Summary
В этой рукописи представлен протокол для выполнения FACS-измерения транскрипционной активности BK-полиомавируса с помощью клеток HEK293T, трансфицированных двунаправленным репортером плазмидом, выражающим tdTomato и eGFP. Этот метод позволяет дополнительно количественно определить влияние новых соединений на вирусную транскрипцию.
Abstract
Полиомавирусы, такие как BK-полиомавирус (BKPyV), могут вызывать тяжелые патологии у пациентов с ослабленным иммунитетом. Однако, поскольку высокоэффективные противовирусные препараты в настоящее время отсутствуют, необходимы методы измерения воздействия потенциальных противовирусных препаратов. Здесь, двойной флуоресценции репортер, который позволяет анализ BKPyV не-кодирования контроля региона (NCCR) инициативе ранней и поздней активности промоутера был построен для количественной оценки воздействия потенциальных противовирусных препаратов на экспрессию вирусных генов через tdTomato и eGFP Выражение. Кроме того, путем клонирования BKPyV-NCCR ампликонов, которые в этом протоколе были образцово получены из крови полученных ДНК иммунокомпромиссных пациентов пересадки почек, влияние NCCR-перестановки на экспрессию вирусного гена может быть определено. После клонирования пациента, полученных ампликонов, HEK293T клетки были трансфицированы с репортером плазмиды, и лечение с потенциальными противовирусными агентами. Впоследствии клетки были подвергнуты FACS-анализ для измерения средней интенсивности флуоресценции 72 ч после трансфекции. Для проверки анализа препаратов, которые имеют потенциальный клеточный цикл ингибирующего эффекта, используются только трансфицирующие и, таким образом, флуоресцентные клетки. Так как этот анализ проводится в больших T Антигена выражая клетки, влияние раннего и позднего выражения могут быть проанализированы в взаимно независимым образом.
Introduction
Полиомавирусы представляют собой независимое семейство небольших двухцепочечных вирусов ДНК (DsDNA) с вирусом Simian 40 (SV40) в качестве прототипа вида. Первичная инфекция в основном происходит в детстве, которые обычно проходят без симптомов заболевания и обычно вызывают скрытые инфекции у иммунных компетентных хозяев. BK-полиомавирус (BKPyV) в основном сохраняется в клетках почек труб, не вызывая нефропатологии, однако, в случае нарушения иммунокомпетентности после пересадки почек вирус может реактивироваться и вызвать серьезные повреждения и нарушения трансплантата функции при достижении высокой виремии (1 х 104 BKPyV копии ДНК / мл)1,2. Примерно в 10% реципиентов пересадки почки реактивация BK-полиомавируса (BKPyV) приводит к полиомавирусу, связанному с нефропатией (PyVAN), которая была до 80% связана с высоким риском отказов почечного аллотрансплантата3,4 . Поскольку утвержденных противовирусных препаратов нет, текущая терапия основана на снижении иммуносупрессии. Интересно, что ингибиторы mTOR, кажется, имеют противовирусный эффект; Таким образом, переключение иммуносупрессивной терапии на основе mTOR иммуносупрессии может представлять собой альтернативный подход для предотвращения прогрессирования виремии BKPyV5,6,7. Тем не менее, на основе mTOR противовирусный механизм в настоящее время все еще не полностью поняты. Таким образом, требуются методы измерения воздействия потенциальных противовирусных препаратов в клинически значимых концентрациях.
Круговой геном BKPyV состоит примерно из 5 кб укрывательство некодирования области управления (NCCR), который служит источником репликации и одновременно двунаправленный промоутер вождения выражение ранней и поздней фазы мРНК стенограммы. Так как спонтанно происходящие NCCR-перестановки, удаления и дублирования находятся в патогенных BKPyV8 и значительно накопленные у пациентов, страдающих от PVAN5,9, сравнение архетипических (WT) и переорганизованы (rr) NCCR-деятельности полезны для характеристики вирусных репликационных фитнес.
Как резюмируется на рисунке 1, этот протокол описывает широко используемый метод для измерения BKPyV NCCR транскрипционной активности путем количественной оценки флуоресценции двух фторофоров tdTomato и eGFP, выраженный от репортера плазмид5, 9,10,11. Процедура проводится в присутствии большого T-антигена SV40 (lTAg), который позволяет анализировать влияние потенциальных противовирусных препаратов на ранние и поздние NCCR-активности отдельно5. Этот анализ далее анализирует влияние перестановок на деятельность НККР и сравнение с wt-NCCRs5,9. Репортер плазмид гавани SV40 конце полиаденилации сигнала вниз по течению каждого флюорофора открытой рамки чтения для обеспечения сопоставимой и эффективной обработки как стенограммы для tdTomato и eGFP, соответственно. По сравнению с qRT-PCR на основе методов5,12, этот подход на основе FACS представляет собой низкую стоимость и высокую пропускную плату совместимой альтернативой, поскольку нет сложных протоколов экстракции для инфицированной культуры клеток и не дорого антитела для иммунной флуоресценции окрашивания необходимы. Кроме того, поскольку определенное количество флуоресцентных клеток анализируются с помощью цитометрии потока, анализ ингибирующих клеточного цикла также возможен в количественном выражении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол следует руководящим принципам человеческих исследований, утвержденным комитетом по этике медицинского факультета Университета Дуйсбурга-Эссена (14-6028-BO).
1. Сбор образцов крови или мочи и изоляция ПОЛиомавируса ДНК
- Соберите не менее 3 мл крови в трубках ЭДТА или моче в трубках приобретения.
- Центрифуги образца на 2500 х г в течение 15 мин. При необходимости, pipette плазмы в новую трубку и хранить образцы плазмы при 4 градусах по Цельсию в течение нескольких дней или заморозить при -20 градусов по Цельсию для более длительного хранения.
- Приготовьте 40 л протеиназы K в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл и добавьте 400 л плазмы путем пайпетирования.
- Выщелачить образец, добавив 400 qL буфера лисиса, вихрь на 15 с, и инкубировать в течение 10 минут при 56 градусах Цельсия.
- Изолировать ДНК с помощью комплекта для извлечения крови ДНК, как описано в инструкциях производителя. Кратко добавьте спирт и нагрузите lysates на колонку закрутки содержа мембрану на основе силиков на основе силиверницы ДНА. Вымойте столбцы несколько раз, чтобы дать чистую ДНК.
- Выясните полученную ДНК в 30-50 л буфера TE.
2. Усиление региона контроля за некодированием (НККР)
- Выполните следующую процедуру в физически разделенных комнатах. Используйте изолированную комнату для подготовки реагентов и распространения смеси на пЦР труб.
- Подготовьте Master Mix для предварительного PCR с помощью грунтовой пары A (Таблица 1) в общем объеме 50 Зл и используйте ранее изолированную ДНК со ступени 1.6. Схема трубации для подготовки мастер-микс для доистого и вложенного ПЦР напечатана в таблице 2.
- Распределите 45 qL мастерской смеси в трубки ПЦР.
- Добавьте 5 зЛ изолированной ДНК в пЦР-трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте другую комнату, чем для подготовки мастер смеси, чтобы избежать загрязнения. - Выполнить ПЦР с условиями реакции, как показано в таблице 3. Повторите денатурацию, аннулирование и расширение в 35 циклах.
- Для вложенного усиления использовать грунтовую пару B укрывательство места ограничения для AgeI и SpeI (Таблица 1).
- Запустите вложенный ПЦР с условиями реакции, описанными в шагах от 2,2 до 2,5 с использованием 5 ЗЛ предварительного ПЦР.
- Смешайте 10 зл пЦР продукта с 2 Л 6x гель загрузки красителя. Загрузите 10 л смеси на 1,5% агарозного геля и запустите гель в течение 30 мин при 60 мА.
- Визуализируйте гель с помощью соответствующей системы УФ-документации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер ампликона, как ожидается, будет между 300-500 bp в зависимости от того, перестановки (удаления, вставки, или дублирования) произошло (Рисунок 2C). - Очистите ампликоны ПЦР с помощью комплекта для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя. Выщелачить ампликоны ПЦР в 30 зликатных буферах.
- Отправить амблоны для секвенирования Сэнгера с помощью грунтовой пары B.
3. Клонирование NCCR в двойной флуоресценции репортер
- Дайджест очищенных ампелонов (шаг 2.10) с AgeI и SpeI для 2 ч при 37 градусах По Цельсию, как описано в таблице 4.
- Повторите шаг 2.10 и очистите переваренные ампелоны.
- Параллельно, также переварить плазмидной позвоночник (1,5 мкг) с AgeI и SpeI для 2 ч при 37 градусов по Цельсию, как описано в таблице 5. Этот шаг должен быть выполнен только один раз. Для последующих реакций заморозьте пищеварение при -20 градусов по Цельсию.
- Проанализируйте переваренный плазмид позвоночника на 0,8% низким расплава агарозный гель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не запускайте гель с током выше 40 мА. Ожидаемая вставка области spacer первоначально получена из плазмидного pEX-K4 2-LTR CD313 составляет 128 б.п.(рисунок 2C). - Визуализируйте фрагменты ДНК с помощью длинноволнового ультрафиолетового света (320 нм) и вырежьте магистральной полосы с помощью чистого скальпеля. Перенесите фрагмент низкого цемного геля в новую микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл. Избегайте длительного времени воздействия УФ-излучения, чтобы предотвратить повреждение ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Так как низкий расплавленный агарозиспользуется используется, нет необходимости очищать ДНК перед перевязкой. - Нагрейте позвоночник, содержащий низкий расплава агароуз кусок в течение 10 мин при 65 градусов по Цельсию для того, чтобы расплавить кусок геля и смешать каждые 2 мин нежным вихрем. Расплавленный гель может быть непосредственно использован для перевязки.
- Свагните позвоночник и переваренный ампликон с использованием T4 ДНК лигаза в течение ночи в 16 градусов по Цельсию, используя схему, показанную в таблице 6.
- Выполните преобразование в кишечной палочке с использованием метода теплового шока, пластины бактерий на пластинах LB-усилителя, и культуры при температуре 37 градусов цельсия в течение ночи.
- На следующий день выберите три положительных клона и подготовьте ночные культуры кишечной палочки (5 мл LB-Amp) и культуру при 37 градусах Цельсия.
- Изолировать плазмид-ДНК с помощью стандартных протоколов, как описано в другом месте14, выполнить AgeI и SpeI пищеварения, чтобы проверить на наличие положительных клонов и визуализировать вырезать фрагменты на 1% агарозный гель. Полоса spacer (128 bp) будет заменена более крупной NCCR-последовательностью (300-500 bp, см. выше).
- Отправить плазмида для секвенирования Сэнгера с помощью грунтовки EGFP-N или грунтовой пары B(Таблица1).
- Поскольку мутации могут происходить спонтанно, сравните результаты секвенирования с результатами секвенирования, полученными с ампрономном. Используйте только клоны, содержащие идентичные последовательности по сравнению с ампрононом.
- Используйте молекулярное программное обеспечение workbench (например, бесплатное ПРОГРАММНОе обеспечение GENtle 1.9.4 или другие программы редактирования последовательности) для выравнивания и редактирования полученных последовательностей(рисунок 3).
- Начните GENtle 1.9.4 и импортируйте последовательности ДНК, нажав на кнопку Импорта (зеленая стрелка вниз).
- Затем нажмите на инструмент и выберите выравнивание из меню (используйте Ctrl'G в качестве ярлыка) и выберите последовательности ДНК для выравнивания.
- Добавьте последовательность к выравниванию, нажав на Добавить или удалить последовательность, нажав на Удалить. Включите архетипическую последовательность консенсуса NCCR как JN19243815, не используйте NCCR-последовательность от обыкновенно используемого Dunlop-strain16, в виду того что он гавани перестановки и дублирования другие чем archetypical BKPyV Штаммов.
ПРИМЕЧАНИЕ: NCCR уже содержит переводный кодон начала(рисунок 3). - Выберите метод выравнивания, нажав на Алгоритм в панели инструментов и выберите clustal W. Установите параметры выравнивания, чтобы соответствовать 2; штраф расширения разрыва -1; штраф зазора -2 и нажмите на OK, чтобы запустить выравнивание.
4. Переходная трансфекция клеток HEK293T с плазмидом репортера и лечение с потенциальными противовирусными агентами
- Для подготовки достаточного количества плазмидной ДНК для последующих экспериментов трансфекции подготовьте 150 мл ночной культуры. Изолировать плазмидную ДНК с помощью плазмидного изоляционного комплекта. Кроме того, могут быть использованы другие наборы плазмидной очистки.
- Семена 1 х 105 HEK293T клетки в DMEM, содержащие 10% FCS, пенициллин и стрептомицин (1x) в колодец 12-хорошей пластины 24 ч до трансфекции и инкубировать ночь на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 для поддержания активного распространения во время трансфекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны быть примерно 80% конфлюентприратива при трансфекции. - Поместите 250 л уменьшенных носителей сыворотки в стерильную трубку и добавьте 1 мкг каждого репортера плазмид ДНК и аккуратно перемешайте путем пайпетирования.
- Добавьте 3 qL трансфекционного реагента в смесь ДНК, аккуратно перемешайте пайпеттингом и инкубируйте в течение 15 мин. Предварительно разогреть трансфекционный реагент до температуры окружающей среды 22 градусов по Цельсию и вихря осторожно перед использованием.
- Добавить смесь дроп-мудрый в колодцы и осторожно распределить в колодец.
- После 4 ч замените супернатант свежим носителем, содержащим испытательные агенты и контроль растворителя. Инкубировать при 37 градусах Цельсия до анализа. В этом примере использовались ингибиторы mTOR INK128 (100 нг/мл) и рапамицин (100 нг/мл).
5. Флуоресцентная микроскопия и цитометрия потока
- Проверьте клетки на наличие красной и зеленой флуоресценции под флуоресцентным микроскопом(рисунок 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Красная и зеленая флуоресценция соответствует ранней и поздней экспрессии гена BKPyV, соответственно. - После 72 ч после трансфекции, аспирируйте супернатант и мыть клетки дважды с 1 мл холодного PBS.
- Аккуратно добавьте 500 л трипсина и слегка поверните тарелку, чтобы избежать преждевременного отслоения клеток. Этот шаг важен, чтобы избежать сдавливов клеток.
- После добавления, удалите трипсин непосредственно с тем же наконечником пипетки.
- Инкубировать клетки в течение по крайней мере 5 мин при 37 градусах Цельсия.
- Отсрояните пробифицированные клетки с 1 мл PBS, содержащего 3% FCS, и перенесите подвеску в предварительно маркированные трубки FACS.
- Добавьте DAPI (1 мкг/мл) до анализа FACS.
- Проанализируйте клетки с помощью цитометра потока. Для каждого образца, измерить по крайней мере 10000 живых клеток, которые являются отрицательными для DAPI окрашивания.
6. Анализ данных
- Импортируйте данные в программное обеспечение для анализа цитометрии потока и добавляйте образцы нажмите кнопку и перетащите в рабочее пространство.
- Дважды нажмите на импортируемый файл и создайте график. Выберите FSC-A против SSC-A, нажав на x- и y-оси. Ворота основной популяции клеток, нажав на полигон на панели инструментов и обрамление ячейки населения (рисунок5). Назовите выбранную популяцию ячеек по мере необходимости (например, «одиночные ячейки»). "Единичные ячейки" появятся как новое рабочее пространство.
- Продолжить с gating "одиночные клетки" для DAPI отрицательный (т.е. "живые клетки"). Для идентификации живых клеток сравните популяцию клеток с и без окрашивания DAPI. В обоих участках выбирайте FSC-A против pacific-blue-A.
- Нажмите на прямоугольник и выберите DAPI отрицательной популяции клеток, назовите выбранную популяцию клеток "живыми клетками" и создайте новый точечный участок, показывающий FITC (eGFP) по сравнению с PE (tdTomato), как описано ранее.
- Добавьте квадранты в «живые клетки», выбрав квадроцикл из панели инструментов. Ворота населения, перетаскивая центр квадранта к краю каждой популяции. Квадранты представляют 1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM, 3) eGFP-tdTOM-, 4) eGFP-tdTOM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за спектрального наложения спектра выбросов между FITC и PE, первоначальная компенсация имеет важное значение для разграничения красных и зеленых сигналов и для достижения точных результатов. - Определите средние интенсивности флуоресценции (МФО), нажав на квадрант и выбрав Добавить Статистика. Выберите среднее и нажмите OK. Средний МФО в настоящее время отображается ниже населения в разделе "статистика". Квадранты 2 и 4 соответствуют раннему выражению, в то время как квадранты 3 и 4 представляют позднее выражение.
- Добавление дополнительных репликов таким же образом для статистической мощности.
- Для интерпретации данных сюжет Значения МФО раннего и позднего в барный сюжет:
- Для сравнения деятельности NCCR, полученной от различных доноров или штаммов вирусов, добавьте архетипический контроль или штамм Dunlop16 и установите его относительные МФО до 100%, и вычислите относительные значения МФО. Повторите с каждым репликацией и определите среднее и стандартное отклонение.
- Чтобы оценить влияние потенциальных соединений на транскрипционную активность, установите контроль растворителя на 100% и подогнайте МФО обработанных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом репрезентативном эксперименте, BK-полиомавирус Не-Кодирование Контрольный регион управляемых транскрипционной активности была измерена с помощью цитометрии потока. Кроме того, ингибитор mTOR, который может быть использован для лечения пациентов после реактивации BKPyV, был протестирован на его ингибирование вирусной ранней экспрессии генов. С этой целью, двойной флуоресценции репортер ассс был использован как опубликованные ранее5. Общая схема рабочего процесса экспериментальной установки иллюстрируется в Figure 1. Во-первых, образцы крови пациентов с иммунокомпромиссной трансплантацией почек были собраны в соответствии с руководящими принципами исследований человека, утвержденными институциональным комитетом по этике. Кровь была собрана в EDTA-содержащих труб и фазы были разделены центрифугации. Впоследствии для изоляции ПОЛиомавируса ДНК было использовано 400 л плазмы. Область управления некодированием (NCCR) была усилена с помощью вложенного протокола PCR, как показано на рисунке 2A с использованием внешней грунтовой пары BKV-CR-1fw и BKV-CR-1rv, а также внутренней грунтовой пары BKV-CR-2fw-AgeI (Primer AgeI) и BKV-CR-2rv-SIpe ( Primer SpeI)17, последний из которых гавани места ограничения для AgeI и SpeI. Проверка амплитона была проведена с помощью электрофореза геля агарозы, как показано на рисунке 2B. В то время как ампликоны, полученные из архетипических последовательностей NCCR (wt) имели однородное распределение размера в геле, те, полученные из перестроенных NCCRs с вставками (rrins)и удалениями (rrdel) отличались по размеру (приблизительно 300-500 bp). Примечательно, что из-за перестановок, Данлоп NCCR ссылка последовательность16 (DUN), которая была включена в качестве контроля, был больше, чем NCCR, полученные от архетипических вирусов. Так как ампликоны соответствовали прогнозируемым размерам, очищенные продукты ПЦР были отправлены для секвенирования Sanger для последующего сравнения с последовательностями, клонированными в плазмид репортера для дальнейшего анализа.
Для клонирования ампилконов, пищеварение было выполнено с использованием двух ферментов ограничения AgeI и SpeI. После клонирования в двойной флуоресценции репортер, который был выполнен с использованием стандартной процедуры клонирования, выбор положительных клонов, содержащих NCCR был проверен AgeI и SpeI пищеварения(Рисунок 2C). Здесь небольшой пространственный регион (NC, 128 bp) был заменен более крупными NCCR-фрагментами (приблизительно 300-500 б.п.), указывающими на положительные клоны. Плазмид ДНК, выделенная из проверенных клонов, была отправлена для секвенирования Сэнгера и сравнилась с последовательностями, полученными из секвенирования ампликона (не показано). Для дальнейшей обработки были выбраны только клоны, которые соответствуют последовательности ампикона. Как показано на рисунке 3, результаты секвенирования были сопоставлены с архетипической последовательностью NCCR (JN192438). В этом примере были обнаружены удаление в P-блоке и замена в O-блоке.
Для последующего тестирования транскрипционной активности клонированных последовательностей NCCR в культуре клеток, клетки HEK293T были преходяще трансинфицированы соответствующими конструкциями репортера(рисунок 4A). Как визуализировано на рисунке 4B, эффективность трансфекции и NCCR-активность были проверены с помощью флуоресценции микроскопии. Красная и зеленая флуоресценция соответствовала раннейи поздней экспрессии гена BKPyV, соответственно 5. Клетки выразили как фторофоры, указывающие на эффективную раннюю и поздняя промоторную активность. Как показано на примере двух примеров, первый NCCR (NCCR1) показал сильное позднее выражение гена, в то время как второй пример (NCCR2) имел сравнительно сильную раннюю, но умеренную поздняя экспрессия генов(рисунок 4B). Таким образом, были подготовлены образцы для измерения цитометрии потока. Как описано в разделе протокола 6, DAPI отрицательные ячейки были закрыты(рисунок 5A, нижняя панель) и точка участок был создан с указанием eGFP против tdTomato. Образцы, которые были отрицательными(Рисунок 5B), а также те положительные для tdTomato (Рисунок5C) или eGFP (Рисунок5D) только, были включены в анализ. Отметим, первоначальная компенсация была выполнена, что имеет важное значение для различения красных и зеленых сигналов и достижения точных результатов18. Средняя интенсивность флуоресценции были получены из каждого клона тестирования. Здесь положительные клетки tdTomato соответствовали раннему выражению, в то время как положительные клетки eGFP представляли поздняя экспрессия. В этом примере лечение с двойным ингибитором mTOR INK128 значительно уменьшило tdTomato MFI(рисунок 5E-F),что означает, что раннее выражение было ингибировано.
Рисунок 1 : Схема рабочего процесса для экспериментальной установки. 1) Сбор образцов крови (альтернативно моча) образцов, 2) Изоляция полиомавируса ДНК 3) Усиление области контроля некодирования (NCCR) с использованием вложенного протокола ПЦР, 4) Электрофорез агароза и ампликона проверка, 5) Секвенирование Сэнгера ампликонов ПЦР, 6) Клонирование NCCR в двойной флуоресценции репортер с помощью AgeI и SpeI, 7) Выбор положительных клонов, 8) Сэнгер секвенирования плазмид ДНК, 9) Переходный переходhe HEK293T клеток с репортером плазмиды и добавление соединений, которые будут протестированы, 10) Флуоресценция микроскопии для проверки эффективного трансфекции, 11) Анализ цитометрии потока, 12) Gating и анализ eGFP tdTomato выражение, 13) интерпретация данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Nested PCR и репрезентативный анализ полученных пациентов NCCR-ампромтонами. A) ДНК, полученная из иммунокомпромиссных почечных трансплантологов, подверглась полугнезду ПЦР-усилителю с использованием олигонуклеотидных грунтовок, связанных с местами ограничения AgeI и SpeI. В скобках указаны имена и длина праймера (базовые пары) архетипических O, P, q, R и S-блоков от штамма BKPyV JN192438. B) Ампликоны были проанализированы с помощью электрофореза в 1,5% агарозного геля и визуализированы с помощью окрашивания ДНК. M1 й 100 bp лестница, WT - дикий тип (архетипический), rr - переставлены, вставки , del' удаления, DUN и Dunlop Штамм. C) Плазмида пищеварения с AgeI и SpeI. Переваренные фрагменты были проанализированы с помощью электрофореза в 1,5% агарозного геля и визуализированы с помощью окрашивания ДНК. M1 - 100 б.п. лестница, М2 и 2-бревная лестница. NC - отрицательный контроль (процоблик). Положительный клон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Клонирование и проверка NCCR в двойной флуоресценции репортера. Представительные результаты плазмидного секвенирования. Амплаконы очищались с помощью комплекта для очистки ПЦР и подвергались секвенированию Сэнгера. Соответствующие последовательности были приведены в соответствие с последовательностью NCCR, полученной из архетипического штамма BKPyV JN192438. Удаления и замены отмечены красным цветом. Указаны сайты ограничения AgeI и SpeI, переводное начало открытого чтения eGFP (напечатано жирным шрифтом), а также блоки NCCR O-S. Соответствующие блоки и места ограничения выделены в цвете. Длина каждого блока NCCR в базовых парах печатается в скобках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Представитель флуоресценции микроскопии анализа ранней и поздней деятельности промотора NCCR. A) Генная карта двойного флуоресценции репортера под контролем двунаправленных промоутер. Как описано ранее5 плазмид ный pTA-tdTOM-NCCR-eGFP (6,009 bp) гавани SV40 конце полиаденилации сигнал вниз по течению каждого выражения кассеты для обеспечения сопоставимой и эффективной обработки обеих стенограмм для tdTomato (ранний выражения) и eGFP (позднее выражение), соответственно. NCCR окружен AgeI и SpeI. Вектор содержит кассету сопротивления ампициллин для отбора во время процедуры клонирования. B) HEK293T клетки были трансфицированы с двойной флуоресценции репортер строит каждый под контролем пациента производных NCCR последовательностей (NCCR1-2). Клетки подверглись анализу яркой и флуоресценционной микроскопии 72 ч после трансфекции. Настройки фильтра микроскопа использовались в следующих диапазонах возбуждения: зеленый для tdTomato (515-560 нм) и синий для eGFP (450-490 нм). В правом нижнем углу каждой фотографии указана панель масштаба (200 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 : Представитель FACS анализа. Показана простая стратегия gating, необходимая для этого метода. Используются двухпараметрные плотности или точечные участки. A) Во-первых, FSC построен против Pacific Blue, в то время как только DAPI отрицательный (т.е. живые клетки) далее обрабатываются. B-F) FITC (eGFP) против PE (tdTomato) построены. C-D) Добавьте исключительно зеленые и красные флуоресцентные клетки, чтобы настроить компенсацию на цитометр потока. E-F) В этом примере ингибиторы mTOR INK128 и значительно снижают TdTomato MFI, что соответствует снижению раннего экспрессии генов BKPyV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Имя праймер | Последовательность (5' и 3') |
| BK-CR-fwd1 | CCCAGGGCCtTTCAAGGC |
| BK-CR-rev1 | CCTCTAAAAAATTCCAGCAAAAGC |
| БКВ-КР-2-ФВ-АгеИ | AAAAAACCACCGGTTTTGCGCGCAAAAGAAAAT |
| БКВ-КР-2-РВ-Спец | TTTTTTACTAGTCTGGCGCAACCATGGCCTT |
| EGFP-N | CGTCGCCCCCGCTCGACCACCACCAGAG |
Таблица 1: Олигонуклеотиды, используемые в этом протоколе. Подчеркнутые основания указывают на места ограничения ферментов для AgeI и SpeI, соответственно.
| Компонент | Объем/реакция (эл) | окончательная концентрация |
| Безrза | 32,8 л л | - |
| 10x буфер ПЦР | 5 зл | 1x |
| dNTPs (10 мМ каждого) | 1 зл | 0,2 мМ каждого dNTP |
| Fwd-праймер (10 мкм) | 3 зл | 0,3 мкм |
| Rev-праймер (10 мкм) | 3 зл | 0,3 мкм |
| Так Полимераза | 0,2 л л | 2 единица/реакция |
| Шаблон ДНК | 5 зл | Реакция злт;0,5 мкг/50 л |
Таблица 2: Мастер смешать протокол подготовки. Инструкция применяется как к пред-, так и к вложенным реакциям ПЦР, описанным в шагах 2.2 и 2.7, соответственно.
| Температура | Длительность | ПЦР-шаг | Циклов |
| 95 градусов по Цельсию | 5 мин. | Первоначальная денатурация | |
| 95 градусов по Цельсию | 30 сек | Денатурация | |
| 55 градусов по Цельсию | 34 сек | Отжига | x35 |
| 72 градусов по Цельсию | 1 мин. | Расширение | |
| 72 градусов по Цельсию | 10 мин. | Окончательное расширение | |
| 4 градуса по Цельсию | ∞ | Охлаждения |
Таблица 3: Программа ПЦР, используемая для усиления NCCR. Инструкция применяется как к до-, так и к вложенным реакциям ПЦР.
| Реагента | Объем/реакция (эл) | окончательная концентрация |
| DNase-бесплатно H20 | 6 | до 20 л |
| 10x Буфер | 2 | 1x |
| AgeI | 1 | 10 единиц |
| СпеИ | 1 | 10 единиц |
| очищенный ПЦР-ампликон | 10 Лет | Переменной |
Таблица 4: Протокол пищеварения amplicon. Инструкция применяется для одновременного пищеварения ДНК ампикона с двумя ферментами ограничения, описанными в шаге 3.1.
| Реагента | Объем/реакция (эл) | окончательная концентрация |
| DNase-бесплатно H20 | 14.5 | до 20 л |
| 10x Буфер | 2 | 1x |
| AgeI | 1 | 10 единиц |
| СпеИ | 1 | 10 единиц |
| Плазменый позвоночник (1 мкг/л) | 1,5 | 1,5 мкг |
Таблица 5: Протокол пищеварения плазмида. Инструкция применяется для одновременного пищеварения плазмидной ткани ДНК с двумя ферментами ограничения, описанными в шаге 3.3.
| Реагента | Объем/реакция (эл) | окончательная концентрация |
| DNase-бесплатно H20 | 7 (г. | до 20 л |
| T4 ДНК лигаза | 1 | 20 |
| 10x T4 ДНК лигаза буфер | 2 | 1x |
| Очищенный плазмидный костяк Низкий растопить разбавленный 1/2 от шага 3.5 |
2 | Переменной |
| Усваивается и очищается ПЦР-апромлик он со ступени 2.7 | 8 | Переменной |
Таблица 6: Протокол перевязки плазмида. Инструкция применяется для перевязки плазмидной ткани ДНК с переваренной ДНК ампликона ПЦР, описанной в шаге 3.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье представлен широко используемый метод, позволяющий проводить анализ некодирующего контроля региона BKPyV (NCCR), ориентированного на раннюю и поздняя активность промоутера. Активность NCCR может быть измерена одновременно и не нуждается в лизисе трансинфицированных клеток. Кроме того, можно проанализировать относительно большое количество клеток и не требуется совместное использование дополнительных маркеров для нормализации значений флуоресценции.
Важной частью этого метода является то, что клонированный NCCR должен содержать точно такие же последовательности, которые определены по секвенированию ампикона, что соответствует большинству вариантов, присутствующих в плазме пациента. Для достижения точных результатов и минимизации допущенных ПЦР ошибок настоятельно рекомендуется использовать полимераза с доказательной активностью чтения. Кроме того, последовательности могут быть заказаны коммерческими службами синтеза генов. Обозначенные последовательности NCCR могут быть заказаны в ключая фланговые места ограничения AgeI и SpeI для прямого клонирования. В этом случае переварить плазмид параллельно магистральной плазмид и заменить вставку прокладки соответствующим фрагментом NCCR из синтезированной конструкции. ДНК может быть альтернативно выделена из образцов мочи. Однако, так как BKPyV также выделяется в моче иммунокомпетентных лиц и не обязательно отражают активную репликацию, клиническая актуальность ограничена. В идеале, ДНК также может быть изолирована от почечной биопсии, в которой ранее PVAN может быть гистологически обнаружены (сравните с Корт и др., 201919).
Измеряя средней интенсивности флуоресценции зеленых и красных флуоресцентных клеток, этот метод позволяет количественно цофицировать ncCR полученных флуоресценции / деятельности без смещения эффективности трансфекции и анти-пролиферативного воздействия проверенных агентов (например, двойной mTOR ингибиторы INK128 или PP242)5.
Еще одним применением системы репортеров является возможность анализа последствий вставок, удаления или дублирования в НКЦР, обнаруженных в клинических изолятах на раннюю и поздняя промоторную активность. В предыдущих исследованиях были изучены иммуносупрессивные средства для модулирования активности НККр; однако не было обнаружено мутаций или перестановок NCCR, которые влияют на восприимчивость. Однако мутации могут повлиять на реакцию новых веществ, которые могут быть одобрены в ближайшем будущем.
Это может быть актуальным, поскольку в отличие от кодирующих регионов большой T антиген или VP1 капсид белка, NCCR, как следует из названия представляет собой некодирующую область и, таким образом, не лежит в основе селективного давления на уровне аминокислот.
В этом протоколе выбор положительных клонов, содержащих NCCR, проверяется AgeI и SpeI пищеварением. Тем не менее, колония PCR может представлять собой альтернативный подход к быстрому экрану для вставок NCCR непосредственно из кишечной палочки, покрытой на агарпластинах. Для этого подхода используйте грунтовую пару BKV-CR-2-fw-AgeI и EGFP-N(таблица 1). После трансфекции клетки проверяются на красную и зеленую флуоресценцию с помощью флуоресценционной микроскопии(рисунок 4). Кроме того, клетки могут быть исправлены с помощью 3% PFA в течение 20 минут при 22 градусах Цельсия. В этом случае, мыть с PBS, добавить 0,2% неионического моющего средства в PBS и инкубировать в течение 10 мин. Фиксированные клетки могут быть окрашены DAPI в PBS (1 мкг/мл) в течение 10 мин при 22 КС и подвергаются флуоресценции микроскопии анализа и визуализировать с ультрафиолетовым светом (340-380 нм).
Поскольку оба флюорофора питают одни и те же сигналы полиаденилаации, можно исключить эффект эффективности полиаденилации. Однако, по сравнению с eGFP, tdTomato является димерическим белком, который должен быть соответственно транскрибирован в более длинную мРНК (последовательность кодирования: 745 против 1431 bp, соответственно). Однако, поскольку активность промоутеров из клеток, обработанных интерферингующими веществами, всегда сравнивается по отношению к необработанным (DMSO) клеткам, эта разница играет незначительное значение. Из-за наличия происхождения репликации, трансфекция репортерплазмы в клетках, устойчиво выражающих SV40PyV большой T антиген позволяет передачу плазмидов в клетки дочери. Было показано, что SV40 полученных крупных T антиген может трансактивировать SV40 и BKPyV NCCR и вирусной репликации ДНК20. Однако, поскольку большой антиген T также участвует в переходе от ранней к поздней фазе инфекции, дается искусственная ситуация. Используя этот ассс, следует учитывать, что наиболее репликации ограничивающий шаг является раннее выражение, ведущие к выражению большого T антигена. Для того, чтобы сопоставить полный цикл репликации, ранние и поздние мРНК должны быть измерены в инфицированных клетках qRT-PCR, как описано в другом месте5,12.
Сопоставимый метод уже был использован швейцарскими и немецкими группами для анализа архетипической и перестроенной промоторной деятельности BKPyV NCCR, хотя и с независимыми клонированными векторными системами5,9. Госерт и его коллеги из Базеля использовали аналогичный метод для определения активности промотораNCCR штаммов BKPyV и JCPyV 9,10,11. Оба метода используются eGFP для зеленой флуоресценции; однако, группа Базеля использовала RFP, в то время как в текущем протоколе tdTomato использовался для красной флуоресценции. Преимущество tdTomato над RFP является гораздо более высокой фотостабильностью; однако, димерический белок кодируется последовательностью, которая в два раза длиннее, чем RFP21. Кроме того, период полураспада белков может быть разным, что приводит к неравной концентрации 72 ч после трансфекции. Однако эта проблема может быть актуальна только при непосредственном сравнении интенсивности флуоресценции. Gosert et al. использовали BamHI и NotI в качестве сайтов ограничений, в то время как в текущем протоколе AgeI и SpeI являются фланговыми последовательности NCCR. Используя оба метода, эталонный штамм DUNLOP16 дал сопоставимые модели флуоресценции с сильным ранним, но слабым поздним промоутером деятельности9,10. В дальнейшем соглашении, NCCR-перестановки с вставками в P-регионе привело к значительному увеличению ранней и поздней активности промоутера по сравнению с WT-NCCR5,9.
Хотя было показано, что SV40 полученных больших T антиген может трансактивировать SV40 и BKPyV производных NCCRs20, это может быть интересно использовать человеческие клетки, которые душно выразить большой T антиген BKPyV, а не прототип вируса SV40 в будущих исследованиях . Однако в этом случае клеточная линия должна быть легкотрансуктором (например, HEK293).
Поскольку промоутеры ПОЛиомавирусов NCCR очень похожи, этот метод также может быть использован (с небольшой адаптацией в грунтовых последовательностях) для исследования активности промоутеров и влияния мощных противовирусных препаратов на активность JC-полиомавируса (JCPyV) некодирующих контрольных регионов11. Так как JCPyV является возбудительным агентом прогрессивной мультифокальной лейкоэнцефалопатии (ПМЛ), редкого заболевания центральной нервной системы, которое редко может возникнуть у пациентов с иммунодефицитами, что приводит к тяжелой нейропатологии, существует также настоятельная необходимость найти непосредственнодействующих противовирусных веществ для лечения пациентов с ослабленным иммунитетом. Интересно, что перестановки также находятся в JC NCCRs11. Так как JCPyV имеет выраженный нейротропизм и, таким образом, большое количество вирусов находятся в ликере, приобретение образца должно быть скорректировано с ликером, полученным ИЗ ДНК. Однако последующие шаги могут быть легко адаптированы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Иоганнес Корт получил гранты на гонорар и командировочные расходы от Astellas и Novartis. Марек Видера получил консультационные сборы от Novartis. Оливер Витцке получил гранты на клинические исследования, гонорар докладчика, гонорар и путевые расходы от Amgen, Alexion, Astellas, Basilea, Biotest, Bristol-Myers-Squibb, Correvio, Chiesi, Gilead, Hexal, Janssen, Dr. F. K'hler Chemie, MSD, Novartis, Roche, Pfizer, Sanofi и TEVA.
Acknowledgments
Авторы благодарят Барбару Бликманн за отличную техническую помощь. Эти исследования были поддержаны IFORES-программой Медицинской школы Университета Дуйсбурга-Эссена и riMUR-программой Университетского альянса Рур и Научно-исследовательского центра Меркатора Рура (MERCUREl). Авторы благодарят юрген-Маншот-Стифтунг за докторскую стипендию Хелен Елене Серцниг и постоянную поддержку. Сбор и использование материалов для пациентов утверждены комитетом по этике медицинского факультета Университета Дуйсбург-Эссен (14-6028-BO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
References
- Drachenberg, C. B., et al. Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load. American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).
- Korth, J., et al. Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function. Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).
- Hirsch, H. H., et al. European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation. Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).
- Masutani, K., et al. The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome. American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).
- Korth, J., et al. Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region. Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).
- Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12. Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).
- Sanchez Fructuoso, A. I., et al. Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients. Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).
- Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis. Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).
- Gosert, R., et al. Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology. Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).
- Bethge, T., et al. Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression. Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).
- Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate. Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).
- Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression. American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).
- Widera, M., et al. HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia. Medical Microbiology Immunology. , (2017).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).
- Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland. Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).
- Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals. Virology. 198 (1), 59-70 (1994).
- Teutsch, K., et al. Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy. Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).
- Korth, J., et al. The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation. Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).
- Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens. Virology. 152 (2), 459-465 (1986).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
