Summary
この原稿では、tdTomatoおよびeGFPを発現する双方向レポータープラスミドをトランスフェクトしたHEK293T細胞を用いてBK-ポリオマウイルス転写活性のFACSベースの測定を行うプロトコルが提示される。この方法はさらに、ウイルス転写に対する新規化合物の影響を定量的に決定することを可能にする。
Abstract
BK-ポリオマウイルス(BKPyV)のようなポリオマウイルスは、免疫不全患者に重篤な病理を引き起こす可能性がある。しかし、現在、非常に効果的な抗ウイルス剤は入手できないため、潜在的な抗ウイルス剤の影響を測定する方法が求められている。ここでは、BKPyV非コード制御領域(NCCR)の早期および後期プロモーター活性の分析を可能にする二重蛍光レポーターを構築し、tdTomatoおよびeGFPを介してウイルス遺伝子発現に対する潜在的な抗ウイルス薬の影響を定量化した。式。また、このプロトコルで例示的に得られたBKPyV-NCCRアンプリコンをクローニングすることにより、免疫不全の腎移植患者の血液由来DNAから得られ、NCCR再配列がウイルス遺伝子発現に及ぼす影響を判定することができる。患者由来アンプリコンのクローニング後、HEK293T細胞をレポータープラスミドでトランスフェクトし、潜在的な抗ウイルス剤で治療した。続いて、細胞を平均蛍光強度72hポストトランスフェクションを測定するためのFACS分析を行った。また、潜在的な細胞周期阻害効果を有する薬物の分析をテストするために、トランスフェクトのみ、したがって蛍光細胞が使用される。このアッセイは大きなT抗原発現細胞で行われるので、早期発現と後期発現の影響を相互に独立した方法で分析することができる。
Introduction
ポリオマウイルスは、シミアンウイルス40(SV40)をプロトタイプ種として有する小さな二本鎖DNA(dsDNA)ウイルスの独立したファミリーを表す。一次感染は主に小児期に起こり、通常は疾患症状なしで進行し、通常は免疫有能な宿主で潜伏感染を引き起こす。BK-ポリオマウイルス(BKPyV)は、主に腎管細胞に腎症を引き起こすことなく持続するが、腎移植後の免疫能力の障害の場合、ウイルスは再活性化し、重度の損傷および移植片の障害を引き起こす可能性がある。高ウイルス血症(1 x 104 BKPyV DNAコピー/mL)1、2に達すると機能します。腎臓移植レシピエントのおよそ10%において、BK-ポリオマウイルス(BKPyV)の再活性化は、腎同種移植片障害のリスクが高い80%に関連したポリオマウイルス関連腎症(PyVAN)をもたらす3,4.承認された抗ウイルス剤が利用できないため、現在の治療は免疫抑制の減少に基づいている。興味深いことに、 mTOR 阻害剤は、抗ウイルス効果を持っているようです。;したがって、免疫抑制療法をmTORベースの免疫抑制に切り替えると、BKPyVウイルス血症5、6、7の進行を防ぐための代替アプローチを表しうる。しかし、mTORベースの抗ウイルス機構は現在まだ完全に理解されていない。したがって、臨床的に関連する濃度における潜在的な抗ウイルス剤の影響を測定する方法が必要とされる。
BKPyVの円形ゲノムは、複製の起源として機能する非コード制御領域(NCCR)を約5kbに収容し、それに付き合って早期および後期mRNA転写物の発現を駆動する双方向プロモーターで構成される。自発的に発生するNCCR再配列、欠損、および複製は病原性BKPyV8に見出され、PVAN 5、9に苦しむ患者において有意に蓄積されるので、原型(wt)および再配置された(rr)NCCR活動は、ウイルス複製性の適合性を特徴付けるために有用である。
図1に要約すると、このプロトコルは、レポータープラスミド5から発現した2つの蛍光体tdTomatoおよびeGFPの蛍光を定量することにより、BKPyV NCCR転写活性を測定するために一般的に使用される方法を説明する。9,10,11.この手順は、SV40大型T抗原(lTAg)の存在下で行われ、これは、NCCR活性の早期および後期に対する潜在的な抗ウイルス剤の影響を別々に5に分析することを可能にする。このアッセイは、NCCR活性に対する再配置の影響とwt-NCCR5,9との比較をさらに分析する。レポータープラスミドは、各蛍敵オープンリーディングフレームの下流にあるSV40後期ポリアデニル化信号を、tdTomatoおよびeGFPの両方のトランスクリプトの同等かつ効率的な処理を保証します。qRT-PCRベースの方法5、12と比較して、このFACSベースのアプローチは、感染した細胞培養のための複雑な抽出プロトコルがなく、高価ではないため、低コストで高スループット対応の代替手段を表します。免疫蛍光染色のための抗体が必要です。さらに、フローサイトメトリーを介して定義された量の蛍光細胞を分析するので、細胞周期阻害剤の分析も定量的に可能である。
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Protocol
このプロトコルは、デュースブルクエッセン大学(14-6028-BO)の医学部の倫理委員会によって承認された人間の研究のガイドラインに従います。
1. 血液または尿サンプルの採取とポリオマウイルスDNAの単離
- EDTAチューブまたは取得チューブ内の尿中の血液の少なくとも3 mLを収集します。
- 2,500 x gで15分間サンプルを遠心分離します。必要に応じて、ピペットプラズマを新しいチューブに入れ、プラズマサンプルを数日間4°Cで保存するか、-20°Cで凍結して長期保存します。
- 40 μLのプロテインサーゼKを1.5mLマイクロ遠心分離管に準備し、ピペッティングにより400μLのプラズマを追加します。
- 400 μLのリシスバッファーを加え、15sの渦を加えてサンプルをlyseし、56°Cで10分間インキュベートする。
- 製造元の指示に従ってDNA採取キットを用いてDNAを分離する。簡単に言えば、アルコールを追加し、DNA結合シリカベースの膜を含むスピンカラムにライサテスをロードします。純粋なDNAを得るために列を数回洗います。
- TE バッファーの 30-50 μL で得られた DNA を溶出します。
2. 非コーディング制御領域(NCCR)の増幅
- 物理的に離れた部屋で次の手順を実行します。試薬を準備し、PCRチューブにミックスを分配するために隔離された部屋を使用してください。
- プライマーペアA(表1)を合計体積50μLで使用してPCR前のマスターミックスを準備し、ステップ1.6から以前に単離したDNAを使用します。プレ PCR と入れ子になった PCR のマスター ミックスを準備するためのピペッティング スキームは、表 2に出力されます。
- マスターミックスの45 μLをPCRチューブに分配します。
- 単離されたDNAをPCRチューブに5μLを加えます。
注:汚染を避けるために、マスターミックスの準備のために1つ以外の部屋を使用してください。 - 表 3に示すように、反応条件を使用して PCR を実行します。35サイクルで脱退、アニーリング、延長を繰り返します。
- 入れ子になった増幅の場合は、AgeI および SpeI の制限部位を収容するプライマー ペア B を使用します (表1)。
- 手順 2.2 ~ 2.5 で説明したように、入れ子になった PCR を、PCR 前の 5 μL を使用して実行します。
- PCR製品の10 μLを6倍ゲルローディング色素の2μLと混合します。1.5%のアガロースゲルにミックスの10 μLをロードし、60 mAで30分間ゲルを実行します。
- 適切なUVドキュメンテーションシステムを使用してゲルを視覚化します。
注:アンプリコンのサイズは、再配置(削除、挿入、または重複)が発生したかどうかに応じて300~500 bpの間であると予想されます(図2C)。 - 製造元の指示に従って、PCR精製キットを使用してPCRアンプリコンを浄化します。溶出バッファーの30 μLでPCRアンプリコンを溶出します。
- プライマーペアBを使用してサンガーシーケンシング用のアンプリコンを送信します。
3. 二重蛍光レポーターへのNCCRのクローニング
- 表4に記載されているように、精製されたアンプリコン(ステップ2.10)をAgeIおよびSpeIで2時間37°Cで消化する。
- ステップ2.10を繰り返し、消化されたアンプリコンを精製します。
- 並行して、表5に記載されているように、プラスミドバックボーン(1.5 μg)をAgeIおよびSpeIで2時間37°Cで2時間消化する。この手順は 1 回だけ実行する必要があります。その後の反応については、-20°Cで消化を凍結します。
- 0.8%低溶融アガロースゲルで消化されたプラスミドバックボーンを分析します。
注:40 mAより高い電流でゲルを実行しないでください。もともとプラスミドpEX-K4 2-LTR CD313に由来するスペーサー領域の期待挿入は128 bp(図2C)である。 - 長波紫外線(320nm)を用いてDNA断片を可視化し、きれいなメスを使ってバックボーンバンドを切り取ります。低溶融ゲル断片を新しい1.5 mLマイクロ遠心管に移します。DNA損傷を防ぐために、長時間の紫外線曝露時間を避けてください。
注:低溶融アガロースを使用しているので、ライゲーションの前にDNAを精製する必要はありません。 - 低溶融アガロース片を含むバックボーンを65°Cで10分間加熱し、ゲル片を溶かし、穏やかな渦で2分ごとに混ぜます。溶融ゲルは、ライゲーションに直接使用することができます。
- 表6に示すスキームを用いて、T4 DNAリゲスを16°Cで一晩使用してバックボーンと消化アンプリコンをリゲートする。
- ヒートショック法、LBアンプレート上のプレート細菌、および一晩37°Cの培養を用いて大腸菌の形質転換を行う。
- 翌日、3つの陽性クローンを選択し、一晩大腸菌培養(LB-Ampの5mL)と37°Cの培養物を調製する。
- 他の場所で説明されているように標準プロトコルを使用してプラスミドDNAを分離し、AgeIとSpeI消化を行って陽性クローンをチェックし、1%アガロースゲル上の断片を視覚化します。スペーサーバンド(128 bp)は、より大きなNCCRシーケンス(300~500 bp、上記参照)に置き換えられます。
- プライマーEGFP-NまたはプライマーペアB(表1)を使用してサンガーシーケンシング用のプラスミドを送信します。
- 突然変異が自然に起こる可能性があるため、シーケンス結果とアンプリコンで得られたシーケンス結果を比較します。アンプリコンと比較して同じシーケンスを含むクローンのみを使用してください。
- 分子ワークベンチソフトウェア(フリーウェアGENtle 1.9.4またはその他のシーケンス編集プログラム)を使用して、得られたシーケンスを整列および編集します(図3)。
- GENtle 1.9.4 を起動し、[インポート] ボタン(緑色の下向き矢印) をクリックして DNA 配列をインポートします。
- 次にツールをクリックし、メニューから[整列]を選択します (ショートカットとして Ctrl キーを押しながら GG を使用)、位置合わせ用の DNA シーケンスを選択します。
- [削除] をクリックして[配列を追加]または[シーケンスを削除]をクリックして、配置にシーケンスを追加します。JN19243815のような原型NCCRコンセンサスシーケンスを含め、一般的に使用されるダンロップ株16からのNCCR配列を使用しないでください。株。
注: NCCR には、翻訳開始コドンが既に含まれています (図3)。 - ツールバーの[アルゴリズム]をクリックして位置合わせの方法を選択し、alustal W. アライメントパラメータを2に一致させる位置合わせパラメータを設定し、ギャップ延長ペナルティ-1;ギャップペナルティ-2をクリックして位置合わせを実行します。
4. レポータープラスミドによるHEK293T細胞の一過性トランスフェクションと潜在的な抗ウイルス剤による治療
- その後のトランスフェクション実験のために十分な量のプラスミドDNAを調製するために、150mLの一晩培養を調製する。プラスミド分離キットを用いてプラスミドDNAを単離する。あるいは、他のプラスミド精製キットを用いてもよい。
- シード1 x 105 HEK293T細胞を含むDMEM中の10%FCS、ペニシリンおよびストレプトマイシン(1x)を12ウェルプレートのウェル当たり24時間前にトランスフェクションし、37°Cおよび5%CO2で一晩インキュベートし、トランスフェクション中に活性増殖を維持する。
注:細胞はトランスフェクション時に約80%のコンフルエントでなければなりません。 - 減らされた血清培地の250 μLを無菌チューブに入れ、各レポータープラスミドDNAの1 μgを加え、ピペッティングで穏やかに混合します。
- DNA混合物にトランスフェクション試薬の3μLを加え、ピペッティングで穏やかに混合し、15分間インキュベートします。
- 混合物を井戸に滴下し、そっと井戸に分配します。
- 4時間後、上清を試験剤と溶媒制御を含む新鮮な培地に置き換えます。分析するまで37°Cでインキュベートします。この例では、mTOR阻害剤INK128(100 ng/mL)およびラパマイシン(100ng/mL)を用いた。
5. 蛍光顕微鏡とフローサイトメトリー
- 蛍光顕微鏡下で赤色と緑色の蛍光を細胞で確認してください(図4)。
注:赤色および緑色蛍光は、それぞれ初期および後期のBKPyV遺伝子発現に対応する。 - 72時間後トランスフェクション後、上清を吸引し、1mLの冷たいPBSで細胞を2回洗浄する。
- 500 μLのトリプシンをゆっくりと加え、細胞の早期剥離を避けるためにプレートを少し回します。この手順は、セルの二重化を避けるために重要です。
- 追加した後、同じピペットチップで直接トリプシンを削除します。
- 細胞を37°Cで少なくとも5分間インキュベートします。
- 3%FCSを含むPBSの1 mLでトリプシン化された細胞を再懸濁し、事前に標識されたFACSチューブに懸濁液を移します。
- FACS 解析の前に DAPI (1 μg/mL) を追加します。
- フローサイトメーターを使用して細胞を分析します。各サンプルについて、DAPI染色に対して陰性である少なくとも10,000個の生細胞を測定します。
6. データ分析
- フローサイトメトリー解析ソフトウェアにデータをインポートし、クリックしてワークスペースにドラッグしてサンプルを追加します。
- 読み込んだファイルをダブルクリックして、グラフプロットを作成します。X 軸と Y 軸をクリックして、FSC-A と SSC-A を選択します。ツールバーのポリゴンをクリックし、セルの母集団をフレーミングして、メインセルの人口をゲートします(図5)。必要に応じて、選択したセルの母集団に名前を付けます (たとえば、"単一セル")。"単一のセル" が新しいワークスペースとして表示されます。
- DAPI陰性(すなわち「生細胞」)の「単一細胞」をゲーティングに進めます。生細胞を同定するために、DAPI染色の有無にかかわらず細胞集団を比較する。どちらのプロットでも FSC-A と太平洋青-A を選択します。
- 長方形をクリックしてDAPI陰性細胞集団を選択し、選択した細胞集団に「生細胞」という名前を付け、前述のようにFITC(eGFP)とPE(tdTomato)を示す新しいドットプロットを作成します。
- ツールバーから[クワッド]を選択して、「生きているセル」に象限を追加します。各個体の端に象限の中心をドラッグして、母集団をゲートします。象限は、1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM+, 3) eGFP+tdTOM-, 4) eGFP+tdTOM+を表します。
注:FITCとPEの間の放出スペクトルのスペクトルオーバーレイのために、最初の補償は赤と緑の信号を区別し、正確な結果を達成するために不可欠です。 - 象限を右クリックし、[統計の追加] を選択して、平均蛍光強度 (MIS) を決定します。[平均]を選択し、[OK] をクリックします。 平均 MFI は、「統計」セクションの母集団の下に表示されるようになりました。象限 2 と 4 は初期式に対応し、象限 3 と 4 は後期式を表します。
- 統計力のために同じ方法で追加の反復を追加します。
- データ解釈の場合は、バープロットの早期および後期のMFI値をプロットします。
- 異なるドナーまたはウイルス株から得られたNCCR活性を比較するには、原型制御またはダンロップ株16を追加し、その相対MFIを100%に設定し、相対MFI値を計算する。各反復を繰り返し、平均と標準偏差を決定します。
- 転写活性に対する潜在的な化合物の効果を評価するには、溶媒対照を100%に設定し、処理された細胞のMFIをプロットする。
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Representative Results
この代表的な実験では、BK-ポリオマウイルス非コード制御領域駆動転写活性をフローサイトメトリーを介して測定した。さらに、BKPyV再活性化後の患者の治療に使用される可能性のあるmTOR阻害剤を、ウイルス早期遺伝子発現の阻害について試験した。この目的のために、二重蛍光レポーターアッセイは、以前に公表された5として使用された。実験セットアップの全体的なワークフロースキームは、F igure 1に示されています。まず、免疫不全の腎移植患者からの血液サンプルを、制度倫理委員会の承認を受けたヒト研究のガイドラインに従って採取した。血液はEDTA含有チューブで採取され、相は遠心分離によって分離された。続いて、400μLの血漿をポリオマウイルスDNAの単離に用いた。非符号化制御領域(NCCR)は、外側のプライマーペアBKV-CR-1fwおよびBKV-CR-1rvを用いて図2Aに示すように入れ子になったPCRプロトコルを用いて増幅し、インナープライマーペアBKV-CR-2fw-AgeI(プライマーAgeI)とBKV-CR-2rvpe-SRV-SRV-SRVI(プライマー・アゲイ)を用いて増幅した。プライマーSpeI)17は、後者はAgeIとSpeIの制限サイトを収容します。アンプリコン検証は、図2Bに示すようにアガロースゲル電気泳動を介して行った。原型NCCR配列(wt)に由来するアンプリコンはゲル中に均質なサイズ分布を有していたが、挿入(rrins)と欠損(rr del)を用いて再配置されたNCCRに由来するものは、そのサイズ(約300〜500bp)が異なっていた。特に、再配置のために、コントロールとして含まれていたダンロップNCCR参照配列16(DUN)は、原型ウイルスから得られたNCCRよりも大きかった。アンプリコンは予測サイズに対応しているため、精製されたPCR製品は、さらなる分析のためにレポータープラスミドにクローニングされた配列と後で比較するためにサンガーシーケンシングのために送られました。
アンプリコンのクローニングのために、AgeIとSpeIの2つの制限酵素を用いて消化を行った。標準的なクローニング手順を用いて行った二重蛍光レポーターにクローニングした後、NCCRを含む陽性クローンの選択をAgeIおよびSpeI消化(図2C)によって検証した。ここで、小さなスペーサー領域(NC、128 bp)を、正のクローンを示すより大きなNCCRフラグメント(約300〜500bp)に置き換えた。検証されたクローンから単離されたプラスミドDNAは、サンガーシーケンシングのために送られ、アンプリコンシーケンシングから得られた配列と比較した(図示せず)。さらなる処理のために、アンプリコン配列に一致するクローンのみが選択されました。図3に示すように、シーケンス結果を原型NCCR配列(JN192438)と比較した。この例では、P ブロック内の削除と O ブロックの置換が検出されました。
その後、細胞培養におけるクローンNCCR配列の転写活性を試験するために、HEK293T細胞は、それぞれのレポーター構築物を一時的にトランスフェクトした(図4A)。図4Bで可視化したように、トランスフェクション効率およびNCCR活性は、蛍光顕微鏡を介してモニタリングした。赤色および緑色蛍光は、BKPyV遺伝子発現の早期および後期にそれぞれ5に対応した。細胞は、効率的な早期および後期の運動活性を示す両方の蛍動体を発現した。2つの実施例に示すように、第1のNCCR(NCCR1)は強い後期遺伝子発現を示し、第2の例(NCCR2)は比較的強い初期であるが中程度の後期遺伝子発現を有していた(図4B)。従って、フローサイトメトリー測定用のサンプルを調製した。プロトコルセクション6で説明したように、DAPI陰性細胞をゲート化し(図5A、下パネル)、eGFP対tdTomatoを示すドットプロットを作成した。陰性のサンプル(図5B)と、tdTomato(図5C)またはeGFP(図5D)のみ陽性のサンプルを分析に含めた。なお、初期補償が行われ、赤色と緑の信号を区別し、正確な結果を達成するために不可欠である18.平均蛍光強度は、各試験クローンから導出した。ここで、tdTomato陽性細胞は早期発現に対応し、eGFP陽性細胞は後期発現を表した。この例では、デュアルmTOR阻害剤INK128による治療は、tdTomato MFI(図5E-F)を有意に減少させた。
図 1: 実験セットアップのワークフロースキーム。1)血液(代替尿)サンプルの採取、2)ポリオマウイルスDNA3の単離)入れ子化されたPCRプロトコルを用いた非コード制御領域(NCCR)の増幅、4)アガロースゲル電気泳動およびアンプリコン検証, 5) PCRアンプリコンのサンガーシーケンシング, 6) AgeIとSpeIを用いて二重蛍光レポーターにNCCRのクローニング, 7)陽性クローンの選択, 8)プラスミドDNAのサンガーシーケンシング, 9)レポータープラスミドを用いたHEK293T細胞の過渡透過と試験対象化合物の添加、10)効率的なトランスフェクションを検証する蛍光顕微鏡検査、11)フローサイトメトリー解析、12)ゲーティングおよびeGFP tdTomato式の分析, 13)データ解釈.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: ネストされたPCRと患者由来NCCRアンプリコンの代表的な分析。A)免疫不全腎移植患者に由来するDNAを、制限部位AgeIおよびSpeIと連結したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて半ネストされたPCR増幅を行った。BKPyV株JN192438からの原型O、P、Q、R、およびSブロックのプライマー名と長さ(塩基対)が括弧内に示されている。B)アンプリコンを1.5%アガロースゲルの電気泳動により分析し、DNA染色を用いて可視化した。M1 = 100 bp はしご、wt = ワイルドタイプ (原型)、rr = 再配置、ins = 挿入、del = 削除、DUN = ダンロップ歪み。C)AgeIおよびSpeIとのプラスミド消化。消化断片を1.5%のアガロースゲルで電気泳動で分析し、DNA染色を用いて可視化した。M1 = 100 bp はしご、M2 = 2 ログ ラダー。NC = 負の制御 (スペーサー)。+ = 正のクローン。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 二重蛍光レポーターへのNCCRのクローニングと検証。プラスミドシーケンシングの代表的な結果。アンプリコンをPCR精製キットを用いて精製し、サンガーシーケンシングを施した。それぞれの配列は、原型BKPyV株JN192438に由来するNCCR配列に整列した。削除と置換は赤でマークされます。AgeIおよびSpeI制限部位には、eGFPオープンリーディングフレーム(太字で印刷)の翻訳開始とNCCRブロックO-Sが示されている。それぞれのブロックと制限サイトが色で強調表示されます。基本ペアの各 NCCR ブロックの長さは、括弧内に印刷されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: NCCRプロモーター活性の代表的な蛍光顕微鏡分析。A)双方向プロモーターの制御下にある二重蛍光レポーターの遺伝子マップ。前述の5プラスミドpTA-tdTOM-NCCR-eGFP(6,009 bp)は、tdTomato(早期)の両方のトランスクリプトの同等かつ効率的な処理を確実にするために、各発現カセットの下流にSV40後期ポリアデニル化信号を収容します。式)と eGFP (後期式) をそれぞれ使用します。NCCRはAgeIとSpeIによって横たわっています。ベクトルはクローニングプロシージャの間に選択のためのアンピシリン抵抗カセットを含んでいる。 B)HEK293T細胞を、患者由来NCCR配列(NCCR1-2)の制御下でそれぞれ二重蛍光レポーターを構築してトランスフェクトした。細胞を明視野および蛍光顕微鏡分析72hポストトランスフェクションに供した。顕微鏡のフィルター設定は、tdTomato(515-560 nm)の緑とeGFP(450-490 nm)の青の励起範囲で使用しました。各写真の右下にスケールバー(200μm)が表示されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: 代表的なFACS分析。この方法に必要な単純なゲーティング戦略を示します。2 パラメータ密度またはドット プロットが使用されます。A)まず、FSCはパシフィックブルーに対してプロットされ、DAPI陰性(すなわち生細胞)のみがさらに処理されます。B-F)FITC (eGFP) と PE (tdTomato) がプロットされます。C-D)フローサイトメーターの補正を調整するために、緑色および赤色の蛍光細胞を排他的に追加します。E-F)この例では、mTOR阻害剤INK128とtdTomato MFIを有意に減少させ、これはBKPyV早期遺伝子発現の減少に相当する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| プライマー名 | シーケンス (5' → 3') |
| BK-CR-fwd1 | カッカッカグトットカッグ |
| BK-CR-rev1 | CCTCTAACAAAAtCCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA |
| BKV-CR-2-fw-AgeI | AAAAAAAGGTTTTTTTAAAAAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAGG |
| BKV-CR-2-rv-SpeI | TTTTTTアクタグトッグッカガアッカッチェット |
| EGFP-N | CGTCGCCGTCCCGCGAG |
表 1:このプロトコルで使用されるオリゴヌクレオチド。下線付き塩基は、それぞれAgeIとSpeIの制限酵素部位を示す。
| コンポーネント | 体積/反応 (μl) | 最終濃度 |
| ルナースフリーウォーター | 32.8 μL | - |
| 10x PCRバッファ | 5 μL | 1x |
| dNTP (各 10 mM) | 1 μL | 各 dNTP の 0.2 mM |
| Fwd プライマー (10 μM) | 3 μL | 0.3 μM |
| レブプライマー(10 μM) | 3 μL | 0.3 μM |
| タクポリメラーゼ | 0.2 μL | 2ユニット/反応 |
| テンプレート DNA | 5 μL | <0.5 μg/50 μL 反応 |
表 2:マスターミックス準備プロトコル。この命令は、手順 2.2 および 2.7 で説明されているように、入れ子になった PCR 反応の両方にそれぞれ適用されます。
| 温度 | 期間 | PCR ステップ | サイクル |
| 95°C | 5 分 | 初期の非核化 | |
| 95°C | 30秒 | 変性 | |
| 55°C | 34秒 | 焼鈍 | ×35 |
| 72°C | 1 分 | 拡張子 | |
| 72°C | 10分 | 最終拡張子 | |
| 4°C | ∞ | 冷却 |
表 3:NCCR増幅に使用されるPCRプログラム。この命令は、入れ子になった PCR 反応の両方に適用されます。
| 試薬 | 体積/反応 (μl) | 最終濃度 |
| DNaseフリーH20 | 6 | 20 μl まで |
| 10xバッファ | 2 | 1x |
| エイジ | 1 | 10ユニット |
| スペイ | 1 | 10ユニット |
| 精製されたPCR-アンプリコン | 10歳 | 変数 |
表 4:アンプリコン消化プロトコル。この命令は、ステップ3.1に記載の2つの制限酵素を用いるアンプリコンDNAの同時消化に適用されます。
| 試薬 | 体積/反応 (μl) | 最終濃度 |
| DNaseフリーH20 | 14.5年 | 20 μl まで |
| 10xバッファ | 2 | 1x |
| エイジ | 1 | 10ユニット |
| スペイ | 1 | 10ユニット |
| プラスミドバックボーン (1 μg/μL) | 1.5年 | 1.5 μg |
表 5:プラスミド消化プロトコル。この命令は、ステップ3.3に記載の2つの制限酵素を有するプラスミドDNAバックボーンの同時消化に適用される。
| 試薬 | 体積/反応 (μl) | 最終濃度 |
| DNaseフリーH20 | 7 | 20 μl まで |
| T4 DNAリエーゼ | 1 | 20歳 |
| 10x T4 DNAリゲスバッファー | 2 | 1x |
| 精製プラスミドバックボーン ステップ3.5から1/2希釈された低溶融 |
2 | 変数 |
| ステップ 2.7 から消化および精製された PCR アンプリコン | 8 | 変数 |
表 6:プラスミドライゲーションプロトコル。この命令は、ステップ3.7に記載の消化されたPCRアンプリコンDNAを用いたプラスミドDNAバックボーンのライゲーションに適用される。
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Discussion
本稿では、BKPyV非コード制御領域(NCCR)の早期および後期プロモーター活性の分析を可能にする一般的に使用される方法が提示される。NCCR活性は同時に測定することができ、トランスフェクトされた細胞のリシスを必要としない。さらに、比較的多くの細胞を分析することができ、蛍光値の正規化のための追加マーカーの共トランスフェクションは必要ありません。
この方法の重要な部分は、クローン化されたNCCRがアンプリコンシーケンシングによって識別されるのとまったく同じ配列を含むべきであり、これは患者血漿中に存在する大多数の変異体に対応する。正確な結果を達成し、PCRが発生しやすいエラーを最小限に抑えるために、証拠読み取り活性を持つポリメラーゼを使用することを強くお勧めします。あるいは、配列は、市販の遺伝子合成サービスによって注文することができる。指定されたNCCRシーケンスは、直接クローンを作成するためのサイドエイジIおよびSpeI制限サイトを含む注文することができます。この場合、プラスミドをバックボーンプラスミドに平行に消化し、スペーサーインサートを合成コンストラクトから対応するNCCRフラグメントに置き換えます。DNAは、尿サンプルから代わりに単離することができる。しかし、BKPyVは免疫能力を有する個人によって尿中に分泌され、必ずしも活性複製を反映するとは限られていないため、臨床的関連性は限られている。理想的には、DNAは、以前にPVANが組織学的に検出され得る腎生検から単離することもできる(Korth et al., 201919と比較して)。
緑蛍光細胞と赤色蛍光細胞の平均蛍光強度を測定することにより、この方法は、試験された薬剤のトランスフェクション効率および抗増殖効果(例えば、デュアルmTOR)の偏りなしにNCCR由来蛍光/活性を定量化することを可能にする。阻害剤 INK128 または PP242)5.
レポーターシステムのもう一つの応用は、初期および後期の運動活動における臨床分離物に見られるNCCRにおける挿入、欠損、または複製の結果を分析する可能性である。以前の研究では、免疫抑制剤はNCCR活性を調節するために研究されています。しかし、感受性に影響を与える変異またはNCCR再配列は見出されなかった。しかし、突然変異は、近い将来承認される可能性のある新しい物質の応答に影響を与える可能性があります。
これは、大きなT抗原またはVP1キャプシドタンパク質のコード領域とは対照的に、その名前が示すNCCRは非コード領域を表し、したがってアミノ酸レベルでの選択的圧力を下さないため、関連する可能性がある。
このプロトコルでは、NCCRを含む陽性クローンの選択は、AgeIおよびSpeI消化によって検証される。しかし、コロニーPCRは、寒天プレートにメッキされた大腸菌からNCCRインサートを迅速にスクリーニングするための代替アプローチを表す場合があります。この方法では、プライマー ペア BKV-CR-2-fw-AgeI および EGFP-N (表1) を使用します。トランスフェクション後、蛍光顕微鏡を用いて赤色および緑色蛍光を検査する(図4)。あるいは、細胞は22°Cで20分間3%PFAを用いて固定することができる。この場合、PBSで洗浄し、PBSに0.2%の非イオン性洗剤を加え、10分間インキュベートし、固定細胞は22°Cで10分間PBS(1μg/mL)でDAPIで染色し、蛍光顕微鏡分析を行い、UV光(340-380 nm)で可視化します。
両方の蛍風素は同じポリアデニル化信号を持ち、ポリアデニル化効率の効果を排除することができる。しかし、eGFPと比較して、tdTomatoは、それに対応してより長いmRNA(コード配列:745対1431 bp)に対応して転写しなければならない薄暗質タンパク質である。しかし、干渉物質で処理された細胞からのプロモーターの活性は常に未処理(DMSO)細胞と比較されるので、この違いはほとんど役割を果たしません。複製の起源の存在に起因して、SV40PyV大型T抗原を安定的に発現する細胞におけるレポータープラスミドのトランスフェクションは、娘細胞へのプラスミドの転写を可能にする。SV40由来の大型T抗原は、SV40およびBKPyV NCCRおよびウイルスDNA複製20を転全させることができることが示されている。しかし、感染の初期から後期への移行にも大きなT抗原が関与しているため、人工的な状況が与えられる。このアッセイを用いて、最も複製制限工程は、大きなT抗原の発現につながる初期発現であると考えなければならない。完全な複製サイクルをマッピングするためには、早期および後期のmRNAを、他の場所で説明するようにqRT-PCRによって感染細胞で測定する必要があります 5,12.
同等の方法は、独立してクローン化されたベクターシステム5、9であっても、BKPyV NCCR由来のプロモーター活動を分析するために、スイスとドイツのグループによって既に使用されている。バーゼルのGosertたちは同様の方法を用いて、BKPyVおよびJCPyV株9、10、11のNCCRプロモーター活性を決定した。両方の方法は、緑色蛍光のためのeGFPを使用しました;しかし、バーゼル群は、現在のプロトコルtdTomatoで赤色蛍光に使用されている間、RFPを使用した。RFP上のtdTomatoの利点は、はるかに高い光安定性です。しかし、ダイメリックタンパク質は、RFP21の2倍の長さである配列によってコードされる。さらに、タンパク質の半減期は異なる可能性があり、トランスフェクション後72hの不等濃度をもたらす。ただし、この問題は、両方の蛍光強度を直接比較する場合にのみ関連する場合があります。Gosertらは、現在のプロトコルAgeIとSpeIがNCCRシーケンスを横切っている間、制限サイトとしてBamHIとNotIを使用しました。両方の方法を用いて、基準DUNLOP株16は、強い早期であるが弱い後期プロモーター活性9、10と同等の蛍光パターンを得た。さらなる合意では、P領域への挿入を伴うNCCR再配列は、wt-NCCR5,9と比較した場合の早期および後期プロモーター活性の有意な増加をもたらした。
SV40由来の大型T抗原がSV40とBKPyV由来NCCR20をトランス活性化できることが示されているが、今後の研究ではプロトタイプウイルスSV40ではなくBKPyVの大型T抗原を安定的に発現するヒト細胞を用いるのは興味深いかもしれない。.しかし、この場合、細胞株はトランスフェクトしやすい(例えば、HEK293)でなければならない。
ポリオマウイルスのNCCRプロモーターは非常に類似しているので、この方法はまた、プロモーター活性と強力な抗ウイルス剤がJC-ポリオマウイルス(JCPyV)の活性に及ぼす影響を調べるために(プライマー配列における小さな適応で)使用することができる。派生非コーディング制御領域11.JCPyVは進行性多発性白血球脳症(PML)の原因源であり、重度の神経病理学をもたらす免疫不全患者ではまれに発生する稀な中枢神経系疾患であるため、見つける必要性も急いである。免疫侵害患者を治療するために直接作用する抗ウイルス物質。興味深いことに、JC NCCR11にも再配置が見られる。JCPyVは神経栄養症を顕著に示し、したがって大量のウイルスが酒類に見られるので、サンプル獲得は酒由来のDNAに調整されなければならない。ただし、後続の手順は簡単に調整できます。
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Disclosures
ヨハネス・コルスは、アステラスとノバルティスから講演料と旅費の助成金を受けています。マレク・ワイデラはノバルティスからコンサルタント料を受け取っています。オリバー・ヴィッツケは、アムジェン、アレクシオン、アステラス、バシリア、バイオテスト、ブリストル・マイヤーズ・スクイブ、コレビオ、キエシ、ギリアド、ヘクサル、ヤンセン、F.ケーラー・シェミー博士、MSD、ノヴェルティスから臨床研究、講演者料、名誉、旅費の助成金を受けています。ファイザー、サノフィ、テバ
Acknowledgments
著者らは、バーバラ・ブリークマンに優れた技術支援を感謝しています。これらの研究は、デュースブルク・エッセン大学医学部のIFORESプログラムと大学アライアンス・ルール・アンド・メルカトル研究センター・ルール(MERCUR)のRIMURプログラムによって支援されました。著者らは、ヘレネ・セルツニッヒの博士課程のフェローシップと絶え間ない支援に対して、ユルゲン・マンチョット・スティフトゥンに感謝しています。患者材料の収集と使用は、大学デュースブルクエッセン(14-6028-BO)の医学部の倫理委員会によって承認されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
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