Summary
Bu yazıda, tdTomato ve eGFP 'i ifade eden bir çift yönlü muhabir Plasmid ile nakledilmiş HEK293T hücrelerini kullanarak BK-polyomavirus transkripsiyon aktivitesinin FACS tabanlı ölçümünü gerçekleştirmek için bir protokol sunulmuştur. Bu yöntem daha da Nicek viral transkripsiyon üzerinde yeni bileşiklerin etkisini belirlemek için izin verir.
Abstract
BK-polyomavirus (BKPyV) gibi polyomaviruses, bağışıklık sistemini tehlikeye atılan hastalarda şiddetli patolojilere neden olabilir. Ancak, son derece etkili antiviral Şu anda mevcut olmadığı için, potansiyel anti-virüs ajanların etkisini ölçme yöntemleri gereklidir. Burada, BKPyV kodlama olmayan kontrol bölgesinin (NCCR) erken ve geç organizatörü aktivitesinin analizine izin veren bir çift floresan muhabiri, potansiyel antiviral ilaçların tdTomato ve eGFP aracılığıyla viral gen ifadesinde etkisini ölçmek için inşa edildi Ifa -de. Buna ek olarak, bu protokolde, immünolojili renal nakledilen hastaların kan türeği DNA 'sından örnek olarak elde edilen bkpyv-nccr amplikonlar klonlayarak, nccr-redüzenlemeleri viral gen ifadesi üzerine etkisi tespit edilebilir. Hasta türevi amplicons klonlama sonrasında, HEK293T hücreler muhabiri-plazmids ile transferleştirilmiş ve potansiyel antiviral ajanlar ile tedavi edildi. Daha sonra hücreler, ortalama floresans yoğunlukları 72 h Post transfeksiyon ölçümü için FACS-analizine tabi tutulmuştur. Ayrıca potansiyel bir hücre döngüsü inhibe etkisi olan ilaçların analizini test etmek için, sadece transfekte ve böylece floresan hücreler kullanılır. Bu tahlil büyük T antijeni hücre ifade gerçekleştirildiği için, erken ve geç ifade etkisi karşılıklı bağımsız bir şekilde analiz edilebilir.
Introduction
Polyomaviruses küçük çift telli DNA bağımsız bir aile temsil (dsDNA) Simian virüsü 40 ile virüsler (BAZıLARıNDA SV40) bir prototip türü olarak. Primer enfeksiyon çoğunlukla çocukluk çağında oluşur, genellikle hastalık belirtileri olmadan devam ve genellikle bağışıklık yetkili konaklarında gizli enfeksiyonlara neden. BK-polyomavirus (BKPyV), renal tübüller hücrelerinde nefropatolojilere neden olmadan çoğunlukla devam eder, ancak böbrek nakli sonrasında bağışıklık-yetkinliğin bozulması durumunda virüs yeniden etkinleştirebilir ve şiddetli zararlar verebilir ve greft bozulması yüksek viremi ulaştığında fonksiyon (1 x 104 bkpyv DNA kopyaları/ml)1,2. Böbrek nakli alıcılarının yaklaşık% 10 ' unda, BK-polyomavirüsdür (bkpyv) ' ın yeniden aktivasyonu, renal allogreft arızaları yüksek riskiyle ilişkili% 80 ' a kadar olan polyomavirüsdür Associated nefropati (pyvan) ile sonuçlanır3,4 . Hiçbir onaylı antiviral ajanlar mevcut olduğundan, mevcut tedavi immünerbastırma azaltılması dayanmaktadır. İlginçtir, mTOR inhibitörleri bir antiviral etkiye sahip gibi görünüyor; Bu nedenle, immünpresif tedavisini mTOR bazlı immünerimoterapi ile değiştirmek, bkpyv viremi5,6,7' nin ilerlemesini önlemek için alternatif bir yaklaşım gösterebilir. Ancak, mTOR tabanlı antiviral mekanizması şu anda hala tamamen anlaşılır. Böylece potansiyel antiviral ajanların klinik olarak ilgili konsantrasyonlarda etkisini ölçen Yöntemler gereklidir.
BKPyV 'in dairesel genomu, çoğaltmanın kökeni olarak hizmet veren ve erken ve geç faz mRNA transkriptinin ifadesini kullanan çift yönlü bir promotör olan bir kodlama olmayan kontrol bölgesini (NCCR) barındıran yaklaşık 5 KB 'den oluşur. Nccr-redüzenlemeler, silmeler ve çoğaltmalar ortaya çıktığı için patojenik bkpyv8 ' de bulunan ve pvan5,9, arketipsel (WT) bir karşılaştırma muzdarip hastalarda önemli ölçüde birikmiş yeniden düzenlenmiş (RR) NCCR-faaliyetler viral çoğaltıcı Fitness karakterize etmek yararlıdır.
Şekil 1' de özetlendiği gibi, bu protokol, bir muhabirin Plasmid5' den ifade edilen iki fluorophores tdtomato ve EGFP floresans ölçerek bkpyv nccr transkripsiyonel etkinliğini ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemi açıklar, 9,10,11. Prosedür, potansiyel antiviral ajanların erken ve geç NCCR-aktivite ayrı5üzerinde etkisini analiz etmek için ızın veren bazılarında SV40 büyük T antijeni (LTag), varlığında gerçekleştirilir. Bu tahlil daha nccr aktivite ve WT-nccrs ile karşılaştırma üzerinde yeniden düzenlemeleri etkisini analiz5,9. Muhabir plazmid, her bir fluorophore açık okuma çerçevesinin bazılarında SV40 geç Poliadenilasyon sinyallerini, sırasıyla tdtomato ve EGFP için her iki transkriptin karşılaştırılabilir ve verimli bir şekilde işlenmesini sağlamak için harborlar. QRT-PCR tabanlı yöntemler5,12ile karşılaştırıldığında, bu FACS tabanlı yaklaşım, virüslü hücre kültürü için karmaşık ayıklama protokolleri olmadığından ve pahalı olmayan bir düşük maliyetli ve yüksek verimlilik uyumlu alternatifi temsil eder bağışıklık floresan boyama için antikorlar gereklidir. Ayrıca, tanımlanan bir miktar floresan hücre Akış sitometrisi aracılığıyla analiz edildiğimden, hücre döngüsü inhibe edici ajanların analizi de nicel bir şekilde mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, Duisburg-Essen (14-6028-BO) Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Komitesi tarafından onaylanan insan araştırmaları yönergelerini takip eder.
1. kan veya idrar numunelerinin toplanması ve polyomavirüsdür DNA 'sı yalıtımı
- EDTA tüpleri veya idrar edinme tüplerinde en az 3 mL kan toplayın.
- Numuneyi 2.500 x g 'de 15 dakika santrifüjün. Gerekirse, plazmayı yeni bir tüpte pipet ve plazma örneklerini birkaç gün boyunca 4 °C ' de saklayın ya da daha uzun süreli depolama için-20 °C ' de dondurur.
- 40 μL proteinaz K 'yi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne hazırlayın ve pipetleme ile 400 μL plazma ekleyin.
- 400 μL lizis tampon ekleyerek, 15 s için Vortex ve 56 °c ' de 10 dakika boyunca inkübe ederek numune Lyse.
- DNA 'yı, üreticinin talimatında açıklandığı gibi bir DNA kan ekstraksiyon kiti kullanarak izole et. Kısaca, alkol ekleyin ve DNA bağlayıcı silika bazlı membran içeren bir spin sütun üzerine endoglikozidazları yükleyin. Saf DNA verim için birkaç kez sütunları yıkayın.
- 30-50 μL TE tampon olarak elde edilen DNA 'Yı elute.
2. kodlama olmayan kontrol bölgesinin (NCCR) amplifikasyon
- Fiziksel olarak ayrılmış odalarda aşağıdaki yordamı gerçekleştirin. Reaktifleri hazırlamak ve karışımı PCR tüplerine dağıtmak için izole edilmiş bir oda kullanın.
- Pre-PCR için Master Mix + 50 μL toplam hacimde primer çifti A (Tablo 1) kullanarak hazırlayın ve daha önce yalıtılmış DNA adım 1,6 kullanın. Pre ve Nested PCR için ana karışımı hazırlamak için pipetleme şeması Tablo 2' de yazdırılır.
- 45 μL ana karışımı PCR tüplerine dağıtın.
- PCR tüpleri içine yalıtılmış DNA 5 μL ekleyin.
Not: kontaminasyonu önlemek için ana karışım hazırlığı için olandan başka bir oda kullanın. - PCR Tablo 3' te gösterildiği gibi reaksiyon koşulları ile çalıştırın. 35 döngülerinde denatürasyon, tavlama ve uzatma yineleyin.
- İç içe amplifikasyon için, AgeI ve SpeI (Tablo 1) için kısıtlama sitelerini barındıran astar çifti B kullanın.
- 2,2, pre-PCR ' i k i 5 μL kullanarak 2,5 ' e kadar adımları açıklandığı gibi reaksiyon koşullarına sahip iç içe PCR çalıştırın.
- PCR ürününün 10 μL 'sini 2 μL 6x jel yükleme boyasıyla karıştırın. % 1,5 agaroz jel üzerinde 10 μL karışımı yükleyin ve 60 MA 'da 30 dakika jel çalıştırın.
- Uygun bir UV dokümantasyon sistemi kullanarak jel görselleştirin.
Not: amplikon boyutu yeniden düzenleme (silme, eklemeler veya yinelemeler) oluştuğu bağlı olarak 300-500 BP arasında olması bekleniyor (Şekil 2C). - PCR ampliconları üreticinin talimatlarına göre bir PCAR arıtma kiti ile arındırın. PCR amplikonlar 30 μL elüsyon tampon elute.
- Astar çifti B kullanarak Sanger sıralaması için amplikonlar gönderin.
3. NCCR 'nin çift flüoresan muhabirine klonlanması
- Tablo 4' te açıklandığı gibi, 37 °c ' de 2 h Için ageı ve spei ile arıtılmış ampliconları (adım 2,10) özetler.
- Adım 2,10 tekrarlayın ve sindirilmiş amplicons arındırmak.
- Paralel olarak, Tablo 5' te açıklandığı gibi, 37 °c ' de 2 h Için agei ve spei ile plazmid omurgasını (1,5 μg) sindirin. Bu adımın yalnızca bir kez gerçekleştirilmesi gerekir. Sonraki reaksiyonlar için,-20 °C ' de sindirim dondurmak.
- % 0,8 düşük Melt agaroz jel üzerinde sindirilmiş Plasmid omurgasını analiz edin.
Not: jeli 40 mA 'dan daha yüksek bir akım ile çalıştırmayın. Başlangıçta Plasmid elde edilen spacer bölgenin beklenen kesici uç pEX-K4 2-LTR CD313 olan 128 BP (Şekil 2C). - Uzun dalga UV ışığı (320 NM) kullanarak DNA parçalarını görselleştirin ve temiz bir neşter kullanarak omurga bandını kesip çıkarın. Düşük Melt jel parçasını yeni 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. DNA hasarını önlemek için uzun UV pozlama süreleri kaçının.
Not: düşük Melt agaroz kullanıldığı için, ligasyon öncesinde DNA 'yı arındırmak gerekli değildir. - 65 °c ' de 10 dakika için düşük Melt agaroz parça içeren omurgasını ısıtın ve jel parçasını eritmek ve her 2 dakikada bir yumuşatma ile karıştırın. Erimiş jel doğrudan ligasyon için kullanılabilir.
- Tablo 6' da gösterilen şemayı kullanarak 16 °c ' de gece boyunca T4 DNA ligaz kullanılarak omurga ve sindirilmiş amplikon ligate.
- Isı şok yöntemi, LB-amp plakaları üzerinde plaka bakteri ve gece 37 °C ' de kültür kullanarak E. coli 'de dönüşümü gerçekleştirin.
- Ertesi gün, üç pozitif klonlar seçin ve gece E. coli kültürler hazırlamak (5 ml lb-amp) ve kültür 37 °c.
- Plasmid-DNA 'yı başka bir yerde14olarak açıklandığı şekilde standart protokolleri kullanarak izole edin, pozitif klonlar için kontrol etmek için ageı ve spei sindirimi gerçekleştirin ve% 1 agaroz jeli üzerinde parçaları kesip görselleştirin. Spacer Band (128 BP) daha büyük NCCR-sıra (300-500 BP, yukarıda görmek) ile değiştirilir.
- Astar EGFP-N veya primer çifti B (Tablo 1) kullanarak Sanger sıralama için Plasmid gönderin.
- Mutasyonlar kendiliğinden oluşabileceği için, sıralama sonuçlarını Amplicon ile elde edilen sıralama sonuçları ile karşılaştırın. Yalnızca Amplicon ile karşılaştırıldığında özdeş sıraları içeren klonlar kullanın.
- Elde edilen dizileri hizalamak ve düzenlemek için bir moleküler çalışma ekranı yazılımı (örn. ücretsiz nazik 1.9.4 veya diğer sıra düzenleme programları) kullanın (Şekil 3).
- Nazik 1.9.4 başlatın ve ithalat DÜĞMESINE tıklayarak DNA dizileri ithalat (yeşil aşağı ok).
- Sonraki tıklayın Aracı ve menü Hizalama seçin (kısayol olarak Ctrl + G kullanın) ve hizalama için DNA dizileri seçin.
- Tıklatarak hizalamaya bir sıra ekleyin Ekle veya Kaldır 'ı tıklatarak bir dizi kaldırın. JN19243815gibi bir arketipsel nccr görüş sırası dahil, sık kullanılan Dunlop-strain16nccr-sırası kullanmayın, bu yana redüzenlemeler ve arketipsel bkpyv daha çoğalan diğerleri limanları Suş.
Not: nccr zaten translasyonel başlangıç kodon (Şekil 3) içerir. - Hizalama için bir yöntem seçerek seçin Algoritmasıaraç çubuğunda ve seçin Setal W. eşleştirmek için hizalama parametrelerini ayarlamak 2; Gap uzatma cezası-1; Gap ceza-2 ve tıklayın ok hizalama çalıştırmak için.
4. muhabir plazmid ile HEK293T hücrelerin geçici transfeksiyon ve potansiyel antiviral ajanlar ile tedavi
- Sonraki transfeksiyon deneyler için Plasmid DNA yeterli miktarda hazırlamak için bir 150 mL gece kültürü hazırlayın. Plasmid DNA 'sını plazorta izolasyon kiti ile yalıtın. Alternatif olarak, diğer Plasmid arıtma kitleri kullanılabilir.
- Tohum 1 x 105 HEK293T HÜCRELERDE dmem içeren 10% FCS, penisilin ve streptomisin (1x) başına bir 12-kuyu plakası 24 saat önce transfeksiyon ve kuluçhanedeki gece 37 °c ve 5% Co2 transfeksiyon sırasında aktif proliferasyonu korumak için.
Not: hücreler yaklaşık 80% transfeksiyon sırasında konfluent olmalıdır. - Steril bir tüpte azaltılmış serum medyası 250 μL yerleştirin ve her muhabirin plazmid DNA 'sına 1 μg ekleyin ve pipetleme ile yavaşça karıştırın.
- DNA karışımına transfeksiyon reakajının 3 μL 'ını ekleyin, pipetleme ile hafifçe karıştırın ve 15 dakika boyunca inküye yapın. transfeksiyon reakajının 22 °C ' lik ortam sıcaklığına ve kullanmadan önce hafifçe girdap üzerine ısıtın.
- Kuyu için karışım Drop-Wise ekleyin ve yavaşça iyi dağıtın.
- 4 h sonra, test aracıları ve solvent kontrolü içeren taze orta ile süpernatant değiştirin. Analizine kadar 37 °C ' de kulküat yapın. Bu örnekte, mTOR inhibitörleri INK128 (100 ng/mL) ve Rapamycin (100 ng/mL) kullanılmıştır.
5. floresan mikroskopisi ve akış sitometri
- Floresan mikroskobu altında kırmızı ve yeşil floresans hücrelerini kontrol edin (Şekil 4).
Not: kırmızı ve yeşil floresans sırasıyla erken ve geç BKPyV gen ifadesine karşılık gelir. - 72 h sonrası transfeksiyon sonra, süpernatant Aspire ve iki kez soğuk PBS 1 ml ile hücreleri yıkayın.
- Yavaşça 500 μL tripsin ekleyin ve hücrelerin erken dekolmanı önlemek için biraz plaka çevirin. Bu adım, hücre doublets önlemek için önemlidir.
- Ayrıca, tripsin doğrudan aynı pipet ucu ile çıkarın.
- 37 °C ' de hücreleri en az 5 dakika boyunca inküat.
- % 3 FCS içeren PBS 1 ml ile tripsinize hücreler resuspend ve ön etiketli FACS tüpler süspansiyon transfer.
- FACS analizinden önce DAPı (1 μg/mL) ekleyin.
- Akış cytometer kullanarak hücreleri analiz edin. Her örnek için, DAPı boyama için negatif olan en az 10.000 yaşam hücrelerini ölçün.
6. veri analizi
- Akış sitometri analiz yazılımına verileri içe aktarın ve çalışma alanına tıkla ve sürükle örnekleri ekleyin.
- İçe aktarılan dosyaya çift tıklayın ve bir grafik çizimi oluşturun. X-ve y ekseni üzerine tıklayarak FSC-A ve SSC-A karşı seçin. Ana hücre popülasyonunu araç çubuğunda Çokgen üzerine tıklayarak ve hücre popülasyonunu çerçeveleme (Şekil 5) ile kapatın. Seçilen hücre popülasyon gerektiği gibi adlandırın (örneğin "tek hücreler"). "Tek hücreler" yeni bir çalışma alanı olarak görünecektir.
- DAPı negatif (yani, "yaşayan hücreler") için "tek hücreler" gating ile devam edin. Yaşam hücrelerini tanımlamak için hücre popülasyon ile ve DAPı boyama olmadan karşılaştırın. Her iki arazide FSC-A VERSUS Pacific-Blue-A ' ı seçin.
- Dikdörtgen tıklayın ve DAPı negatif hücre popülasyon seçin, seçilen hücre nüfus "yaşayan hücreler" adı ve yeni bir nokta-Plot gösteren oluşturmak FITC (eGFP) karşı PE (tdTomato) daha önce açıklandığı gibi.
- Dört seçerek "yaşayan hücrelere" kadran Ekle araç çubuğundan. Her nüfusun kenarına çeyreği merkezini sürükleyerek nüfus kapısı. Kadran temsil 1) EGFP-tdtom-, 2) EGFP-tdtom +, 3) EGFP + tdtom-, 4) EGFP + tdtom +.
Not: FITC ve PE arasında emisyon spektrumunun spektral kaplama nedeniyle, ilk telafisi kırmızı ve yeşil sinyaller arasında ayırt etmek ve doğru sonuçlar elde etmek için esastır. - Çeyrek üzerine sağ tıklayarak ve Istatistik Ekle'yi seçerek ortalama floresan yoğunlukları (MFIs) belirleyin. Ortalama seçin ve Tamam'ı tıklatın. Ortalama MFı artık "istatistik" bölümündeki nüfusun altında görüntülenir. Kadran 2 ve 4 erken ifade karşılık, kadran 3 ve 4 geç ifade temsil ederken.
- İstatistiksel güç için aynı şekilde ek çoğaltır ekleyin.
- Bir çubuk arsa içine erken ve geç veri yorumlama Plot MFı değerleri için:
- Farklı bağış veya virüs suşlarından elde edilen nccr etkinliklerini karşılaştırmak için, bir arketipsel kontrol veya Dunlop strain16 ekleyin ve göreli mfis% 100 için ayarlayın ve göreli MFI değerlerini hesaplayın. Her çoğaltma ile tekrarlayın ve ortalama ve standart sapma belirleyin.
- Transkripsiyon aktivitesinde potansiyel bileşiklerin etkisini değerlendirmek için, solvent kontrolünü% 100 olarak ayarlayın ve tedavi edilen hücrelerin MFı 'ini çizin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu temsilci denemede, BK-polyomavirus kodlama olmayan kontrol bölgesi güdümlü transkripsiyon aktivitesi Akış sitometrisi ile ölçülmüştür. Ayrıca, BKPyV reaktivasyonu sonrasında hastaları tedavi etmek için kullanılabilecek bir mTOR inhibitörü, viral erken Gen ifadesinin inhibisyonu için test edildi. Bu amaçla, daha önce yayınlanan bir çift floresan-muhabir tahlil olarak kullanıldı5. Deneysel kurulumunun genel iş akışı şeması Fıgure 1' de gösterilmektedir. İlk olarak, bağışıklık sistemi etkilenen renal nakil hastalarından gelen kan örnekleri, Kurumsal Etik Komitesinin onayladığı şekilde insan araştırmalarının yönergelerine göre toplanır. EDTA içeren tüplerde kan toplandı ve faz santrifüjleme ile ayrıldı. Daha sonra polyomavirüsdür DNA 'sı izolasyonu için 400 μL plazma kullanılmıştır. Kodlama olmayan kontrol bölgesi (NCCR), dış primer çifti BKV-CR-1FW ve BKV-CR-1rv kullanarak Şekil 2a 'da gösterildiği gibi iç içe geçmiş bir PCR protokolü kullanılarak güçlendirilmiştir, yanı sıra, iç astar çifti BKV-CR-2Fw-Agei (primer agei) ve BKV-CR-2Rv-spei ( Primer SPEI)17, Ikincisi agei ve spei için kısıtlama siteleri liman. Amplikon doğrulama, Şekil 2B'de gösterildiği gibi agaroz jel elektroforezi ile yapılmıştır. Arketipsel nccr dizileri (WT) elde edilen amplikonlar jel homojen bir boyut dağılımı vardı iken, bu eklemeler (RRins) ve silmeler (RRdel) ile yeniden düzenlenmiş nccrs türetilmiştir onların boyutunda farklı (yaklaşık 300-500 BP). Özellikle, yeniden düzenlemeler nedeniyle, Dunlop nccr referans dizisi16 (DUN), bir kontrol olarak dahil edildi, arketipsel virüslerden elde nccr daha büyükse. Amplikonlar öngörülen boyutlarda denk beri, arıtılmış PCR ürünleri daha fazla analiz için muhabir Plasmid içine klonlanmış dizileri ile daha sonra karşılaştırma için Sanger sıralaması için gönderildi.
Amplicons klonlama için, sindirim iki kısıtlama enzimleri AgeI ve SpeI kullanılarak yapılmıştır. Standart klonlama prosedürü kullanılarak gerçekleştirilen çift floresan muhabirine klonladıktan sonra, NCCR 'yi içeren pozitif klonların seçilmesi AgeI ve SpeI sindirim (Şekil 2C) tarafından doğrulandı. Burada, küçük spacer bölgesi (NC, 128 BP), pozitif klonlar gösteren büyük NCCR-parçaları (yaklaşık 300-500 BP) tarafından değiştirildi. Onaylı klonlardan izole edilen Plasmid DNA 'sı Sanger sıralaması için gönderildi ve amplikon Sıralamalarından elde edilen dizilere kıyasla (gösterilmez). Daha fazla işlem için sadece amplikon serisine uyan klonlar seçilmiştir. Şekil 3' te tasvir edilen sıralamalar, bir arketipsel nccr dizisi (JN192438) ile karşılaştırıldı. Bu örnekte, P bloğundaki bir silme ve O-bloktaki bir değiştirme algılandı.
Daha sonra hücre kültüründe klonlanmış nccr dizileri transkripsiyon etkinliğini sınamak için HEK293T hücreleri geçici olarak ilgili muhabir yapıları ile transfekte (Şekil 4A). Şekil 4b'de gösterildiği gibi, transfeksiyon verimliliği ve NCCR-aktivite floresans mikroskobu ile izleniyor. Erken ve geç BKPyV gen ifadesine karşılık gelen kırmızı ve yeşil floresan, sırasıyla5. Hücreler hem fluorophores etkili erken ve geç promotor aktivite gösteren ifade etti. İki örnek tarafından gösterildiği gibi, ilk NCCR (NCCR1) güçlü bir geç gen ifadesi görüntülenirken, ikinci örnekte (NCCR2) nispeten güçlü bir erken ama ılımlı geç gen ifadesi (Şekil 4b) vardı. Böylece akış sitometri ölçümü için numune hazırlanır. Protokol Bölüm 6 ' da açıklandığı gibi, DAPı negatif hücreler kaplandı (Şekil 5A, alt panel) ve tdTomato karşı EGFP gösteren bir nokta çizimi oluşturuldu. Negatif (Şekil 5B) örneklerin yanı sıra tdTomato (şekil5c) veya EGFP (Şekil 5D) için pozitif olan örnekler de analizlere dahil edilmiştir. Dikkat, ilk tazminat yapıldı, hangi kırmızı ve yeşil sinyalleri ayırt etmek için gerekli olan ve doğru sonuçlar elde etmek için18. Ortalama floresan yoğunlukları her test klon türetilmiştir. Burada, tdTomato pozitif hücreler erken ifade denk iken eGFP pozitif hücreler geç ifade temsil. Bu örnekte çift mTOR inhibitörü INK128 ile tedavi önemli ölçüde azaltılmış tdTomato MFı (Şekil 5E-F), bu erken ifade inhibe anlamına gelir.
Şekil 1 : Deneysel kurulum Için Iş akışı şeması. 1) kan toplama (alternatif idrar) örnekleri, 2) polyomavirüsdür DNA yalıtımı 3) olmayan kodlama kontrol bölgesinin amplifikasyon (nccr) iç içe-PCR protokolü kullanarak, 4) agarose Jel Elektroforez ve amplikon doğrulama, 5) PCR Amplicon Sanger sıralaması, 6) Ageı ve spei kullanarak çift floresan muhabir içine nccr klonlama, 7) pozitif klonlar SEÇIMI, 8) Plasmid DNA Sanger sıralaması, 9) HEK293T hücrelerinin geçici transfeksiyon ve muhabir Plasmid ile test edilecek bileşiklerin eklenmesi, 10) verimli transfeksiyon doğrulamak için Floresan Mikroskobu, 11) akış sitometri analizi, 12) gating ve eGFP tdTomato ifadesi, 13) veri yorumu Analizi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Iç Içe PCR ve hasta türetilen NCCR-amplicons temsili analizi. A) bağışıklık sistemi kaynaklı renal nakil hastalarından elde edilen DNA, agei ve spei kısıtlama siteleri ile bağlantılı oligonükleotit astar kullanarak yarı YUVALANMıŞ PCR amplifikasyonu ile maruz kalmıştır. Bkpyv strain JN192438 gelen arketipsel O, P, Q, R ve S-blokları primer isimleri ve uzunluğu (temel çiftleri) parantez içinde belirtilir. B) amplicons% 1,5 agaroz jel elektroforez ile analiz edildi ve DNA boyama kullanılarak görselleştirildi. M1 = 100 BP merdiven, WT = wildtype (archetypical), RR = yeniden düzenlenmiş, ins = eklemeler, del = SILMELER, Dun = Dunlop strain. C) agei ve spei ile Plasmid sindirimi. Sindirilmiş parçalar% 1,5 agaroz jel elektroforezi ile analiz edildi ve DNA boyama kullanılarak görselleştirildi. M1 = 100 BP merdiven, m2 = 2-günlük merdiven. NC = negatif kontrol (spacer). + = pozitif klon. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Çift floresan muhabirine NCCR 'Nin klonlanması ve doğrulanması. Plasmid sıralamanın temsili sonuçları. Amplicons bir PCR arıtma kiti kullanılarak saflaştırılmış ve Sanger sıralamayı tabi. İlgili diziler, arketipsel bkpyv strain JN192438 öğesinden türetilen nccr sırasına göre hizalanmıştır. Silmeler ve değişimler kırmızı olarak işaretlenir. AgeI ve SpeI kısıtlama siteleri, eGFP açık okuma çerçevesi translasyonel başlangıcı (kalın baskılı) yanı sıra NCCR blokları O-S belirtilir. İlgili bloklar ve kısıtlama siteleri renk olarak vurgulanır. Temel çiftleri içinde her NCCR bloğunun uzunluğu parantez içinde yazdırılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Erken ve geç nccr Organizatör aktivitesinin temsili floresans mikroskopi analizi. A) çift yönlü organizatörü kontrol altında ikili floresan muhabir gen haritası. Daha önce açıklandığı gibi5 Plasmid pTA-tdtom-nccr-EGFP (6.009 BP) liman bazılarında SV40 geç Poliadenilasyon sinyal aşağı her ifade kaset her iki transkriptler için karşılaştırılabilir ve verimli işlenmesi sağlamak için tdtomato (erken Expression) ve eGFP (geç ifade), sırasıyla. NCCR, AgeI ve SpeI tarafından çevrelenmiş. Vektör klonlama işlemi sırasında seçim için bir ampikilin direnç kaseti içerir. B) HEK293T hücreler, her biri hasta türetilen NCCR DIZILERI (NCCR1-2) kontrolü altında çift floresan muhabiri ile transferleştirilmiştir. Hücreler aydınlık alan ve floresans mikroskopi Analizi 72 h Post transfeksiyon maruz kalmıştır. Mikroskobun filtre ayarları aşağıdaki uyarma aralıklarında kullanılmıştır: tdTomato (515-560 Nm) için yeşil ve eGFP (450-490 nm) için mavi. Ölçek çubuğu (200 μm) her fotoğrafın sağ alt kısmında belirtilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5 : Temsilci FACS analizi. Gösterilen basit gating stratejisi bu yöntem için gereklidir. İki parametre yoğunluğu veya nokta grafikleri kullanılır. A) ilk olarak, FSC Pacific Blue karşı çizilir, sadece DAPI negatif iken (yani, yaşayan hücreler) daha da işlenir. B-F) FITC (eGFP) karşı PE (tdTomato) çizilir. C-D) Akış cytometer üzerinde tazminat ayarlamak için özel yeşil ve kırmızı floresan hücreler ekleyin. E-F) Bu örnekte, mTOR inhibitörleri INK128 ve önemli ölçüde azaltır tdTomato MFı, hangi BKPyV erken gen ifadesi bir azalma karşılık gelir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Primer adı | Sıra (5 ' → 3 ') |
| BK-CR-fwd1 | (GCTCA) |
| BK-CR-REV1 | MUSTAFA KıSCA |
| BKV-CR-2-FW-Ageı | hüseyinözçakır... |
| BKV-CR-2-RV-SpeI | hüseyin özgül... |
| EGFP-N | CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG |
Tablo 1: Oligonucleotides Bu protokolde kullanılır. Altı çizili üsler sırasıyla AgeI ve SpeI için kısıtlama enzim sitelerini gösterir.
| Bileşen | Hacim/reaksiyon (μL) | Son konsantrasyon |
| RNase-ücretsiz su | 32,8 μL | - |
| 10X PCR tampon | 5 μL | 1x |
| dNTPs (her biri 10 mM) | 1 μL | 0,2 her dNTP 'nin mM 'si |
| FWD-astar (10 μM) | 3 μL | 0,3 μM |
| Devir-astar (10 μM) | 3 μL | 0,3 μM |
| Taq polimeraz | 0,2 μL | 2 birim/reaksiyon |
| Şablon DNA | 5 μL | < 0.5 μg/50 μL reaksiyon |
Tablo 2: Master Mix hazırlama protokolü. Yönerge, sırasıyla 2,2 ve 2,7 adımda açıklandığı gibi hem ön hem de iç içe PCR reaksiyonları için geçerlidir.
| Sıcaklık | Süre | PCR-Step | Döngü |
| 95 °C ' ye kadar | 5 dk. | İlk denaturation | |
| 95 °C ' ye kadar | 30 sn | Denatürasyon | |
| 55 °C ' ye kadar | 34 sn | Tavlama | x35 |
| 72 °C ' ye kadar | 1 dk. | Uzantısı | |
| 72 °C ' ye kadar | 10 dk | Son uzatma | |
| 4 °C ' ye kadar | ∞ | Soğutma |
Tablo 3: NCCR amplifikasyon için kullanılan PCR programı. Yönerge hem ön hem de iç içe PCR reaksiyonları için geçerlidir.
| Reaktif | Hacim/reaksiyon (μL) | Son konsantrasyon |
| DNase-ücretsiz H20 | 6 | 20 μl 'ye kadar |
| 10X tampon | 2 | 1x |
| AgeI | 1 | 10 adet |
| SPEI | 1 | 10 adet |
| saflaştırılmış PCR-Amplicon | 10 | Değişken |
Tablo 4: Amplicon sindirim protokolü. Yönerge, 3,1 adımda açıklanan iki kısıtlama enzimiyle amplikon DNA 'sının eşzamanlı sindirim için geçerlidir.
| Reaktif | Hacim/reaksiyon (μL) | Son konsantrasyon |
| DNase-ücretsiz H20 | 14,5 | 20 μl 'ye kadar |
| 10X tampon | 2 | 1x |
| AgeI | 1 | 10 adet |
| SPEI | 1 | 10 adet |
| Plazmid omurgası (1 μg/μL) | 1,5 | 1,5 μg |
Tablo 5: Plasmid sindirim protokolü. Yönerge, 3,3 adımda açıklanan iki kısıtlama enzimiyle plazmid DNA omurgasının eşzamanlı sindirim için geçerlidir.
| Reaktif | Hacim/reaksiyon (μL) | Son konsantrasyon |
| DNase-ücretsiz H20 | 7 | 20 μl 'ye |
| T4 DNA ligaz | 1 | 20 |
| 10X T4 DNA ligaz tampon | 2 | 1x |
| Saflaştırılmış Plasmid omurgası Düşük Melt seyreltilmiş 1/2 adım 3,5 |
2 | Değişken |
| 2,7 adımda sindirilmiş ve saflaştırılmış PCR-Amplicon | 8 | Değişken |
Tablo 6: Plazmid ligasyon protokolü. Yönerge, 3,7 adımda açıklanan sindirilmiş PCR amplikon DNA 'sı ile plazmid DNA omurgasının ligasyonu için geçerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, sık kullanılan bir yöntem, bkpyv kodlama olmayan denetim bölgesi (nccr) erken ve geç Organizatör etkinliği yönetilen analizi için olanak sağlar sunulmuştur. Nccr aktivite aynı anda ölçülebilir ve transfekte hücrelerin lizis gerekmez. Dahası, nispeten çok sayıda hücre analiz edilebilir ve floresan değerlerinin normalleştirilmesi için ek işaretçilerin eş transfeksiyonunu gerekli değildir.
Bu yöntemin kritik bir kısmı, klonlanmış nccr 'nin, hasta plazmasında bulunan çoğunluk türevleri için karşılık gelen amplikon sıralamalarına göre tam olarak aynı dizileri içermesi gerektiği şeklindedir. Doğru sonuçlar elde etmek ve PCR eğilimli hataları en aza indirmek için Proof okuma aktivitesi ile bir polimeraz kullanılması önerilir. Alternatif olarak, diziler ticari gen sentezi Hizmetleri ile sipariş edilebilir. Belirlenmiş NCCR dizileri, doğrudan klonlama için Ageı ve SpeI kısıtlama siteleri dahil olmak üzere sipariş edilebilir. Bu durumda, plazmid omurga plazmid paralel sindirin ve sentezlenmiş yapı gelen NCCR parçası ile spacer Ekle değiştirin. DNA alternatif olarak idrar örneklerinden izole edilebilir. Ancak, BKPyV aynı zamanda bağışıklık konusunda yetkin bireyler tarafından idrar içine salgılanır ve aktif replikasyonu yansıtmaz, klinik alaka sınırlıdır. İdeal olarak, DNA da daha önce PVAN histolojik olarak tespit edilebilir böbrek biyopsilerin izole edilebilir (Korth ve Al ile karşılaştırın., 201919).
Yeşil ve kırmızı floresan hücrelerin ortalama floresan yoğunluğunu ölçerek, bu yöntem transfeksiyon verimliliği ve test edilen ajanlar Anti-proliferatif etkileri önyargı olmadan NCCR-türetilen floresan/aktivite ölçmek için izin verir (örn., Çift mTOR inhibitörleri INK128 veya PP242)5.
Muhabir sisteminin bir başka uygulaması da, erken ve geç promotor aktivitesinde klinik izolasyonlarla bulunan NCCR 'deki eklemeler, silmeler veya çoğaltmaların sonuçlarını analiz etme olasılığıdır. Önceki çalışmalarda, NCCR aktivitesini modüe etmek için immünorpresif ajanlar incelenmiştir; Ancak, hiçbir mutasyonlar veya NCCR yeniden düzenlemeler duyarlılık etkileyen bulundu. Ancak, mutasyonlar yakın gelecekte onaylanabilecek yeni maddelerin tepkisi etkileyebilir.
Bu uygun olabilir kodlama bölgeleri büyük T antijeni veya VP1 kapsid protein aksine, nccr adından da anlaşılacağı gibi bir kodlama olmayan bölge temsil eder ve böylece amino asit düzeyinde seçici basınç altında yatan değil.
Bu protokolde, NCCR içeren pozitif klonlar seçimi AgeI ve SpeI sindirimi ile doğrulanır. Ancak, bir koloni PCR hızlı bir şekilde NCCR ekler için doğrudan E. coli kaplama agar plakaları üzerinde ekran için alternatif bir yaklaşım temsil edebilir. Bu yaklaşım için, primer çifti BKV-CR-2-FW-Ageı ve EGFP-N (Tablo 1) kullanın. Transfeksiyondan sonra hücreler floresan mikroskopisi kullanılarak kırmızı ve yeşil floresans için kontrol edilir (Şekil 4). Alternatif olarak, hücreler 22 °C ' de 20 dakika boyunca% 3 PFA kullanılarak düzeltilebilir. Bu durumda, PBS ile yıkayın, PBS 'de% 0,2 iyonik olmayan deterjan ekleyin ve 10 dakika boyunca inküye yapın. sabit hücreler daha sonra PBS (1 μg/mL) içinde DAPı ile 22 °C ' de 10 dakika lekelenebilir ve floresan mikroskobik analizine tabi tutulur ve UV ışığı (340-380 Nm) ile görselleştirilebilir.
Her iki fluorophores aynı Poliadenilasyon sinyalleri liman beri, polikadenilasyon verimliliği etkisi dışında olabilir. Ancak, eGFP ile karşılaştırıldığında, tdTomato bir dimerik protein olan bir uzun mRNA içine transkripsiyonu olmalıdır (kodlama sırası: 745 VERSUS 1431 BP, sırasıyla). Ancak, müdahale edilen maddelerle tedavi edilen hücrelerden organizatörler aktivitesinin her zaman tedavi edilmemiş (DMSO) hücrelerine göre karşılaştırıldığından, bu fark küçük bir rol oynar. Çoğaltmanın kökeni varlığı nedeniyle, hücrelerdeki gazetecinin plazmid transfeksiyon stabil SV40PyV büyük T antijeni ifade kız hücrelerine plazmitler transferi sağlar. BAZıLARıNDA SV40 büyük T antijeni BAZıLARıNDA SV40 ve BKPyV NCCR ve viral DNA çoğaltma20transactivate olabilir gösterildi. Ancak, büyük bir T antijeni de erken enfeksiyonun geç aşamasına geçiş dahil olduğundan, yapay bir durum verilir. Bu tahlil kullanarak, en çoğaltma sınırlama adım büyük T antijeni ifadesine giden erken ifade olduğunu dikkate alınmalıdır. Tam çoğaltma döngüsü eşlemek için erken ve geç mrnas virüslü hücrelerde QRT-PCR tarafından başka bir yerde5,12açıklandığı gibi ölçülmelidir.
Benzer bir yöntem zaten İsviçre ve Alman grupları tarafından arketipsel ve yeniden düzenlenmiş bkpyv nccr-türetilmiş promotor faaliyetleri, bağımsız klonlanmış vektör sistemleri5,9ile olsa analiz etmek için kullanılmıştır. Gosert ve Basel 'den meslektaşları bkpyv ve jcpyv suşlarının nccr Organizatör aktivitesini belirlemek için benzer bir yöntem kullandı9,10,11. Her iki yöntem de yeşil floresans için eGFP kullanılır; Ancak, Basel grubu RFP kullanıldığında geçerli protokolde tdTomato kırmızı floresans için kullanıldı. RFP üzerinde tdTomato avantajı çok daha yüksek fotoistikrar olduğunu; Ancak, dimerik protein RFP21olarak iki kat uzun bir dizi tarafından kodlanmış. Ayrıca, proteinlerin yarı hayatları farklı olabilir, eşit olmayan konsantrasyon 72 h sonrası transfeksiyon ile sonuçlanır. Ancak, bu sorun sadece doğrudan hem floresan yoğunlukları karşılaştırarak ilgili olabilir. Gosert ve ark. BamHI ve NotI 'yi kısıtlama siteleri olarak kullanırken, geçerli protokol Ageı ve SpeI NCCR dizisiyle çevrelerdir. Her iki yöntemi kullanarak, referans Dunlop strain16 güçlü erken ama zayıf geç Organizatör aktivite ile karşılaştırılabilir floresan desenler vermiştir9,10. Daha fazla anlaşmada, P-bölgesinde eklemeler ile nccr-yeniden düzenlemeler WT-nccr5,9karşılaştırıldığında erken ve geç Organizatör aktivite önemli bir artış sonuçlandı.
Bazılarında SV40 büyük t antijeni türetildiği gösterilmiştir rağmen bazılarında SV40 ve bkpyv türetilen nccrs20, bu stabil bkpyv büyük t antijeni ve gelecekteki çalışmalarda değil prototip virüs bazılarında SV40 ifade insan hücreleri kullanmak için ilginç olabilir . Ancak, bu durumda hücre hattının transfekt kolay olması gerekir (örn., HEK293).
Politomavirlerin nccr Organizatör çok benzer olduğundan, bu yöntem de (primer sıraları Küçük adaptasyon) organizatör etkinliğini ve JC-polyomavirus (jcpyv) aktivitesinde güçlü antiviral ajanlar etkisini araştırmak için kullanılabilir türetilmiş olmayan kodlama denetim bölgeleri11. JCPyV, progresif multifokal lökoensefalopati (PML) ' nin etken maddesi olduğundan, şiddetli nöropatoloji ile sonuçlanan immüneksiklikleri olan hastalarda nadiren meydana gelen nadir bir merkezi sinir sistemi hastalığı, ayrıca bulmak için acil bir ihtiyaç bağışıklık tehlikeye hastalar tedavi etmek için doğrudan hareket antiviral maddeler. İlginçtir ki, yeniden düzenlemeler de JC NCCRs11bulunur. JCPyV neurotropism telaffuz ve böylece virüsler büyük miktarlarda likör bulundu beri, numune alımı içki türeyen DNA ayarlanması gerekir. Ancak, sonraki adımlar kolayca adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Johannes Korth, Astellas ve Novartis 'ten konuşmacı ücreti ve seyahat giderleri için hibe aldı. Marek Widera, Novartis 'ten danışmanlık ücreti aldı. Oliver Witzke, Astellas, Basilea, Biotest, Bristol-Myers-Squibb, Correvio, chiesi, Gilead, Hexal, Janssen, Dr. F. Köhler Chemie, MSD, Novartis, Roche 'dan klinik çalışmalar, konuşmacı ücreti, honoraria ve seyahat giderleri için hibe aldı. Pfizer, Sanofi ve TEVA.
Acknowledgments
Yazarlar mükemmel teknik yardım için Barbara Bleekmann teşekkür ederiz. Bu çalışmalar, Duisburg-Essen Tıp Fakültesi 'nin IFORES-programı ve Üniversitesi Ittifak Ruhr ve Mercator araştırma merkezi Ruhr (MERCUR) RIMUR-programı tarafından destekleniyor. Yazarlar, Helene Sertznig 'in Doktora Bursu ve sürekli destek için Jürgen-Manchot-Stiftung ' a teşekkür ederler. Hasta materyalinin toplanması ve kullanımı, Duisburg-Essen (14-6028-BO) Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
References
- Drachenberg, C. B., et al. Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load. American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).
- Korth, J., et al. Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function. Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).
- Hirsch, H. H., et al. European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation. Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).
- Masutani, K., et al. The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome. American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).
- Korth, J., et al. Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region. Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).
- Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12. Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).
- Sanchez Fructuoso, A. I., et al. Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients. Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).
- Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis. Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).
- Gosert, R., et al. Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology. Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).
- Bethge, T., et al. Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression. Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).
- Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate. Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).
- Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression. American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).
- Widera, M., et al. HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia. Medical Microbiology Immunology. , (2017).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).
- Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland. Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).
- Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals. Virology. 198 (1), 59-70 (1994).
- Teutsch, K., et al. Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy. Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).
- Korth, J., et al. The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation. Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).
- Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens. Virology. 152 (2), 459-465 (1986).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
