Summary
In questo manoscritto, viene presentato un protocollo per eseguire la misurazione basata su FACS dell'attività trascrizionale BK-poliomavirus utilizzando cellule HEK293T trascate da un plasmide reporter bidirezionale che esprime tdTomato ed eGFP. Questo metodo permette inoltre di determinare quantitativamente l'influenza di nuovi composti sulla trascrizione virale.
Abstract
I poliomavirus, come il BK-poliomavirus (BKPyV), possono causare gravi patologie nei pazienti immunocompromessi. Tuttavia, poiché attualmente non sono disponibili antivirali altamente efficaci, sono necessari metodi che misurano l'impatto di potenziali agenti antivirali. Qui, è stato costruito un reporter a doppia fluorescenza che consente l'analisi dell'attività di promotrice bKPyV basata sulla regione di controllo non codificante (NCCR) in anticipo e in ritardo per quantificare l'impatto di potenziali farmaci antivirali sull'espressione genica virale tramite tdTomato ed eGFP espressione. Inoltre, clonando gli amplificatori BKPyV-NCCR che in questo protocollo sono stati esemplificati dal DNA derivato dal sangue dei pazienti trapiantati renali immunocompromessi, è possibile determinare l'impatto dei riarrangiamenti NCCR sull'espressione genica virale. Dopo la clonazione del paziente derivato amplicons, le cellule HEK293T sono state trascate con il reporter-plasmidi e trattate con potenziali agenti antivirali. Successivamente, le cellule sono state sottoposte all'analisi FACS per misurare le intensità medie di fluorescenza 72 h dopo la trasfezione. Per testare anche l'analisi dei farmaci che hanno un potenziale effetto di inibizione del ciclo cellulare, vengono utilizzate solo cellule trasfette e quindi fluorescenti. Poiché questo saggio viene eseguito in grandi cellule che esprimono l'antigene T, l'impatto dell'espressione precoce e tardiva può essere analizzato in modo reciprocamente indipendente.
Introduction
I poliomavirus rappresentano una famiglia indipendente di piccoli virus di DNA a doppio filamento (dsDNA) con il virus Simian 40 (SV40) come specie prototipo. L'infezione primaria si verifica principalmente durante l'infanzia, che di solito procede senza sintomi di malattia e di solito causano infezioni latenti in ospiti immunitari competenti. Il BK-poliomavirus (BKPyV) persiste principalmente nelle cellule dei tubuli renali senza causare nefropatologie, tuttavia, in caso di compromissione della competenza immunitaria dopo il trapianto renale il virus può riattivarsi e causare gravi danni e alterati innesti quando si raggiunge una viremia alta (1 x 104 BKPyV copie di DNA/mL)1,2. In circa il 10% dei destinatari del trapianto di rene, la riattivazione del bK-poliomavirus (BKPyV) si traduce in un poliomavirus associato a nefropatia (PyVAN), che è stato fino all'80% associato ad un alto rischio di fallimenti di allotrapianto renale3,4 . Poiché non sono disponibili agenti antivirali approvati, la terapia attuale si basa sulla riduzione dell'immunosoppressione. È interessante notare che gli inibitori di mTOR sembrano avere un effetto antivirale; pertanto, il passaggio della terapia immunosoppressiva all'immunosoppressione a base di mTOR potrebbe rappresentare un approccio alternativo per prevenire la progressione della viremia BKPyV5,6,7. Tuttavia, il meccanismo antivirale basato su mTOR è attualmente ancora incompleto. Pertanto, sono necessari metodi che misurano l'impatto di potenziali agenti antivirali in concentrazioni clinicamente rilevanti.
Il genoma circolare del BKPyV è costituito da circa 5 kb che ospitano una regione di controllo non codificante (NCCR) che funge da origine della replicazione e concomitante un promotore bidirezionale che guida l'espressione di trascrizioni di mRNA di fase precoce e tardiva. Poiché si verificano spontaneamente riarrangiamenti, delezioni e duplicazioni di NCCR si trovano in BKPyV8 patogeni e significativamente accumulati in pazienti affetti da PVAN5,9, un confronto di archetipico (wt) e ri-organizzato (rr) NCCR-attività sono utili per caratterizzare la forma replicativa virale.
Come riassunto nella Figura 1, questo protocollo descrive un metodo comunemente usato per misurare l'attività trascrizionale BKPyV NCCR quantificando la fluorescenza di due fluorofori tdTomato ed eGFP espressi da un plotone reporter5, 9,10,11. La procedura viene eseguita in presenza del grande antigene T SV40 (lTAg), che permette di analizzare separatamente l'impatto di potenziali agenti antivirali sulla attività NCCR precoce e tardiva 5 . Questo analisi analizza ulteriormente l'impatto dei riarrangiamenti sull'attività della NCCR e il confronto con wt-NCCR5,9. Il plotone reporter ospita il segnale di poliadenilazione tardiva SV40 a valle di ogni telaio di lettura aperto del fluoroforo per garantire un'elaborazione comparabile ed efficiente di entrambe le trascrizioni per tdTomato ed eGFP, rispettivamente. Rispetto ai metodi basati su qRT-PCR5,12, questo approccio basato su FACS rappresenta un'alternativa compatibile a basso costo e ad alta velocità effettiva poiché nessun protocollo di estrazione complicato per la coltura cellulare infetta e non costoso anticorpi per la colorazione della fluorescenza immunitaria. Inoltre, poiché una quantità definita di cellule fluorescenti viene analizzata tramite la citometria di flusso, l'analisi degli agenti inibitori del ciclo cellulare è possibile anche in modo quantitativo.
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Protocol
Questo protocollo segue le linee guida della ricerca umana, come approvato dal comitato etico della facoltà di medicina dell'Università di Duisburg-Essen (14-6028-BO).
1. Raccolta di campioni di sangue o urina e isolamento del DNA poliomavirus
- Raccogliere almeno 3 mL di sangue in tubi EDTA o urina in tubi di acquisizione.
- Centrifugare il campione a 2.500 x g per 15 min. Se necessario, pipetta plasma in un nuovo tubo e conservare i campioni di plasma a 4 gradi centigradi per diversi giorni o congelare a -20 gradi per un deposito più lungo.
- Preparate 40 l di proteine assi K in un tubo di microcentrismo da 1,5 ml e aggiungete 400 l di plasma pipettando.
- Lesiilililcampione sommando 400 l di tampone di lisi, vortice per 15 s, e incubare per 10 min a 56 gradi centigradi.
- Isolare il DNA utilizzando un kit di estrazione del sangue del DNA come descritto nelle istruzioni del produttore. In breve, aggiungere alcol e caricare le lisa su una colonna di spin contenente una membrana a base di silice legante il DNA. Lavare le colonne più volte per produrre DNA puro.
- Eluire il DNA prodotto in 30-50 l di TE buffer.
2. Amplificazione della regione di controllo non codificante (NCCR)
- Eseguire la procedura seguente in locali fisicamente separati. Utilizzare una stanza isolata per preparare i reagenti e distribuire il mix ai tubi PCR.
- Preparare il Master Mix per il pre-PCR utilizzando la coppia di primer A (Tabella 1) in un volume totale di 50 gradi centigradi e utilizzare il DNA precedentemente isolato dal passaggio 1.6. Lo schema di pipettaggio per la preparazione del master mix per la PCR pre e nidificata viene stampato nella tabella 2.
- Distribuire 45 ll l della miscela master nei tubi PCR.
- Aggiungere 5 - L del DNA isolato nei tubi PCR.
NOTA: Utilizzare un'altra stanza a quella per la preparazione del mix master per evitare la contaminazione. - Eseguire la PCR con le condizioni di reazione, come illustrato nella tabella 3. Ripetere la denaturazione, l'annessione e l'estensione in 35 cicli.
- Per l'amplificazione nidificata utilizzare primer coppia B che ospita i siti di restrizione per AgeI e SpeI (Tabella 1).
- Eseguire la PCR nidificata con le condizioni di reazione descritte nei passaggi da 2,2 a 2,5 utilizzando 5 lofdeli del pre-PCR.
- Mescolare 10 l del prodotto PCR con 2 ll di 6x gel loading coloranti. Caricare 10 l della miscela su un gel di agarose dell'1,5% e far funzionare il gel per 30 min a 60 mA.
- Visualizzare il gel utilizzando un sistema di documentazione UV appropriato.
NOTA: si prevede che la dimensione dell'amplificatore sia compresa tra 300 e 500 bp a seconda che si siano verificati riarrangiamenti (eliminazioni, inserimenti o duplicazioni) (Figura2C). - Purificare gli amplificatori PCR utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore. Elute i PCR amplificano in 30 - L di tampone di eluizione.
- Invia gli amplicons per il sequenziamento di Sanger usando la coppia di primer B.
3. Clonazione del NCCR nel giornalista a doppia fluorescenza
- Digerire gli amplificatori purificati (passaggio 2.10) con AgeI e SpeI per 2 h a 37 gradi centigradi, come descritto nella tabella 4.
- Ripetere il passaggio 2.10 e purificare gli amplificatori digeriti.
- Parallelamente, digerire anche la spina dorsale del plasmide (1,5 g) con AgeI e SpeI per 2 h a 37 gradi centigradi, come descritto nella tabella 5. Questo passaggio deve essere eseguito una sola volta. Per le reazioni successive, congelare la digestione a -20 gradi centigradi.
- Analizzare la spina dorsale del plasmide digerito su un gel agarose a bassa fusione dello 0,8%.
NOTA: Non far funzionare il gel con una corrente superiore a 40 mA. L'inserimento previsto della regione distanziale originariamente derivato dal pEX-K4 2-LTR CD313 è di 128 bp (Figura 2C). - Visualizza i frammenti di DNA usando la luce UV a onde lunghe (320 nm) e ritaglia la banda della spina dorsale usando un bisturi pulito. Trasferire il frammento di gel a bassa fusione in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Evitare lunghi tempi di esposizione ai raggi UV per prevenire danni al DNA.
NOTA: Poiché viene utilizzata l'agarose a bassa fusione, non è necessario purificare il DNA prima della legatura. - Riscaldare la spina dorsale contenente il pezzo di agarose a bassa fusione per 10 minuti a 65 gradi centigradi al fine di sciogliere il pezzo di gel e mescolare ogni 2 min da vortice delicato. Il gel fuso può essere utilizzato direttamente per la legatura.
- Ligate la spina dorsale e l'amplificatore digerito utilizzando T4 DNA ligase durante la notte a 16 gradi centigradi utilizzando lo schema mostrato nella tabella 6.
- Eseguire la trasformazione in E. coli utilizzando il metodo di shock termico, i batteri delle piastre sulle piastre LB-amp e la coltura a 37 gradi centigradi durante la notte.
- Il giorno successivo, selezionare tre cloni positivi e preparare le colture E. coli durante la notte (5 mL di LB-Amp) e la coltura a 37 gradi centigradi.
- Isolare il DNA plasmide utilizzando protocolli standard come descritto altrove14, eseguire la digestione AgeI e SpeI per verificare la presenza di cloni positivi e visualizzare frammenti tagliati su un gel di agarose 1%. La banda distanziale (128 bp) sarà sostituita dalla sequenza NCCR più grande (300-500 bp, vedi sopra).
- Inviare il plasmide per il sequenziamento di Sanger utilizzando primer EGFP-N o la coppia di primer B (Tabella1).
- Poiché le mutazioni potrebbero verificarsi spontaneamente, confrontare i risultati del sequenziamento con i risultati del sequenziamento ottenuti con l'amplificatore. Utilizzare solo i cloni contenenti sequenze identiche rispetto all'amplificatore.
- Utilizzare un software di workbench molecolare (ad esempio, freeware GENtle 1.9.4 o altri programmi di editing di sequenze) per allineare e modificare le sequenze ottenute (Figura 3).
- Avviare GENtle 1.9.4 e importare le sequenze di DNA facendo clic sul pulsante Importa (freccia verde rivolta verso il basso).
- Quindi, fare clic su Strumento e selezionare Allineamento dal menu (Usa Ctrl-G come scorciatoia) e scegliere le sequenze di DNA per l'allineamento.
- Aggiungere una sequenza all'allineamento facendo clic su Aggiungi o rimuovi una sequenza facendo clic su Rimuovi. Includere una sequenza di consenso NCCR archetipica come JN19243815, non utilizzare la sequenza NCCR dal Comunemente usato Dunlop-strain16, dal momento che ospita riarrangiamenti e duplicato altri rispetto all'archetipico BKPyV Ceppi.
NOTA: il NCCR contiene già il codone di avvio traslazionale (Figura 3). - Scegliere un metodo per l'allineamento facendo clic su Algoritmo nella barra degli strumenti e scegliere clustal W. Impostare i parametri di allineamento in modo che corrispondano a 2; penalità estensione gap -1; penalità gap -2 e fare clic su OK per eseguire l'allineamento.
4. Trasfezione transitoria delle cellule HEK293T con il plasmide reporter e trattamento con potenziali agenti antivirali
- Per preparare una quantità sufficiente di DNA plasmide per i successivi esperimenti di trasfezione preparare una coltura overnight 150 mL. Isolare il DNA plasmico utilizzando un kit di isolamento plasmide. In alternativa, possono essere utilizzati altri kit di purificazione plasmida.
- Seme 1 x 105 cellule HEK293T in DMEM contenenti 10% FCS, penicillina e streptomicina (1x) per pozzo di una piastra di 12 pozzetti 24 h prima della trasfezione e incubare durante la notte a 37 gradi centigradi e 5% CO2 per mantenere la proliferazione attiva durante la transfezione.
NOTA: Le cellule devono essere circa l'80% di confluenti alla trasfezione. - Mettete 250 l di supporto siero ridotto in un tubo sterile e aggiungete 1 g di ogni schiaffeggiatore e mescolate delicatamente pipettando.
- Aggiungere 3 -L del reagente di trasfezione alla miscela di DNA, mescolare delicatamente pipettando e incubare per 15 min. Pre riscaldare il reagente di trasfezione alla temperatura ambiente di 22 gradi centigradi e vortice delicatamente prima dell'uso.
- Aggiungere la miscela goccia-saggio ai pozzi e distribuire delicatamente al pozzo.
- Dopo 4 h, sostituire il supernatante con un nuovo mezzo contenente gli agenti di prova e il controllo del solvente. Incubare a 37 gradi centigradi fino all'analisi. In questo esempio, sono stati utilizzati gli inibitori mTOR INK128 (100 ng/mL) e la rapamicicina (100 ng/mL).
5. Microscopia a fluorescenza e citometria di flusso
- Controllare le celle per la fluorescenza rossa e verde al microscopio a fluorescenza (Figura 4).
NOTA: la fluorescenza rossa e verde corrisponde rispettivamente all'espressione genica BKPyV precoce e tarda. - Dopo 72 h di post-trasfezione, aspirare il supernatante e lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS freddo.
- Aggiungere delicatamente 500 l di propsina e ruotare leggermente la piastra per evitare il distacco prematuro delle cellule. Questo passaggio è importante per evitare i doppietto cellulari.
- Dopo l'addizione, rimuovere la trypsin direttamente con la stessa punta di pipetta.
- Incubare le cellule per almeno 5 min a 37 gradi centigradi.
- Risospendere le celle tripsinate con 1 mL di PBS contenenti il 3% di FCS e trasferire le sospensioni in tubi FACS pre-etichettati.
- Aggiungere daPI (1 g/mL) prima dell'analisi FACS.
- Analizzare le cellule utilizzando un citometro di flusso. Per ogni campione, misurare almeno 10.000 cellule viventi, che sono negative per la colorazione DAPI.
6. Analisi dei dati
- Importare i dati nel software di analisi della citometria del flusso e aggiungere campioni facendo clic e trascinando nell'area di lavoro.
- Fare doppio clic sul file importato e creare un grafico. Scegliere FSC-A e SSC-A facendo clic sugli assi x e y. Cancellare la popolazione di celle principale facendo clic su Poligono sulla barra degli strumenti e inquadrando la popolazione di celle (Figura 5). Assegnare alla popolazione di celle scelta il nome necessario (ad esempio "celle singole"). Le "celle singole" verranno visualizzate come un nuovo spazio di lavoro.
- Procedere con il gating "singole celle" per DAPI negativo (cioè, "cellule viventi"). Identificare le cellule viventi confrontare la popolazione cellulare con e senza colorazione DAPI. In entrambi i grafici scegliere FSC-A contro pacific-blue-A.
- Fare clic sul rettangolo e scegliere la popolazione di cellule negative DAPI, denominare la popolazione cellulare scelta "celle viventi" e creare un nuovo grafico a punti che mostri FITC (eGFP) e PE (tdTomato) come descritto in precedenza.
- Aggiungere quadranti in "celle viventi" scegliendo Quad dalla barra degli strumenti. Cancellare la popolazione trascinando il centro del quadrante sul bordo di ogni popolazione. I quadranti rappresentano 1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM, 3) eGFP-tdTOM-, 4) eGFP-tdTOM.
NOTA: a causa della sovrapposizione spettrale degli spettri di emissione tra FITC e PE, la compensazione iniziale è essenziale per distinguere tra segnali rossi e verdi e per ottenere risultati accurati. - Determinare le intensità di fluorescenza media (MMI) facendo clic con il pulsante destro del mouse sul quadrante e scegliendo Aggiungi statistiche. Scegliere Media e fare clic su OK. La IFM media è ora visualizzata sotto la popolazione nella sezione "statistiche". I quadranti 2 e 4 corrispondono all'espressione iniziale, mentre i quadranti 3 e 4 rappresentano l'espressione tardiva.
- Aggiungere ulteriori repliche nello stesso modo per la potenza statistica.
- Per l'interpretazione dei dati tracciare i valori DI FIM di inizio e in ritardo in un grafico a barre:
- Per confrontare le attività NCCR ottenute da diversi donatori o ceppi di virus, aggiungere un controllo archetipico o il ceppo Dunlop16 e impostare le sue Unità MMI relative al 100% e calcolare i valori MFI relativi. Ripetere con ogni replica e determinare la media e la deviazione standard.
- Per valutare un effetto di potenziali composti sull'attività trascrizionale, impostare il controllo del solvente al 100% e tracciare le IFM delle cellule trattate.
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Representative Results
In questo esperimento rappresentativo, l'attività trascrizionale guidata dalla regione di controllo non codificabil Inoltre, un inibitore mTOR, che potrebbe essere usato per trattare i pazienti dopo la riattivazione di BKPyV, è stato testato per la sua inibizione dell'espressione genica precoce virale. A tal fine, un saggio a doppia fluorescenza-reporter è stato utilizzato come pubblicato in precedenza5. Lo schema di flusso di lavoro complessivo dell'installazione sperimentale è illustrato in Figure 1. In primo luogo, i campioni di sangue provenienti da pazienti trapiantati renali immunocompromessi sono stati raccolti secondo le linee guida della ricerca umana, come approvato dal comitato etico istituzionale. Il sangue è stato raccolto in tubi contenenti EDTA e le fasi sono state separate dalla centrifugazione. Successivamente, sono stati utilizzati 400 l di plasma per l'isolamento del DNA poliomavirus. L'area di controllo non codificante (NCCR) è stata amplificata utilizzando un protocollo PCR nidificato, come illustrato nella Figura 2A, utilizzando la coppia di primer esterni BKV-CR-1fw e BKV-CR-1rv, nonché la coppia interna di primer BKV-CR-2fw-AgeI (Primer AgeI) e BKV-CR-2rv-SpeI ( Primer SpeI)17, quest'ultimo dei quali ospita i siti di restrizione per AgeI e SpeI. La verifica dell'amplificatore è stata eseguita tramite elettroforesi gel agarose, come mostrato nella Figura 2B. Mentre gli amplificatori derivati da sequenze NCCR archetipiche (wt) avevano una distribuzione omogenea delle dimensioni nel gel, quelli derivati da NCR riarrangiati con inserimenti (rrins)ed eliminazioni (rrdel) differivano per dimensioni (circa 300-500 bp). In particolare, a causa di riarrangiamenti, la sequenza di riferimento 16 (DUN) del Dunlop NCCR, inclusa come controllo, era più grande del NCCR ottenuto da virus archetipici. Poiché gli amplificatori corrispondevano alle dimensioni previste, i prodotti PCR purificati sono stati inviati per il sequenziamento di Sanger per un successivo confronto con le sequenze clonate nel plasmide del reporter per ulteriori analisi.
Per la clonazione degli amplificatori, la digestione è stata eseguita utilizzando i due enzimi di restrizione AgeI e SpeI. Dopo la clonazione nel reporter a doppia fluorescenza, che è stato eseguito utilizzando la procedura di clonazione standard, la selezione di cloni positivi contenenti NCCR è stata verificata dalla digestione AgeI e SpeI (Figura 2C). Qui, la piccola regione distanziale (NC, 128 bp) è stata sostituita dai più grandi frammenti di NCCR (circa 300-500 bp) che indicano cloni positivi. Il DNA Plasmid isolato dai cloni verificati è stato inviato per il sequenziamento di Sanger e confrontato con le sequenze ottenute dal sequenziamento dell'amplicon (non mostrato). Solo i cloni che corrispondono alla sequenza dell'amplificatore sono stati scelti per un'ulteriore elaborazione. Come illustrato nella figura 3, i risultati della sequenza sono stati confrontati con una sequenza ncCR archetipica (JN192438). In questo esempio, sono state rilevate un'eliminazione nel blocco P e una sostituzione in O-block.
Per testare successivamente l'attività trascrizionale delle sequenze NCCR clonate nella coltura cellulare, le cellule HEK293T sono state trascate transitoriamente con i rispettivi costrutti reporter (Figura 4A). Come visualizzato nella Figura 4B, l'efficienza della trasfezione e l'attività NCCR sono state monitorate tramite microscopia a fluorescenza. La fluorescenza rossa e verde corrispondeva rispettivamente all'espressione genica BKPyV precoce e tardiva, rispettivamente5. Le cellule esprimevano sia fluorofori che indicavano un'efficiente attività promotoria precoce e tardiva. Come illustrato dai due esempi, il primo NCCR (NCCR1) ha mostrato una forte espressione genica tardiva, mentre il secondo esempio (NCCR2) ha avuto un'espressione genica tarda relativamente forte ma moderata (Figura 4B). Pertanto, sono stati preparati campioni per la misurazione della citometria di flusso. Come descritto nella sezione 6 del protocollo, le celle negative DAPI sono state gated (Figura5A, pannello inferiore) ed è stato creato un grafico a punti che mostra eGFP contro tdTomato. Nell'analisi sono stati inclusi nell'analisi campioni negativi (Figura 5B), nonché quelli positivi per tdTomato (Figura 5C) o eGFP (Figura 5D). Si noti che è stata eseguita una compensazione iniziale, che è essenziale per distinguere i segnali rossi e verdi e per ottenere risultati accurati18. Le intensità medi di fluorescenza sono state derivate da ogni clone di prova. Qui, le celle positive tdTomato corrispondono all'espressione precoce, mentre le cellule positive eGFP rappresentavano l'espressione tardiva. In questo esempio il trattamento con il doppio inibitore mTOR INK128 ha ridotto significativamente tdTomato MFI (Figura 5E-F), il che significa che l'espressione precoce è stata inibita.
Figura 1 : schema del flusso di lavoro per la configurazione sperimentale. 1) Raccolta di campioni di sangue (in alternativa urina), 2) Isolamento del DNA poliomavirus 3) Amplificazione della regione di controllo non codificante (NCCR) utilizzando un protocollo PCR nidificato, 4) Agarose gel elettroforesi e amplicon verifica, 5) Sequenziamento sanger dell'amplificatore PCR, 6) Clonazione del NCCR nel doppio reporter di fluorescenza utilizzando AgeI e SpeI, 7) Selezione di cloni positivi, 8) sequenziamento di Sanger del DNA plasmide, 9) Trasfezione transitoria delle cellule HEK293T con il plasmide reporter e l'aggiunta di composti da testare, 10) Microscopia fluorescenza per verificare la trasfezione efficiente, 11) Analisi della citometria di flusso, 12) Gating e analisi dell'espressione eGFP tdTomato, 13) Interpretazione dei dati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : PCR nidificato e analisi rappresentativa degli amplificatori NCCR derivati dal paziente. A) Il DNA derivato da pazienti oncologici renali immunocompromessi è stato sottoposto ad amplificazione PCR semi-nidificata utilizzando primer oligonucleotidi collegati a siti di restrizione AgeI e SpeI. I nomi e la lunghezza dei primer (coppie di base) dei blocchi archetipici O, P, Q, R e S del ceppo BKPyV JN192438 sono indicati tra parentesi. B) Gli amplicons sono stati analizzati per elettroforesi nell'1,5% di gel di agarose e visualizzati utilizzando la colorazione del DNA. M1 - 100 bp ladder, wt - wildtype (archetipico), rr - riarrangiato, ins - inserimenti, eliminazioni del, DUN - Dunlop Strain. C) Digestione plasmide con AgeI e SpeI. I frammenti digeriti sono stati analizzati per elettroforesi nell'1,5% di gel di agarose e visualizzati utilizzando la colorazione del DNA. M1 : 100 bp ladder, M2 - Scala a 2 log. NC - controllo negativo (distanziatore). : clone positivo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Clonazione e convalida della NCCR nel reporter a doppia fluorescenza. Risultati rappresentativi del sequenziamento plasmide. Gli Amplicons sono stati purificati utilizzando un kit di purificazione PCR e sottoposti a sequenziamento di Sanger. Le rispettive sequenze sono state allineate alla sequenza NCCR derivata dal ceppo archetipico di BKPyV JN192438. Le eliminazioni e le sostituzioni sono contrassegnate in rosso. Sono indicati i siti di restrizione AgeI e SpeI, l'inizio della traduzione del frame di lettura aperto eGFP (stampato in grassetto) e i blocchi NCCR O-S. I rispettivi blocchi e i siti di restrizione sono evidenziati a colori. La lunghezza di ogni blocco NCCR in coppie di basi viene stampata tra parentesi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Analisi rappresentativa della microscopia a fluorescenza dell'attività iniziale e tardiva promotrice della NCCR. A) Mappa genica del reporter a doppia fluorescenza sotto il controllo del promotore bidirezionale. Come descritto in precedenza5 il pTA-tdTOM-NCCR-eGFP (6.009 bp) ospita il segnale di poliamonizzazione tardiva SV40 di ciascuna cassetta di espressioni per garantire un'elaborazione comparabile ed efficiente di entrambe le trascrizioni per tdTomato espressione) e eGFP (espressione tardiva), rispettivamente. Il NCCR è affiancato da AgeI e SpeI. Il vettore contiene una cassetta di resistenza all'ampicillina per la selezione durante la procedura di clonazione. B) Le cellule HEK293T sono state trascate con costrutti di reporter a doppia fluorescenza, ciascuno sotto il controllo di sequenze NCCR derivate dal paziente (NCCR1-2). Le cellule sono state sottoposte all'analisi della microscopia a fluorescenza e a fluorescenza 72 h dopo la trasfezione. Le impostazioni del filtro del microscopio sono state utilizzate nei seguenti intervalli di eccitazione: verde per tdTomato (515-560 nm) e blu per eGFP (450-490 nm). La barra della scala (200 m) è indicata in basso a destra di ogni fotografia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Analisi FACS rappresentativa. Mostrato è la semplice strategia di gating necessaria per questo metodo. Vengono utilizzati grafici a densità a due parametri o a punti. R) In primo luogo, FSC è tracciata contro Pacific Blue, mentre solo DAPI negativo (cioè, le cellule viventi) sono ulteriormente elaborati. B-F) FITC (eGFP) e PE (tdTomato) sono tracciati. C-D) Aggiungere esclusivamente celle fluorescenti verdi e rosse per regolare la compensazione sul citometro di flusso. E-F) In questo esempio, gli inibitori mTOR INK128 e riducono significativamente il tdTomato MFI, che corrisponde a una riduzione dell'espressione genica precoce di BKPyV. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome primer | Sequenza (5' - 3') |
| BK-CR-fwd1 | CCCAGGCAGCTCTTTCAAGGC |
| BK-CR-rev1 | CCTCTAACAAAATTCCAGCAAAGC |
| BKV-CR-2-fw-AgeI | AAAAAAACCGGTTTTTGCAAAAtTGCAAAGAAGAATAGG |
| BKV-CR-2-rv-SpeI | TTTTTTACTAGTCTGGCGCAGAACCATGGCCTT |
| EGFP-N | CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG |
Tabella 1: Oligonucleotidi usati in questo protocollo. Le basi sottolineate indicano i siti enzimatici di restrizione per AgeI e SpeI, rispettivamente.
| componente | Volume/reazione (l) | concentrazione finale |
| Acqua senza RNani | 32,8 ll | - |
| Buffer PCR 10x | 5 ll | 1x (in modo non il |
| dNTP (10 mM di ciascuno) | 1 ll | 0,2 mM di ogni dNTP |
| Fwd-primer (10 m) | 3 l l | 0,3 M |
| Rev-primer (10 m) | 3 l l | 0,3 M |
| Polimerasi Taq | 0,2 l l | 2 unità/reazione |
| Modello DNA | 5 ll | <0,5 sg/50 - Reazione L |
Tabella 2: Protocollo di preparazione del mix master. L'istruzione si applica sia alle reazioni PCR pre che a quelli nidificate, come descritto nei passaggi 2.2 e 2.7, rispettivamente.
| temperatura | durata | Passo PCR | Cicli |
| 95 gradi centigradi | 5 min | Denaturazione iniziale | |
| 95 gradi centigradi | 30 sec | Denaturazione | |
| 55gradi centigradi | 34 sec | ricottura | x35 (in questo modo) |
| 72 gradi centigradi | 1 min | interno | |
| 72 gradi centigradi | 10 min | Estensione finale | |
| 4 gradi centigradi | ∞ | rinfrescante |
Tabella 3: programma PCR utilizzato per l'amplificazione NCCR. L'istruzione si applica sia alle reazioni PCR pre che a quelli nidificate.
| Reagente | Volume/reazione (l) | concentrazione finale |
| H20 senza DNane | 6 È possibile: | fino a 20 zerzoni |
| Buffer 10x | 2 Il nome del sistema | 1x (in modo non il |
| EtàI | 1 : il nome del | 10 unità |
| SpeI | 1 : il nome del | 10 unità |
| amplificatore PCR purificato | 10 del sistema | variabile |
Tabella 4: Protocollo di digestione dell'anlicon. L'istruzione si applica per la digestione simultanea del DNA dell'ansicono con due enzimi di restrizione descritti al punto 3.1.
| Reagente | Volume/reazione (l) | concentrazione finale |
| H20 senza DNane | 14,5 15 | fino a 20 zerzoni |
| Buffer 10x | 2 Il nome del sistema | 1x (in modo non il |
| EtàI | 1 : il nome del | 10 unità |
| SpeI | 1 : il nome del | 10 unità |
| Spina dorsale plasmid (1 g/l) | 1.5 1. | 1,5 g di g |
Tabella 5: Protocollo di digestione plasmide. L'istruzione si applica per la digestione simultanea della spina dorsale del DNA plasmide con due enzimi di restrizione descritti al punto 3.3.
| Reagente | Volume/reazione (l) | concentrazione finale |
| H20 senza DNane | 7 (in questo stato | fino a 20 zerzoni |
| T4 DNA ligase | 1 : il nome del | 20 anni |
| 10x T4 DNA ligase buffer | 2 Il nome del sistema | 1x (in modo non il |
| Spina dorsale Plasmid purificata Bassa fusione diluita 1/2 dal punto 3.5 |
2 Il nome del sistema | variabile |
| Amplificatore PCR digerito e purificato dal punto 2.7 | 8 (IN vio | variabile |
Tabella 6: Protocollo di legatura plasmide. L'istruzione si applica per la legatura della spina dorsale del DNA plasmide con il DNA dell'amplificatore PCR digerito descritto al punto 3.7.
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Discussion
In questo articolo viene presentato un metodo comunemente usato che consente l'analisi dell'attività BKPyV di controllo non codificante (NCCR) guidata in anticipo e in ritardo. L'attività NCCR può essere misurata simultaneamente e non necessita di lisi delle cellule trafette. Inoltre, è possibile analizzare un numero relativamente elevato di cellule e non è necessaria la co-trasfezione di marcatori aggiuntivi per la normalizzazione dei valori di fluorescenza.
Una parte fondamentale di questo metodo è che il NCCR clonato deve contenere esattamente le stesse sequenze identificate dal sequenziamento dell'amplicon, che corrisponde alla maggior parte delle varianti presenti nel plasma del paziente. Per ottenere risultati accurati e ridurre al minimo gli errori inclini alla PCR si consiglia vivamente di utilizzare una polimerasi con attività di lettura di prova. In alternativa, le sequenze possono essere ordinate mediante servizi di sintesi genica commerciale. Le sequenze NCCR designate possono essere ordinate, compresi i siti di restrizione AgeI e SpeI per la clonazione diretta. In questo caso, digerire il plasmide parallelo al plasmide della spina dorsale e sostituire l'inserto distanziale con il frammento NCCR corrispondente dal costrutto sintetizzato. Il DNA può essere isolato alternativamente da campioni di urina. Tuttavia, poiché il BKPyV è anche secreto nelle urine da individui immunocompetenti e non necessariamente riflette la replicazione attiva, la rilevanza clinica è limitata. Idealmente, il DNA può anche essere isolato dalle biopsie renali in cui in precedenza PVAN potrebbe essere rilevato istologicamente (confronto con Korth et al., 201919).
Misurando l'intensità media della fluorescenza delle cellule fluorescenti verdi e rosse, questo metodo consente di quantificare la fluorescenza/attività di fluorescenza derivata da NCCR senza la distorsione dell'efficienza della trasfezione e gli effetti anti-proliferazione degli agenti testati (ad esempio, il doppio mTOR inibitori INK128 o PP242)5.
Un'altra applicazione del sistema reporter è la possibilità di analizzare le conseguenze di inserimenti, delezioni o duplicazioni nel NCCR che si trovano negli isolati clinici sull'attività promotore precoce e tardiva. Negli studi precedenti, gli agenti immunosoppressori sono stati studiati per modulare l'attività ncCR; tuttavia, non sono state trovate mutazioni o riarrangiamenti NCCR che influenzino la suscettibilità. Tuttavia, le mutazioni possono influenzare la risposta di nuove sostanze che potrebbero essere approvate nel prossimo futuro.
Questo potrebbe essere rilevante in quanto, a differenza delle regioni di codifica, ad esempio un grande antigene T o una proteina capside VP1, il NCCR come il nome implica rappresenta una regione non codificante e quindi non sottende una pressione selettiva a livello degli amminoacidi.
In questo protocollo, la selezione di cloni positivi contenenti il NCCR viene verificata dalla digestione di AgeI e SpeI. Tuttavia, una colonia PCR potrebbe rappresentare un approccio alternativo per lo screening rapido per gli inserti NCCR direttamente da E. coli placcati su piastre di agar. Per questo approccio, utilizzare la coppia di primer BKV-CR-2-fw-AgeI ed EGFP-N (Tabella 1). Dopo la traffessura, le cellule vengono controllate per la fluorescenza rossa e verde mediante microscopia a fluorescenza (Figura 4). In alternativa, le cellule possono essere fissate utilizzando 3% PFA per 20 min a 22 gradi centigradi. In questo caso, lavare con PBS, aggiungere lo 0,2% di detergente non ionico in PBS e incubare per 10 min. Le celle fisse possono quindi essere macchiate con DAPI in PBS (1 g/mL) per 10 min a 22 gradi centigradi e sottoposte all'analisi della microscopia a fluorescenza e visualizzate con luce UV (340-380 nm).
Poiché entrambi i fluorofori ospitano gli stessi segnali di poliadenilazione, si può escludere un effetto dell'efficienza della poliamonilazione. Tuttavia, rispetto all'eGFP, il tdTomato è una proteina dimericiana che deve essere trascritta in un mRNA più lungo (sequenza di codifica: 745 contro 1431 bp, rispettivamente). Tuttavia, poiché l'attività dei promotori delle cellule trattate con sostanze interferenti viene sempre confrontata rispetto alle cellule non trattate (DMSO), questa differenza svolge poco ruolo. A causa della presenza dell'origine della replicazione, la trasfezione del plotone reporter nelle cellule che esprimono stabilmente il grande antigene T SV40PyV consente il trasferimento di plasmidi alle cellule figlie. È stato dimostrato che l'antigene T di grandi dimensioni derivato da SV40 può trasattivare SV40 e BKPyV NCCR e la replicazione del DNA virale20. Tuttavia, poiché un grande antigene T è anche coinvolto nella transizione dalla fase iniziale a quella tardiva dell'infezione, viene data una situazione artificiale. Usando questo analisi, va considerato che il passo limitante più replica è l'espressione iniziale che porta all'espressione di grande antigene T. Al fine di mappare il ciclo di replica completo gli mRNA precoci e tardivi devono essere misurati nelle cellule infette da qRT-PCR come descritto altrove5,12.
Un metodo comparabile è già stato utilizzato da gruppi svizzeri e tedeschi per analizzare le attività promotorie archetipiche e riorganizzate di BKPyV NCCR, seppurte con sistemi vettoriali clonati in modo indipendente5,9. Gosert e colleghi di Basilea hanno utilizzato un metodo simile per determinare l'attività promotrice NCCR dei ceppi BKPyV e JCPyV9,10,11. Entrambi i metodi utilizzati eGFP per la fluorescenza verde; tuttavia, il gruppo di Basilea ha utilizzato RFP mentre nell'attuale protocollo tdTomato è stato utilizzato per la fluorescenza rossa. Il vantaggio di tdTomato rispetto a RFP è la fotostabilità molto più alta; tuttavia, la proteina dimeric è codificata da una sequenza che è due volte più lunga di RFP21. Inoltre, l'emivita delle proteine potrebbe essere diversa, con conseguente concentrazione disuguale 72 h post trasfezione. Tuttavia, questo problema potrebbe essere rilevante solo quando si confrontano direttamente entrambe le intensità di fluorescenza. Gosert et al. usò BamHI e NotI come siti di restrizione mentre nell'attuale protocollo AgeI e SpeI stanno affiancando la sequenza NCCR. Utilizzando entrambi i metodi, il ceppo DUNLOP di riferimento16 ha prodotto modelli di fluorescenza comparabili con forte attività di promotrice tardiva precoce ma debole9,10. In ulteriore accordo, il riarrangiamento della NCCR con inserimenti nella regione P ha comportato un aumento significativo dell'attività promotrice precoce e tardiva rispetto al wt-NCCR5,9.
Anche se è stato dimostrato che l'antigene T di grandi dimensioni derivato da SV40 può trasinnescare SV40 e BKPyV derivato NCCR20, potrebbe essere interessante utilizzare cellule umane che esprimono stabilmente il grande antigene T del BKPyV e non il prototipo di virus SV40 in studi futuri . Tuttavia, in questo caso la linea cellulare deve essere facile da tradurre (ad esempio, HEK293).
Poiché i promotori NCCR di poliomavirus sono molto simili, questo metodo può anche essere utilizzato (con piccolo adattamento nelle sequenze primer) per studiare l'attività promotrice e l'influenza di potenti agenti antivirali sull'attività del jC-poliomavirus (JCPyV) regioni di controllo non codifica derivate11. Poiché JCPyV è l'agente causale della leucoencelopatia multifocale progressiva (PML), una rara malattia del sistema nervoso centrale che raramente può verificarsi in pazienti con immunodeficienze risultanti in grave neuropatologia, c'è anche una pressante necessità di trovare sostanze antivirali ad azione diretta per il trattamento di pazienti immuno compromessi. È interessante notare che, riarrangiamenti si trovano anche in JC NCCR11. Dal momento che JCPyV ha pronunciato neurotropismo e quindi grandi quantità di virus si trovano nel liquore, l'acquisizione di campioni deve essere adattata al DNA derivato dal liquore. Tuttavia, i passaggi successivi possono essere facilmente adattati.
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Disclosures
Johannes Korth ha ricevuto sovvenzioni per le spese di oratore e viaggidano da Astellas e Novartis. Marek Widera ha ricevuto commissioni di consulenza da Novartis. Oliver Witzke ha ricevuto sovvenzioni per studi clinici, spese per gli oratori, onorarie e spese di viaggio da Amgen, Alexion, Astellas, Basilea, Biotest, Bristol-Myers-Squibb, Correvio, Chiesi, Gilead, Hexal, Janssen, Dr. F. K'hler Chemie, MSD, Novartis, Roche, Pfizer, Sanofi e TEVA.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Barbara Bleekmann per l'eccellente assistenza tecnica. Questi studi sono stati sostenuti dal programma IFORES della Scuola Medica dell'Università di Duisburg-Essen e dal programma RIMUR dell'Alleanza dell'Alleanza universitaria Ruhr e Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). Gli autori ringraziano il J'rgen-Manchot-Stiftung per la borsa di dottorato di Helene Sertznig e il supporto costante. La raccolta e l'uso del materiale per il paziente è stato approvato dal comitato etico della facoltà di medicina dell'Università Duisburg-Essen (14-6028-BO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
References
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