyse
- Importer dataene til flowcytometry Analysis-softwaren, og Tilføj eksempler ved at klikke og trække ind i arbejdsområdet.
- Dobbeltklik på den importerede fil og oprette en graf plot. Vælg FSC-A versus SSC-A ved at klikke på x-og y-aksen. Gate den vigtigste celle befolkning ved at klikke på polygon på værktøjslinjen og indramning celle populationen (figur 5). Navngiv den valgte cellepopulation efter behov (f. eks. "enkeltceller"). De "enkelte celler" vises som et nyt arbejdsområde.
- Fortsæt med at gating "enkeltceller" for DAPI negative (dvs., "levende celler"). At identificere levende celler sammenligne celle populationen med og uden DAPI farvning. I begge parceller vælger FSC-A versus Pacific-Blue-A.
- Klik på rektanglet og vælg DAPI negativ cellepopulation, navngiv den valgte cellepopulation "levende celler", og Opret et nyt prik-plot, der viser FITC (eGFP) versus PE (tdTomato) som beskrevet før.
- Tilføj kvadranter i "levende celler" ved at vælge quad fra værktøjslinjen. Gate befolkningen ved at trække midten af kvadrant til kanten af hver population. Kvadranterne repræsenterer 1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM +, 3) egfp + tdTOM-, 4) eGFP + tdTOM +.
Bemærk: på grund af spektral overlejring af emissions spektre mellem FITC og PE er første kompensation afgørende for at skelne mellem røde og grønne signaler og for at opnå nøjagtige resultater. - Bestem gennemsnitlige fluorescens intensiteter (MFI'er) ved at højreklikke på kvadrant og vælge Tilføj statistik. Vælg middel , og klik på OK. Den gennemsnitlige MFI vises nu under populationen i afsnittet "Statistik". Kvadranter 2 og 4 svarer til et tidligt udtryk, mens kvadrants 3 og 4 repræsenterer et sent udtryk.
- Tilføj yderligere replikater på samme måde for statistisk effekt.
- For data fortolkning plot MFI-værdier af tidligt og sent i en bar Plot:
- For at sammenligne NCCR-aktiviteter opnået fra forskellige donorer eller virusstammer, tilføje en arketonpisk kontrol eller Dunlop stamme16 og sætte sine relative MFI'er til 100%, og beregne de relative MFI-værdier. Gentag med hver replikat, og bestem middel og standardafvigelse.
- For at evaluere en effekt af potentielle forbindelser på transkriptional aktivitet, indstille solvent-Control til 100% og plot MFI af de behandlede celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette repræsentative eksperiment blev BK-Polyomavirus-den ikke-kodende kontrol region drevet transkriptional aktivitet målt via flowcytometri. Desuden blev en mTOR-hæmmer, som kan anvendes til behandling af patienter efter reaktivering af BKPyV, testet for sin hæmning af det virale tidlige genudtryk. Til dette formål blev der anvendt en dobbelt fluorescens-reporter-analyse som offentliggjort tidligere5. Det overordnede arbejdsgangs skema for den eksperimentelle opsætning illustreres i Figuren 1. For det første blev blodprøver fra immunkompromitterede Nyretransplanterede patienter indsamlet i henhold til retningslinjerne for menneskelig forskning som godkendt af den institutionelle etiske komité. Blodet blev opsamlet i EDTA-holdige rør, og faserne blev udskilt ved centrifugering. Efterfølgende blev 400 μL plasma anvendt til isolering af Polyomavirus DNA. Den ikke-kodende kontrol region (NCCR) blev forstærket ved hjælp af en indlejret-PCR-protokol som illustreret i figur 2a ved hjælp af det ydre primer-par BKV-CR-1fw og BKV-CR-1rv, samt, den indre primer pair BKV-CR-2Fw-Agei (primer agei) og BKV-CR-2Rv-Spei ( Primer SpeI)17, hvoraf sidstnævnte huser restriktions stederne for agei og Spei. Amplikonen-verifikationen blev udført via agrose gel elektroforese som vist i figur 2b. Mens amplikoner afledt af arketræpiske nccr-sekvenser (WT) havde en homogen størrelsesfordeling i gelen, var dem, der stammede fra omarrangerede nccrs med indsættelser (RRins) og sletninger (RRdel), forskellige i deres størrelse (ca. 300-500 BP). Især på grund af omarrangementerne var Dunlop NCCR referencesekvens16 (DUN), som var inkluderet som kontrol, større end nccr opnået fra arketetypiske vira. Da amplikoner svarede til de forventede størrelser, blev de rensede PCR-produkter sendt til sanger sekvensering til senere sammenligning med sekvenserne klonet ind i reporter plasmid til yderligere analyse.
Til kloning af amplicons blev fordøjelsen udført ved hjælp af de to restriktionsenzymer AgeI og SpeI. Efter kloning i Dual fluorescens reporter, som blev udført ved hjælp af standard klonings proceduren, blev udvælgelsen af positive kloner, der indeholdt NCCR, verificeret af AgeI og SpeI-fordøjelsen (figur 2c). Her blev den lille spacer region (NC, 128 BP) erstattet af de større NCCR-fragmenter (ca. 300-500 BP), der indikerer positive kloner. Plasmid DNA isoleret fra verificerede kloner blev sendt til sanger sekvensering og sammenlignet med sekvenser opnået fra amplikonen sekventering (ikke vist). Kun de kloner, der matcher amplikonen sekvensen blev valgt til videre behandling. Som vist i figur 3blev resultaterne af sekvensering sammenlignet med en arketetypisk NCCR-SEKVENS (JN192438). I dette eksempel blev der registreret en sletning i P-blokken og en substitution i O-Block.
For efterfølgende at afprøve den transkriptionelle aktivitet af de klonede NCCR-sekvenser i cellekulturen blev HEK293T-cellerne overført i transit med de respektive reporter-konstruktioner (figur 4a). Som visualiseret i figur 4bblev transfektering-effektiviteten og nccr-aktiviteten overvåget via Fluorescens mikroskopi. Rød og grøn fluorescens svarede til tidligt og sent BKPyV genekspression, henholdsvis5. Cellerne udtrykte både fluorophorer, der indikerer effektiv tidlig og sen promotor aktivitet. Som illustreret af de to eksempler viste den første NCCR (NCCR1) et stærkt sent genekspression, mens det andet eksempel (NCCR2) havde et relativt stærkt tidligt, men moderat sent genekspression (figur 4b). Prøverne blev således forberedt til måling af strømnings cytometri. Som beskrevet i protokol afsnit 6, DAPI negative celler blev gated (figur 5a, lavere panel) og en prik plot blev oprettet viser egfp versus tdTomato. Prøver, der var negative (figur 5b), såvel som positive for tdTomato (figur 5C) eller Egfp (kunfigur 5D), indgik i analysen. Bemærk, første kompensation blev udført, hvilket er afgørende for at skelne røde og grønne signaler og for at opnå nøjagtige resultater18. De gennemsnitlige fluorescens intensiteter blev udledt fra hver test klon. Her svarede tdTomato positive celler til tidligt udtryk, mens eGFP positive celler repræsenterede sent udtryk. I dette eksempel blev behandlingen med Dual mTOR-hæmmeren INK128 signifikant reduceret tdTomato MFI (figur 5E-F), hvilket betyder, at tidlig ekspression blev hæmmet.
Figur 1 : Arbejdsgangs skema for den eksperimentelle opsætning. 1) indsamling af blod (alternativt urin) prøver, 2) isolering af Polyomavirus DNA 3) forstærkning af ikke-kodning kontrol region (nccr) ved hjælp af en indlejret-PCR protokol, 4) agrose gel elektroforese og amplikonen verifikation, 5) sanger SEKVENSERING af PCR amplicon, 6) kloning af nccr i Dual fluorescens reporter ved hjælp af Agei og Spei, 7) udvælgelse af positive kloner, 8) sanger sekvensering af plasmid DNA, 9) Forbigående transfektering af HEK293T celler med indberetteren plasmid og tilsætning af forbindelser, der skal testes, 10) Fluorescens mikroskopi for at verificere effektiv transfektering, 11) flow cytometri-analyse, 12) gating og analyse af eGFP tdTomato Expression, 13) data tolkning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : INDLEJRET PCR og repræsentativ analyse af patient afledte NCCR-amplicons. A) DNA afledt af immunkompromitterede nyre transplantationpatienter blev underkastet semi-indlejret PCR-forstærkning ved anvendelse af oligonukleotidprimere forbundet med restriktionssteder agei og Spei. Primer-navne og længde (basis par) af arketetypiske O, P, Q, R og S-blokke fra BKPyV Strain JN192438 er angivet i parentes. B) amplicons blev analyseret ved elektroforese i 1,5% agopstået gel og visualiseret ved hjælp af DNA-farvning. M1 = 100 BP stige, WT = dværg (arketræpisk), RR = omarrangeret, ins = indsættelser, del = sletninger, dun = Dunlop stamme. C) plasmid fordøjelse med agei og Spei. Ford øjede fragmenter blev analyseret ved elektroforese i 1,5% agopstået gel og visualiseret ved hjælp af DNA-farvning. M1 = 100 BP stige, m2 = 2-log stigen. NC = negativ kontrol (spacer). + = positiv klon. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Kloning og validering af NCCR i Dual fluorescens reporter. Repræsentative resultater af plasmid-sekvensering. Amplicons blev renset ved hjælp af en PCR rensning kit og udsat for sanger sekvensering. De respektive sekvenser blev justeret til NCCR-sekvensen afledt af arketetypisk BKPyV stamme JN192438. Sletninger og erstatninger er markeret med rødt. AgeI-og SpeI-restriktions stederne, translationel start af eGFP-åben læse ramme (trykt med fed skrift) samt NCCR-blokke O-S er indikeret. De respektive blokke og restriktions stederne er fremhævet i farver. Længden af hver NCCR-blok i basis par udskrives i kantede parenteser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Repræsentativ analyse af Fluorescens mikroskopi af tidlig og sen NCCR-promotor-aktivitet. A) gen kort over Dual fluorescens reporter under kontrol af tovejs promotoren. Som beskrevet tidligere5 huser plasmid PTA-tdTOM-nccr-egfp (6.009 BP) det SV40 sene polyadenyleringssignal nedstrøms for hver udtryks kassette for at sikre sammenlignelig og effektiv behandling af begge udskrifter for tdTomato (Early (ultimo udtrykket) og eGFP (sent udtryk). NCCR er flankeret af AgeI og SpeI. Vektoren indeholder en ampicillin modstand kassette til udvælgelse under kloning procedure. B) HEK293T celler blev transficeret med Dual-fluorescens reporter konstruktioner hver under kontrol af patient afledte NCCR-SEKVENSER (NCCR1-2). Celler blev udsat for lysfelt og Fluorescens mikroskopi analyse 72 h post transfection. Filter indstillingerne for mikroskopet blev anvendt i følgende excitation intervaller: grøn for tdTomato (515-560 nm) og blå for eGFP (450-490 nm). Skala bjælken (200 μm) er angivet nederst til højre i hver fotografering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Repræsentative FACS-analyser. Vist er den enkle gating strategi, der kræves for denne metode. Der anvendes to-parametertæthed eller dot-plot. A) for det første er FSC plottet mod Pacific Blue, mens kun dapi negative (dvs., levende celler) er yderligere behandlet. B-F) FITC (eGFP) i forhold til PE (tdTomato) afbildes. C-D) Tilsæt udelukkende grønne og røde fluorescerende celler for at justere kompensationen på flowcytometer. E-F) I dette eksempel INK128 mTOR inhibitorer og reducerer signifikant tdTomato MFI, hvilket svarer til en reduktion af BKPyV tidlige genekspression. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Primer-navn | Sekvens (5 ' → 3 ') |
| BK-CR-fwd1 | CCCAGGCAGCTCTTTCAAGGC |
| BK-CR-REV1 | CCTCTAACAAAATTCCAGCAAAAGC |
| BKV-CR-2-FW-AgeI | AAAAAAAccggtttttgcaaaaattgcaaaagaatagg |
| BKV-CR-2-RV-SpeI | TTTTTTActagtctggcgcagaaccatggcctt |
| EGFP-N | CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG |
Tabel 1: Oligonukleotider, der anvendes i denne protokol. De understregede baser angiver restriktionsenzym stederne for henholdsvis AgeI og SpeI.
| Komponent | Volumen/reaktion (μl) | endelig koncentration |
| RNase-frit vand | 32,8 μL | - |
| 10x PCR buffer | 5 μL | 1x |
| dNTPs (10 mM af hver) | 1 μL | 0,2 mM af hver dNTP |
| FWD-primer (10 μM) | 3 μL | 0,3 μM |
| Rev-primer (10 μM) | 3 μL | 0,3 μM |
| Taq polymerase | 0,2 μL | 2 enhed/reaktion |
| Template DNA | 5 μL | < 0,5 μg/50 μL reaktion |
Tabel 2: Master Mix Preparation Protocol. Instruktionen gælder for både præ-og indlejrede PCR-reaktioner som beskrevet i henholdsvis trin 2,2 og 2,7.
| Temperatur | Varighed | PCR-Step | Cykler |
| 95 °C | 5 min | Indledende denaturering | |
| 95 °C | 30 sek | Denaturering | |
| 55 °C | 34 sek | Udglødning | x35 |
| 72 °C | 1 min | Udvidelse | |
| 72 °C | 10 min | Endelig udvidelse | |
| 4 °C | ∞ | Køling |
Tabel 3: PCR-program, der anvendes til NCCR-forstærkning. Instruktionen gælder både for præ-og indlejrede PCR-reaktioner.
| Reagens | Volumen/reaktion (μl) | endelig koncentration |
| DNase-gratis H20 | 6 | til 20 μl |
| 10x buffer | 2 | 1x |
| AgeI | 1 | 10 enheder |
| SpeI | 1 | 10 enheder |
| renset PCR-amplicon | 10 | Variabel |
Tabel 4: Amplicon fordøjelse protokol. Instruktionen gælder for samtidig fordøjelse af amplikonen DNA med to restriktionsenzymer beskrevet i trin 3,1.
| Reagens | Volumen/reaktion (μl) | endelig koncentration |
| DNase-gratis H20 | 14,5 | til 20 μl |
| 10x buffer | 2 | 1x |
| AgeI | 1 | 10 enheder |
| SpeI | 1 | 10 enheder |
| Plasmid backbone (1 μg/μL) | 1,5 | 1,5 μg |
Tabel 5: Plasmid fordøjelse protokol. Instruktionen gælder for samtidig nedbrydning af plasmid-DNA-rygraden med to restriktionsenzymer beskrevet i trin 3,3.
| Reagens | Volumen/reaktion (μl) | endelig koncentration |
| DNase-gratis H20 | 7 | til 20 μl |
| T4 DNA-ubiquitinligase | 1 | 20 |
| 10x T4 DNA-ubiquitinligase buffer | 2 | 1x |
| Renset plasmid backbone Low melt fortyndet 1/2 fra trin 3,5 |
2 | Variabel |
| Fordøjet og renset PCR-amplicon fra trin 2,7 | 8 | Variabel |
Tabel 6: Plasmid ligationprotokol. Instruktionen gælder for ligationen af plasmid-DNA-rygraden med den fordøjet PCR amplikonen DNA, der er beskrevet i trin 3,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikel præsenteres en almindeligt anvendt metode, der giver mulighed for analyse af BKPyV non-Coding Control-region (NCCR) drevet tidlig og sen promotor aktivitet. Nccr-aktiviteten kan måles samtidigt og behøver ikke lyse af de transficeret celler. Desuden kan et relativt stort antal celler analyseres og co-transfection af yderligere markører for normalisering af fluorescens værdier er ikke nødvendig.
En kritisk del af denne metode er, at den klonede nccr bør indeholde nøjagtig de samme sekvenser som identificeret ved amplikonen sekvensering, hvilket svarer til de fleste varianter til stede i patientens plasma. For at opnå nøjagtige resultater og for at minimere PCR-tilbøjelige fejl anbefales det stærkt at bruge en polymerase med korrekturlæsning aktivitet. Alternativt kan sekvenser bestilles ved kommercielle gensyntese tjenester. De udpegede nccr-sekvenser kan bestilles, herunder ledsage agei-og Spei-begrænsnings steder til direkte kloning. I dette tilfælde skal du fordøje plasmid parallelt med backbone plasmid og udskifte afstandsstykket med det tilsvarende NCCR-fragment fra syntetiseret konstruktion. DNA kan alternativt isoleres fra urinprøver. Men da BKPyV også udskilles i urin af immunkompetente individer og ikke nødvendigvis afspejler aktiv replikation, er den kliniske relevans begrænset. Ideelt set kan DNA også isoleres fra nyre biopsier, hvor tidligere PVAN kunne være histologisk detekteret (Sammenlign med Korth et al., 201919).
Ved at måle den gennemsnitlige fluorescens intensitet af grønne og røde fluorescerende celler gør denne metode det muligt at kvantificere den nccr-afledte fluorescens/aktivitet uden bias af transfektering effektivitet og anti-proliferative virkninger af de testede agenser (f. eks. Dual MTOR hæmmere INK128 eller PP242)5.
En anden anvendelse af reporter-systemet er muligheden for at analysere konsekvenserne af indsættelser, sletninger eller gentagelser i NCCR fundet i kliniske isolater på den tidlige og sene promotor aktivitet. I tidligere undersøgelser er Immunsuppressive midler blevet undersøgt for at moduere NCCR-aktivitet; der blev imidlertid ikke fundet nogen mutationer eller NCCR-rearrangementer, som påvirker modtagelighed. Mutationer kan dog påvirke reaktionen af nye stoffer, der kan blive godkendt i den nærmeste fremtid.
Dette kan være relevant, da det i modsætning til kodnings områderne Large T-antigen eller VP1 kapsid-protein, nccr som navnet antyder, repræsenterer en ikke-kodnings region og dermed ikke ligger til grund for selektivt pres på aminosyre niveau.
I denne protokol er udvælgelsen af positive kloner, der indeholder NCCR, verificeret af AgeI og SpeI-fordøjelsen. En koloni PCR kan imidlertid repræsentere en alternativ metode til hurtigt at screene for NCCR-skær direkte fra E. coli belagt på agar plader. Til denne fremgangsmåde anvendes primer pair BKV-CR-2-FW-AgeI og EGFP-N (tabel 1). Efter transfection kontrolleres celler for rød og grøn fluorescens ved hjælp af Fluorescens mikroskopi (figur 4). Alternativt kan cellerne fastgøres med 3% PFA i 20 minutter ved 22 °C. I dette tilfælde vaskes med PBS, tilsættes 0,2% ikke-ionisk rengøringsmiddel i PBS og Inkuber i 10 min. faste celler kan derefter farves med DAPI i PBS (1 μg/mL) i 10 min ved 22 °C og underkastes Fluorescens mikroskopi analyse og visualiseret med UV-lys (340-380 nm).
Da begge fluorophorer havne de samme polyadenylering signaler, en effekt af polyadenylering effektivitet kan være ude regeret. Men i forhold til eGFP, tdTomato er en dikemer protein, som skal tilsvarende transskriberet til en længere mRNA (kodning sekvens: 745 versus 1431 BP, hhv.). Men da aktiviteten af initiativtagerne fra cellerne behandlet med interfererende stoffer altid sammenlignes i forhold til ubehandlet (DMSO) celler, denne forskel spiller ringe rolle. På grund af tilstedeværelsen af oprindelsen af replikation, transfektering af indberetteren plasmid i celler stabilt udtrykker SV40PyV store T-antigen tillader overførsel af plasmider til datter cellerne. Det er blevet påvist, at det SV40 afledte store T-antigen kan transaktivere SV40 og BKPyV NCCR og viral DNA-replikation20. Men da et stort T-antigen også er involveret i overgangen fra den tidlige til den sene fase af infektionen, en kunstig situation er givet. Ved hjælp af denne analyse skal det tages i betragtning, at det mest Replikerings begrænsende trin er det tidlige udtryk, der fører til ekspression af stort T-antigen. For at kunne tilknytte den komplette replikeringscyklus skal de tidlige og sene mRNAs måles i inficerede celler af QRT-PCR som beskrevet andetsteds5,12.
En sammenlignelig metode er allerede blevet anvendt af schweiziske og tyske grupper til at analysere arketonisk og omarrangerede bkpyv nccr-afledte promotor-aktiviteter, omend med selvstændigt klonede vektorsystemer5,9. Gosert og kolleger fra Basel brugt en lignende metode til at bestemme nccr promotoren aktivitet af bkpyv og jcpyv stammer9,10,11. Begge metoder anvendt eGFP til grøn fluorescens; Basel-koncernen brugte imidlertid RFP, mens tdTomato i den nuværende protokol blev anvendt til rød fluorescens. Fordelen ved tdTomato over RFP er den meget højere foto stabilitet; Men, den dimeriske protein er kodet af en sekvens, der er dobbelt så lang som RFP21. Desuden kan halverings formen af proteinerne være forskellige, hvilket resulterer i ulige koncentration 72 h post transfection. Dette problem kan dog kun være relevant ved direkte sammenligning af begge fluorescens intensiteter. Gosert et al. brugte bamhi og noti som restriktionssteder i den nuværende protokol er agei og Spei ledsage af nccr-sekvensen. Ved hjælp af begge metoder gav referencen Dunlop stamme16 sammenlignelige fluorescens mønstre med stærk tidlig, men svag, forsinket promotor-aktivitet9,10. I yderligere enighed resulterede nccr-rearrangementerne med indsættelser i P-regionen i en signifikant stigning i tidlig og sen promotor aktivitet sammenlignet med WT-nccr5,9.
Selv om det har vist sig, at det SV40 afledte store T-antigen kan transaktivere SV40 og BKPyV afledte NCCRs20, det kan være interessant at bruge humane celler, der stabilt udtrykker det store t-antigen af bkpyv og ikke prototypen virus SV40 i fremtidige undersøgelser . I dette tilfælde skal celle linjen dog være let at transficere (f. eks. HEK293).
Da NCCR-initiativtagerne til polyomaviruser er meget ens, kan denne metode også anvendes (med lille tilpasning i primer-sekvenser) til at undersøge promotoren aktivitet og indflydelsen af potente antivirale midler på aktiviteten af JC-Polyomavirus (JCPyV) afledte ikke-kodnings kontrolområder11. Da JCPyV er det udløsende middel for den progressive multifokale leukoencefalopati (PML), en sjælden sygdom i centralnervesystemet, der sjældent kan forekomme hos patienter med immundefekt, som resulterer i svær neuropatologi, er der også et presserende behov for at finde direkte virkende antivirale stoffer til behandling af immunkompromitterede patienter. Interessant, rearrangementerne findes også i JC NCCRs11. Da JCPyV har udtalt neurotropisme, og der således findes store mængder vira i spiritus, skal prøve anskaffelsen justeres til det spiritus afledte DNA. Efterfølgende trin kan dog let tilpasses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Johannes Korth har modtaget tilskud til højttalerens honorar og rejseudgifter fra Astellas og Novartis. Marek Widera har modtaget konsulenthonorarer fra Novartis. Oliver Witzke har modtaget tilskud til kliniske studier, højttalerens honorar, honorarer og rejseudgifter fra Amgen, alexion, Astellas, Basilea, biotest, Bristol-Myers-Squibb, correvio, chiesi, Gilead, Hexal, Janssen, Dr. F. Köhler Chemie, MSD, Novartis, Roche, Pfizer, Sanofi og TEVA.
Acknowledgments
Forfatterne takker Barbara Bleekmann for fremragende teknisk assistance. Disse undersøgelser blev støttet af IFORES-programmet for universitetet i Duisburg-Essen Medical School og RIMUR-programmet for University Alliance Ruhr og Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). Forfatterne takker Jürgen-Manchot-Stiftung for det ph. d.-stipendium, som Helene Sertznig og den konstante støtte har. Indsamlingen og anvendelsen af patientmateriale er blevet godkendt af den etiske komité for det medicinske fakultet ved universitetet Duisburg-Essen (14-6028-BO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
References
- Drachenberg, C. B., et al. Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load. American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).
- Korth, J., et al. Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function. Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).
- Hirsch, H. H., et al. European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation. Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).
- Masutani, K., et al. The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome. American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).
- Korth, J., et al. Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region. Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).
- Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12. Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).
- Sanchez Fructuoso, A. I., et al. Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients. Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).
- Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis. Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).
- Gosert, R., et al. Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology. Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).
- Bethge, T., et al. Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression. Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).
- Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate. Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).
- Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression. American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).
- Widera, M., et al. HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia. Medical Microbiology Immunology. , (2017).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).
- Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland. Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).
- Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals. Virology. 198 (1), 59-70 (1994).
- Teutsch, K., et al. Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy. Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).
- Korth, J., et al. The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation. Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).
- Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens. Virology. 152 (2), 459-465 (1986).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
