Summary
בכתב יד זה, פרוטוקול מוצג לבצע מדידה מבוססת FACS של וירוס BK-poly, באמצעות שימוש בתאי HEK293T באמצעות כתבת דו-מפלסי של כתב דו-כיווני המבטא tdTomato ו-eGFP. שיטה זו מאפשרת לקבוע את ההשפעה של תרכובות הרומן על תמלול ויראלי.
Abstract
וירוסים מפולדונים, כמו וירוס BK-polyדונים (BKPyV), יכול לגרום לפתווגיות חמורות בחולים חיסוני. עם זאת, מאז אנטי ויראלים יעילים מאוד אינם זמינים כרגע, שיטות מדידת ההשפעה של סוכני אנטי ויראליות פוטנציאליים נדרשים. כאן, כתב פלואורסצנטית כפול המאפשר ניתוח של BKPyV שאינו קידוד בקרת האזור (NCCR) מונחה מוקדם ומאוחר הפעילות יזם נבנה כדי לכמת את ההשפעה של תרופות אנטי ויראליות פוטנציאליים על ביטוי גנים נגיפי באמצעות tdTomato ו eGFP ביטוי. בנוסף, על ידי שיבוט BKPyV-NCCR הגברה אשר בפרוטוקול זה שהתקבלו בעבר מן ה-DNA הנגזר דם של חולי חיסוני מושתלים כליות, ההשפעה של NCCR-סידור מחדש על ביטוי גנים ויראלי ניתן לקבוע. בעקבות השיבוט של המטופל הופק הגברה, תאים HEK293T היו מזוהמים העיתונאי-פלמידים, וטיפל עם סוכני אנטי ויראליות פוטנציאליים. לאחר מכן, התאים היו חשופים FACS-ניתוח עבור מדידת ממוצע עוצמות זריחה 72 h לאחר התיקון. כדי לבדוק גם את הניתוח של תרופות כי יש מחזור התא פוטנציאלי השפעה מעכבת, רק מנוכר ובכך תאי פלורסנט משמשים. מאחר שהבדיקה מבוצעת בתאי T אנטיגן ביטוי גדול, ההשפעה של ביטוי מוקדם ומאוחר ניתן לנתח בצורה עצמאית הדדית.
Introduction
וירוסים פולידונים מייצגים משפחה עצמאית של קטן כפול תקועים DNA (dsDNA) וירוסים עם וירוס Simian 40 (SV40) כמו מינים אב טיפוס. הזיהום העיקרי מתרחשת בעיקר במהלך הילדות, אשר בדרך כלל להמשיך ללא תסמיני המחלה ובדרך כלל לגרום לזיהומים סמויים מארחים המוסמכים החיסונית. וירוס BK-פולידונים (BKPyV) ממשיך בעיקר בתאי tubules כליות מבלי לגרום לנפרולוגיה, עם זאת, במקרה של פגיעה ביכולת החיסון לאחר השתלת כליות הווירוס יכול להפעיל מחדש ולגרום נזקים חמורים השתל לקוי פונקציה בעת הגעה viremia גבוה (1 x 104 bkpyv העתקים DNA/mL)1,2. בתוך כ 10% של מקבלי השתלת כליה, ההפעלה מקדימה של וירוס BK-polyדונים (bkpyv) תוצאות וירוס מקושר הקשורים לנפרופתיה (pyvan), אשר היה עד 80% הקשורים בסיכון גבוה של כשלים השתלת כליות3,4 . מכיוון שלא קיימים סוכני אנטי-ויראליים מאושרים, הטיפול הנוכחי מבוסס על צמצום הדיכוי החיסוני. מעניין, מעכבי mTOR נראה שיש לו אפקט אנטי ויראלי; לפיכך, העברת הטיפול המדכא לדיכוי חיסוני מבוסס mtor עשוי לייצג גישה חלופית כדי למנוע התקדמות של virepyv ויסמיה5,6,7. עם זאת, מנגנון האנטי-ויראלי המבוסס על mTOR עדיין מובן לחלוטין. לפיכך, נדרשות שיטות למדידת ההשפעה של גורמי אנטי-ויראליים פוטנציאליים בריכוזים רלוונטיים של קליניות.
הגנום המעגלי של BKPyV מורכב כ 5 kb מחסה אזור שליטה ללא קידוד (NCCR) המשמש כמקור של השכפול ובמקביל יזם דו-כיווני המניע את הביטוי של מוקדם ומאוחר התעתיקים mRNA. מאז התרחשות באופן ספונטני nccr-rearrangements, מחיקות, וכפילויות מצויים ב-bkpyv הפתוגני8 והצטבר משמעותית בחולים הסובלים pvan5,9, השוואה של הארכיאופייני (wt) ו מסודרים מחדש (rr) NCCR-פעילויות מועילים לאפיין כושר replicative ויראלי.
כפי שסוכם באיור 1, פרוטוקול זה מתאר שיטה בשימוש נפוץ כדי למדוד את הפעילות הנפוצה של BKPyV nccr על ידי כימות הזריחה של שני fluorophores tdTomato ו-egfp ביטא מתוך הכתב פלבאמצע5, 9,10,11. ההליך מבוצע בנוכחות של האנטיגן T SV40 גדול (lTAg), אשר מאפשר לנתח את ההשפעה של סוכני אנטי ויראליים פוטנציאליים על מוקדם ומאוחר NCCR-פעילות בנפרד5. שיטת הפעולה עוד מנתחת את ההשפעה של הסדרים מחדש על פעילות nccr והשוואה עם wt-NCCRs5,9. הכתב פלסמאמצע הנמלים את האות SV40 מאוחר במורד במורד של כל fluorophore לפתוח מסגרת קריאה כדי להבטיח עיבוד דומה ויעיל של שני התעתיקים של tdTomato ו-eGFP, בהתאמה. בהשוואה לשיטות המבוססות על רביעיית ה-PCR,5,12, גישה זו מבוססת-facs מייצגת עלות נמוכה וחלופה גבוהה לתפוקה בקצב גבוה, מאחר שאין פרוטוקולי הוצאה מסובכים לתרבות התא הנגועה וללא יקר יש צורך בנוגדנים לצביעת מערכת הקרינה החיסונית. יתר על כן, מאז כמות מוגדרת של תאי פלורסנט מנותח באמצעות cy, הניתוח של מחזור התאים הסוכנים מעכבים ניתן גם באופן כמותי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות של המחקר האנושי כפי שאושרו על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת Duisburg-אסן (14-6028-BO).
1. אוסף דגימות דם או שתן ובידוד של דנ א וירוס רב-הסוכר
- לאסוף לפחות 3 מ ל של דם בצינורות EDTA או שתן בצינורות הרכישה.
- צנטריפוגה את המדגם ב 2,500 x g עבור 15 דקות. במקרה הצורך, יש לנקז את הפלסמה לתוך צינור חדש ולאחסן את דגימות הפלסמה ב -4 ° c למשך מספר ימים או להקפיא ב-20 ° c לאחסון ארוך יותר.
- הכינו 40 μL של הפרוטאינאז K לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ולהוסיף 400 μL של פלזמה על ידי ליטוף.
- Lyse את המדגם על-ידי הוספת 400 μL של מאגר הליזה, מערבולת עבור 15 s, ו-דגירה עבור 10 דקות ב 56 ° c.
- לבודד את ה-DNA באמצעות ערכת החילוץ דם DNA כפי שמתואר הוראות היצרן. בקצרה, להוסיף אלכוהול ולטעון את lysates על עמודת ספין המכיל ממברנה המבוסס סיליקה ה-DNA הממברנה. שטוף את העמודים מספר פעמים כדי להניב דנ א טהור.
- . בשנת 30-50 μL של מאגר ה-TE
2. הגברה של אזור הבקרה שאינו קידוד (NCCR)
- בצע את ההליך הבא בחדרים המופרדים פיזית. השתמש בחדר מבודד כדי להכין את הריאגנטים ולהפיץ את התערובת לצינורות ה-PCR.
- הכינו את התמהיל הראשי עבור הפרה-PCR באמצעות התחל (טבלה 1) בנפח כולל של 50 μl ולהשתמש ב-DNA מבודדים בעבר משלב 1.6. ערכת הליטוף להכנת המיקס הראשי עבור ה-PCR הטרום והמקונן מודפסת בטבלה 2.
- הפץ 45 μL של המיקס הראשי לצינורות ה-PCR.
- הוסף 5 μL של ה-DNA המבודד לצינורות ה-PCR.
הערה: השתמש בחדר אחר מאשר ההכנה לערבוב הורים כדי למנוע זיהום. - הפעל את ה-PCR עם תנאי התגובה כפי שמודגם בטבלה 3. חזור על הדנטורציה, הריפוי והסיומת ב-35 מחזורים.
- לשימוש מקונן הגברה להשתמש בזוג B מחסה את אתרי ההגבלה עבור AgeI ו SpeI (שולחן 1).
- הפעל את ה-PCR המקונן עם תנאי התגובה כמתואר בשלבים 2.2 עד 2.5 באמצעות 5 μL של הקדם-PCR.
- מערבבים 10 μL של המוצר PCR עם 2 μL של שישה x ג'ל טעינת צבע. טען 10 μL של התערובת על 1.5% agarose ג'ל, ולהפעיל את ג'ל עבור 30 דקות ב 60 mA.
- המחש את הג באמצעות מערכת התיעוד המתאימה של UV.
הערה: גודל אמפליקון צפוי להיות בין 300-500 bp בהתאם אם הסדרים מחדש (מחיקות, הוספות, או כפילויות) התרחשה (איור 2c). - טיהור ה-PCR באמצעות ערכת טיהור PCR לפי הוראות היצרן. . ב -30 μL של מאגר הימנעות
- שילחו את המתגברה לרצף שסנגר.
3. שיבוט של ה-NCCR לכתב הזריחה הכפולה
- לעכל את מגביר מטוהר (שלב 2.10) עם AgeI ו SpeI עבור 2 h ב 37 ° צ' כפי שמתואר בטבלה 4.
- חזור על שלב 2.10 וטהר את ההיגברה המתתעכלת.
- במקביל, גם לעכל את עמוד השדרה הפלמיד (1.5 μg) עם AgeI ו SpeI עבור 2 h ב 37 ° צ' כפי שמתואר בטבלה 5. רק פעם אחת צריך לבצע את השלב הזה. לתגובות עוקבות, הקפאת העיכול ב-20 ° c.
- לנתח את העמוד השדרה מתעכל על 0.8% ממיסים נמוכה ג'ל.
הערה: אל תפעיל את הג עם הזרם גבוה יותר מאשר 40 mA. התוספת הצפויה של אזור מרווח נגזר במקור pEX-K4 2-משמאל לימין CD313 הוא 128 Bp (איור 2c). - שברי DNA להמחיש באמצעות אור UV גל (320 nm) ולחתוך את הלהקה העמוד השדרה באמצעות אזמל נקי. להעביר את הרסיס הנמוך להמיס ג'ל לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 mL. למנוע הרבה זמן חשיפה UV כדי למנוע נזק DNA.
הערה: מאחר שנעשה שימוש בהמיס נמוך, אין צורך לטהר את הדנ א לפני הארכה. - לחמם את עמוד השדרה המכיל את החלק הנמוך להמיס agarose עבור 10 דקות ב 65 ° c על מנת להמיס את פיסת ג'ל ולערבב כל 2 דקות על ידי vortexing עדין. ג'ל נמס ניתן להשתמש ישירות לצורך הארכה.
- ליגייט השדרה ואת אמפליקון מתעכל באמצעות ה-DNA של T4 ליגאז בלילה על 16 ° צ' באמצעות הערכה המוצגת בטבלה 6.
- לבצע טרנספורמציה ב -E. coli באמצעות שיטת התחשמלות, חיידקים צלחת על צלחות LB-amp, ותרבות ב 37 ° c בלילה.
- ביום למחרת, לבחור שלושה שיבוטים חיוביים ולהכין לילה E. coli תרבויות (5 מ ל ליברות-Amp) ותרבות ב 37 ° c.
- לבודד את הפלמיד-DNA באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים כמתואר במקום אחר14, לבצע את העיכול Agei ו spei לבדוק שיבוטים חיוביים ולהמחיש לגזור שברי על 1% agei ג'ל. הלהקה מרווח (128 bp) יוחלפו על ידי הגדול NCCR-רצף (300-500 bp, ראה לעיל).
- שלח את הפלאמיד לקביעת רצף של סאנגר באמצעות פריימר EGFP-N או פריימר זוג B (שולחן 1).
- מאז מוטציות עלול להתרחש באופן ספונטני, להשוות את התוצאות ברצף עם תוצאות רצף המתקבלים עם amplicon. רק להשתמש שיבוטים המכילים רצפים זהים לעומת amplicon.
- השתמש בתוכנה מולקולרית ספסל העבודה (למשל, freeware 1.9.4 עדין או תוכניות אחרות לעריכת רצף) כדי ליישר ולערוך את רצפי שהתקבלו (איור 3).
- התחל 1.9.4 עדין ולייבא את רצפי ה-DNA על ידי לחיצה על כפתור ייבוא (ירוק למטה החץ).
- הקלק הבא על הכלי ובחר יישור מהתפריט (השתמש ב-Ctrl + G כקיצור דרך) ובחר ברצפי ה-DNA עבור יישור.
- הוסף רצף ליישור על-ידי לחיצה על הוסף או הסר רצף על-ידי לחיצה על הסר. כלול רצף הקונצנזוס NCCR ההסכמה כמו JN19243815, לא להשתמש ברצף nccr מן הנפוץ ביותר דנלופ-זן16, מאז הוא הנמלים לסדר מחדש את האחרים מאשר bkpyv הארכיאופייני זנים.
הערה: ה-NCCR כבר מכיל את ההתחלה הטרנסללית (איור 3). - בחר שיטה עבור היישור על-ידי לחיצה על האלגוריתם בסרגל הכלים ובחר באפשרות ' הגדר את פרמטרי היישור ' כדי להתאים 2; הרחבת הפער עונש -1; הפער עונש 2 ולחץ על אישור כדי להפעיל את היישור.
4. העברה ארעית של תאים HEK293T בעזרת הכתב הפלמיד והטיפול בסוכני אנטי-ויראליים פוטנציאליים
- כדי להכין כמויות מספיקות של דנ א פלסטי לניסויים שלאחר החצייה, להכין תרבות לילה 150 mL. . באמצעות ערכת בידוד פלבאמצע לחילופין, ערכות טיהור אחרות הפלסטיות ניתן להשתמש.
- Seed 1 x 105 HEK293T תאים ב-dmem המכיל 10% fcs, פניצילין ו-סטרפטומיצין (1x) לכל טוב של 12-באר צלחת 24 שעות לפני התפשטות ו הדגירה לילה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 כדי לשמור על ההפצה הפעילה במהלך הגלגול.
הערה: התאים אמורים להיות כ-80% בחיבור החוצה. - מקום 250 μL של מדיה סרום מופחת בצינור סטרילי ולהוסיף 1 μg של כל כתבת ה-DNA העיתונאי ומערבבים בעדינות על ידי ליטוף.
- הוסף 3 μL של הזיהום מגיב לתערובת ה-DNA, לערבב בעדינות על ידי ליטוף ו דגירה עבור 15 דקות. לחמם את החצייה מגיב לטמפרטורת הסביבה של 22 ° צ' ומערבולת בעדינות לפני השימוש.
- מוסיפים את התערובת לבארות ומפיצים בעדינות לבאר.
- לאחר 4 שעות, החלף את הסופרנטאנט במדיום טרי המכיל את סוכני הבדיקה ואת בקרת הממס. מודטה ב 37 ° צ' עד לניתוח. בדוגמה זו, שימשו מעכבי mTOR INK128 (100 ng/mL) ו rapamycin (100 ng/mL).
5. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית זרימה
- בדוק את התאים של הזריחה האדומה והירוקה תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטית (איור 4).
הערה: הקרינה האדומה והירוקה מתאימה לביטוי הגנים המוקדם והמאוחר של BKPyV, בהתאמה. - לאחר 72 h לאחר ההעברה, מטפי את הסופרנטנט ושוטף את התאים פעמיים עם 1 מ ל של ה-PBS הקרה.
- הוסף בעדינות 500 μL של טריפסין וסובב את הצלחת מעט כדי למנוע התנתקות מוקדמת של התאים. שלב זה חשוב להימנע מתאי כלטים.
- לאחר בנוסף, להסיר את הטריפסין ישירות עם אותו קצה הצינורות.
- מודקון את התאים לפחות 5 דקות ב 37 ° c.
- השהה מחדש את התאים באמצעות 1 mL של PBS המכיל 3% FCS ולהעביר את ההשעיה בצינורות FACS מראש מתויג.
- הוסף DAPI (1 μg/mL) לפני ניתוח ה-FACS.
- לנתח את התאים באמצעות cytometer זרימה. עבור כל דוגמה, למדוד לפחות 10,000 תאים חיים, אשר שליליים לצביעת DAPI.
6. ניתוח נתונים
- יבא את הנתונים לתוכנת ניתוח cy, והוסף דגימות על-ידי לחץ וגרור לתוך סביבת העבודה.
- לחץ פעמיים על הקובץ המיובא וצור מזימת גרף. בחר FSC-A לעומת המטה-מע על ידי לחיצה על ציר ה-x ו-y. שער את אוכלוסיית התא הראשי על- ידי לחיצה על מצולע בסרגל הכלים ומסגור את אוכלוסיית התאים (איור 5). נקוב בשמות של אוכלוסיית התאים הנבחרת כנדרש (לדוגמה "תאים בודדים"). "התאים היחידים" יופיעו כסביבת עבודה חדשה.
- המשך באמצעות "תאים בודדים" עבור DAPI שלילי (כלומר, "תאים חיים"). כדי לזהות תאים חיים, השווה בין אוכלוסיית התא לבין ובין אם כתמים של DAPI. בשתי החלקות בחרו FSC-A מול פסיפיק-כחול-A.
- לחץ על המלבן ובחר את האוכלוסיה השלילית של התאים DAPI, שם את האוכלוסייה בתאים הנבחרים "תאי החיים", וליצור העלילה נקודה חדשה המציגה FITC (eGFP) לעומת PE (tdTomato) כפי שמתואר לפני.
- הוסף רבעים ב"תאים חיים" על-ידי בחירה באפשרות Quad מסרגל הכלים. שער את האוכלוסייה על ידי גרירת מרכז הרביע עד לקצה של כל אוכלוסיה. הרביעים מייצגים 1) eGFP-tdTOM-, 2. eGFP-tdTOM +, 3) Efp + tdTOM-, 4) eGFP + tdTOM +.
הערה: בשל הכיסוי הספקטרלי של ספקטרום הפליטה בין ה-FITC ו-PE, הפיצוי הראשוני חיוני להבחנה בין אותות אדומים וירוקים ולהשיג תוצאות מדויקות. - קביעת עוצמות של כוונות זריחה (MFIs) על ידי לחיצה ימנית על הרביע ובחירה באפשרות ' הוסף סטטיסטיקה'. בחר ' ממוצע ' ולחץ על ' אישור'. MFI ממוצע כעת מוצג מתחת לאוכלוסיה בסעיף "סטטיסטיקות". רביעים 2 ו-4 תואמים לביטוי מוקדם, בעוד שרביעים 3 ו-4 מייצגים ביטוי מאוחר.
- הוסף שכפול נוסף באותו אופן עבור כוח סטטיסטי.
- עבור פרשנות נתונים להתוות ערכי MFI של מוקדם ומאוחר לתוך מגרש בר:
- כדי להשוות את הפעילויות NCCR שהתקבלו מתורמים שונים או זנים וירוסים, להוסיף פקד הארכיאופייני או זן דנלופ16 ולהגדיר mfis היחסי שלה ל 100%, ולחשב את ערכי mfis היחסי. חזור על הפעולה כאשר כל שכפול וקבע ממוצע וסטיית תקן.
- כדי להעריך את ההשפעה של תרכובות פוטנציאליות על הפעילות הטרנססקריפט, להגדיר את שליטה הממס ל 100% ולהתוות את MFI של התאים התייחסו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בניסוי מייצג זה, אזור הבקרה של וירוס BK-פולידוני שאינו קידוד מונחה הפעילות הטרנסדטית נמדדה באמצעות הזרימה cy, try. בנוסף, מעכב mTOR, אשר עשוי לשמש לטיפול בחולים אחרי BKPyV ההפעלה מראש, נבדק על העיכוב שלה של הביטוי הגן הקדומה ויראלי. למטרה זו, שימש שיטת הכתבת הפלואורסצנטית כפולה כפי שפורסמה בעבר5. ערכת זרימת העבודה הכוללת של הכיוונון הנסיוני מומחש ב- Figure 1. ראשית, דגימות דם מהחולים מושתלים כליות חיסוני נאספו על פי ההנחיות של מחקר אנושי כפי שאושרה על ידי ועדת האתיקה המוסדית. הדם נאסף ב-EDTA המכילים צינורות והשלבים הופרדו על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, 400 μL של פלזמה שימש עבור בידוד של ה-DNA וירוס polyדונים. אזור הבקרה שאינו קידוד (NCCR) הוגדל באמצעות פרוטוקול מקונן-PCR כפי שמודגם באיור 2A באמצעות צמד הפריימר החיצוני BKV-cr-1 fw ו-BKV-cr-1fw, כמו גם, הפנימי התחל זוג BKV-cr-2A-Agei (פריימר agei) ו BKV-cr-2A-spei ( פריימר שפיי)17, האחרון שממנו מנמלים את אתרי ההגבלה של agei ושפיי. האמפליב וידוא התבצע באמצעות אלקטרופורזה בג ג'ל כמוצג באיור 2B. בעוד ההגברה הנובעת מרצפי NCCR (wt) בגודל הומוגניות, היתה התפלגות מידה אחידה בג, אלה שנגזרו מNCCRs עם הוספות (rr) ומחיקות (rrdel) שונים בגודלם (כ-300-500 bp). בעיקר, בשל הסדרים מחדש, את דנלופ NCCR התייחסות רצף16 (DUN), אשר נכלל כפקד, היה גדול יותר מאשר nccr שהתקבל מווירוסים הארכיטיפוסיים. מאז ההגברה התכתב עם הגדלים החזויים, המוצרים המטוהרים של ה-PCR נשלחו לרצפי הרצף של סאנגר לצורך השוואה מאוחרת יותר עם הרצפים ששוכבו לניתוח בדיקה נוספת.
עבור שיבוט של הגברה, העיכול בוצעה באמצעות שני אנזימי הגבלה AgeI ו SpeI. לאחר שיבוט לתוך כתב הזריחה הכפולה, שבוצעה באמצעות הליך שיבוט רגיל, מבחר של שיבוטים חיוביים המכילים את NCCR אומת על ידי העיכול AgeI ו SpeI (איור 2C). כאן, אזור מרווח קטן (NC, 128 bp) הוחלף על ידי שברי NCCR גדול יותר (כ. 300-500 bp) המציין שיבוטים חיוביים. ה-DNA פלמיד מבודד שיבוטים מאומת נשלחו עבור רצפי הרצף ובהשוואה עם רצפים שהתקבלו מתוך הרצף של (לא מוצג). רק המשובטים התואמים את הרצף אמפליקון נבחרו לעיבוד נוסף. כפי שמתואר באיור 3, התוצאות ברצף הושוו עם רצף nccr אופייני (JN192438). בדוגמה זו, זוהו מחיקה בבלוק P והחלפה ב-O-block.
כדי לבדוק לאחר מכן את הפעילות הטרנסדבית של רצפי NCCR המוכפל בתרבות התאים, HEK293T תאים התעברו מעבר למבנה העיתונאי המתאים (איור 4A). כפי שדמיינו באיור 4B, היעילות הטרנסאפיטית ופעילות nccr-מנוטרים באמצעות מיקרוסקופ קרינה. הקרינה האדומה והירוקה התכתב עם הביטוי הגנטי המוקדם והמאוחר של BKPyV, בהתאמה5. התאים הביעו שניהם fluorophores המציין פעילות קדם-המשך מוקדם ומאוחר. כפי שמודגם בשתי הדוגמאות, ה-NCCR הראשונה (NCCR1) הציגה ביטוי מאוחר של גנים מאוחרים, בעוד הדוגמה השנייה (NCCR2) הייתה ביטוי גנטי מוקדם יחסית וחזק ביותר אך מתון (איור 4B). כך, דגימות היו מוכנות לזרם cy, למדוד מדידה. כפי שמתואר בסעיף 6, תאים DAPI שליליים היו מגודרת (איור 5A, פאנל תחתון) ומגרש נקודה נוצר מראה egfp לעומת tdTomato. דגימות שהיו שליליות (איור 5B), כמו גם אלה חיובי עבור tdTomato (איור 5b) או Egfp (איור 5b) בלבד, נכללו בניתוח. הערה, הפיצוי הראשוני בוצע, אשר חיוני כדי להבחין אותות אדום וירוק כדי להשיג תוצאות מדויקות18. משמעות הכוונות הפלואורסצנטית נגזר מכל שיבוט בדיקה. כאן, תאים tdTomato חיוביים התכתב עם ביטוי מוקדם בזמן eGFP תאים חיוביים מיוצגים ביטוי מאוחר. בדוגמה זו הטיפול עם מעכבי mTOR כפול INK128 הופחת באופן משמעותי tdTomato MTOR (איור 5E-F), כלומר הביטוי המוקדם היה מעוכב.
איור 1 : ערכת זרימת עבודה עבור ההתקנה הניסיונית. 1) אוסף של דם (לחילופין שתן) דגימות, 2) בידוד של ה-DNA וירוס מגנטי 3) הגברה של אזור הבקרה שאינו קידוד (nccr) באמצעות פרוטוקול מקונן-PCR, 4) אגנה ג'ל ו אמפליצין אימות, 5) sanger רצף של ה-PCR amplicon, 6) שיבוט של nccr לתוך כתבת הזריחה הכפולה באמצעות Agei ו spei, 7) מבחר של שיבוטים חיוביים, 8) sanger רצף של ה-DNA הפלאמצע, 9) העברה ארעית של תאים HEK293T עם פלמ1 הכתב והתוספת של תרכובות להיבדק, 10) מיקרוסקופ פלואורסצנטית לאימות העברה יעילה, 11) זרימה cy, לנסות ניתוח, 12 . ניתוח של ביטוי של eGFP tdTomato, 13) פרשנות נתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : PCR מקונן וניתוח מייצג של החולה הנגזרות NCCR-הגברה. A) ה-DNA נגזר מתוך שתילת מטופלים בעלי כליות חיסוני היה נתון להגברה מקוננת למחצה PCR באמצעות שימוש בשיטת oligb מקושר עם אתרי הגבלה agei ו spei. פריימר שמות ואורך (זוגות בסיס) של הארכיאופייני O, P, Q, R, ו-S-בלוקים של JN192438 זן BKPyV מצוינים בסוגריים. ב) הגברה נותחו על ידי אלקטרופורזה ב-1.5% agarose ג'ל ודמיינו באמצעות צביעת דנ א. M1 = 100 הסולם bp, wt = wildtype (הארכיאופייני), rr = מסודר, ins = הוספות, דל = מחיקות, DUN = מאמץ דנלופ. ג) מרכז העיכול עם agei ופיי. שברי מתעכל נותחו על ידי אלקטרופורזה ב 1.5% agarose ג'ל ודמיינו באמצעות כתמים DNA. M1 = 100 הסולם Bp, M2 = 2-לרשום סולם. NC = שליטה שלילית (רווח). + = שיבוט חיובי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : שיבוט ואימות של ה-NCCR לכתב הזריחה הכפולה. תוצאות מייצגות של רצף פלמיד. הגברה מטוהרת באמצעות ערכת טיהור ה-PCR ונתונה לרצפי הרצף של סאנגר. הרצפים המתאימים היו מיושרים לרצף NCCR נגזר מאמץ BKPyV הארכיאופייני JN192438. מחיקות והחלפות מסומנות באדום. הגבלת האתרים AgeI ו SpeI, התחלה טרנסלtional של מסגרת קריאה פתוח eGFP (מודפס בהדגשה), כמו גם בלוקים NCCR O-S מצוינים. הבלוקים המתאימים ואתרי ההגבלה מודגשים בצבע. אורך כל בלוק NCCR בצמדי בסיס מודפס בסוגריים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : ניתוח מיקרוסקופית קרינה פלואורסצנטית מוקדמת ומאוחרת של פעילות מיזם NCCR. A) מפת הגנים של כתב הזריחה הכפולה תחת שליטתה של היזם הדו-כיווני. כפי שמתואר בעבר5 פלמיד וועד-tdTOM-Nccr-efp (6,009 bp) הנמלים את האות SV40 מאוחר במורד האיתות של כל קלטת ביטוי כדי להבטיח עיבוד דומה ויעיל של שני התעתיקים עבור Tdtom (מוקדם ביטוי) ו-eGFP (ביטוי מאוחר), בהתאמה. NCCR מוקף על ידי AgeI ו SpeI. הווקטור מכיל קלטת התנגדות מאמפיצילין לבחירה במהלך הליך השכפול. B) התאים הHEK293T מצוידים במבנה עיתונאי כפול-פלואורסצנטית כל אחד תחת שליטה של רצפי nccr החולה (NCCR1-2). תאים היו חשופים ברייטפילד וניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטית 72 h לאחר ההעברה. מסנן הגדרות של המיקרוסקופ שימשו טווחי עירור הבאים: ירוק עבור tdTomato (515-560 nm) וכחול עבור eGFP (450-490 nm). סרגל קנה המידה (200 μm) מצוין בחלק הימני התחתון של כל צילום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 : ניתוח FACS הנציג. המוצג הוא אסטרטגיית הפעולה הפשוטה הדרושה לשיטה זו. נעשה שימוש בחלקות צפיפות של שני פרמטרים או נקודות. A) הראשון, fsc מותווים נגד פסיפיק כחול, בעוד dapi שלילי (כלומר, תאים חיים) מעובדים עוד. B-F) FITC (eGFP) לעומת PE (tdTomato) מותווים. C-D) להוסיף בלעדית תאים פלורסנט ירוק ואדום כדי להתאים את הפיצוי על cytometer הזרימה. E-F) בדוגמה זו, mTOR מעכבי INK128 ומפחית באופן משמעותי את tdTomato MTOR, אשר מתאים להפחתת ביטוי הגנים המוקדמים BKPyV. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| שם תחל | רצף (5 ' → "3") |
| BK-CR-fwd1 | מדריך כללי |
| BK-CR-rev1 | לינה מג |
| BKV-CR-2-fw-AgeI | מיכלבורנגאטג |
| BKV-CR-2-rv-ספמי | מCTGGCGCAGAACCATGGCCTT |
| מכשור לחיוג מידי | CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG |
טבלה 1: . בשימוש בפרוטוקול הזה הבסיסים המסומנים בקו תחתון מציינים את אתרי האנזים ההגבלה עבור AgeI ו-SpeI, בהתאמה.
| רכיב | נפח/התגובה (μl) | ריכוז סופי |
| מים בחינם | 32.8 μL | - |
| מאגר ה-PCR 10x | 5 μL | 1x |
| dNTPs (10 מ"מ מכל אחד) | 1 μL | 0.2 מ"מ של כל dNTP |
| Fwd-פריימר (10 μM) | 3 μL | 0.3 μM |
| הפוך-פריימר (10 μM) | 3 μL | 0.3 μM |
| טייב פולימראז | 0.2 μL | 2 יחידה/תגובה |
| דנ א של תבנית | 5 μL | < 0.5 μg/50 μL תגובה |
טבלה 2: פרוטוקול הכנה לתמהיל מיקס. ההוראה חלה הן על תגובות ה-PCR הטרום והמקוננות כמתואר בשלבים 2.2 ו-2.7, בהתאמה.
| טמפרטורה | משך | PCR-step | מחזורי |
| 95 ° c | 5 דקות | דנטורציה ראשונית | |
| 95 ° c | 30 שניות | דנטורציה | |
| 55 ° c | 34 שניות | ריפוי | x35 |
| 72 ° צ' | 1 דקות | סיומת | |
| 72 ° צ' | 10 דקות | הארכה סופית | |
| 4 ° c | ∞ | קירור |
שולחן 3: PCR התוכנית המשמשת עבור הגברה של NCCR. ההוראה חלה על תגובות PCR מראש ומקוננות.
| ריאגנט | נפח/התגובה (μl) | ריכוז סופי |
| DNase-H20 חינם | 6 | עד 20 μl |
| מאגר 10x | 2 | 1x |
| מירב שלמה | 1 | 10 יחידות הדיור |
| ספאני | 1 | 10 יחידות הדיור |
| PCR-amplicon מטוהר | 10 | שתנה |
שולחן 4: . בפרוטוקול העיכול ההוראה חלה על העיכול בו זמנית של אמפליקון DNA עם שני אנזימים הגבלה שתוארו בשלב 3.1.
| ריאגנט | נפח/התגובה (μl) | ריכוז סופי |
| DNase-H20 חינם | 14.5 | עד 20 μl |
| מאגר 10x | 2 | 1x |
| מירב שלמה | 1 | 10 יחידות הדיור |
| ספאני | 1 | 10 יחידות הדיור |
| עמוד השדרה פלמיד (1 μg/μL) | 1.5 | 1.5 μg |
שולחן 5: . פרוטוקול העיכול הפלמיד ההוראה חלה על העיכול הסימולטני של עמוד השדרה DNA הפלזמה עם שני אנזימים הגבלה המתוארים בשלב 3.3.
| ריאגנט | נפח/התגובה (μl) | ריכוז סופי |
| DNase-H20 חינם | 7 | עד 20 μl |
| T4 לליגאז | 1 | 20 |
| מאגר ה-DNA של 10 x T4 | 2 | 1x |
| עמוד השדרה הטהור פלמיד נמוך להמיס מדולל 1/2 משלב 3.5 |
2 | שתנה |
| מתעכל ומטוהר PCR-amplicon משלב 2.7 | 8 | שתנה |
שולחן 6: . פרוטוקול הנוגע לפלסטיק ההוראה חלה על הקשר של עמוד השדרה של ה-DNA הפלמיד עם ה-PCR מתעכל אמפליקון DNA המתואר בשלב 3.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה, שיטה בשימוש נפוץ מוצגת המאפשרת ניתוח של BKPyV לא קידוד בקרת אזור (NCCR) מונחה מוקדם ומאוחר הפעילות המקדם. ניתן למדוד את פעילות NCCR בו ואינה זקוקה לפירוק של התאים הניתנים להעברה. יתרה מזאת, ניתן לנתח מספר גדול יחסית של תאים ושיתוף ההעברה של סמנים נוספים לנורמליזציה של ערכי הקרינה הפלואורסצנטית אינו הכרחי.
חלק קריטי של שיטה זו הוא כי משוכפל nccr צריך להכיל בדיוק את אותם רצפים כפי שזוהו על ידי אמפליקון ברצף, אשר מתאים את משתני רוב נוכח הפלזמה המטופל. כדי להשיג תוצאות מדויקות ולמזער שגיאות הנוטות ל-PCR, מומלץ מאוד להשתמש בפולימראז עם פעילות קריאת הוכחה. לחילופין, ניתן להזמין רצפים באמצעות שירותי סינתזה של גנים מסחריים. ניתן להזמין את רצפי NCCR המיועדים, כולל אתרי הגבלת ההגבלה של AgeI ו-SpeI לשכפול ישיר. במקרה זה, לעכל את הפלסטלינה במקביל הפלזמה השדרה ולהחליף את הוספת מרווח עם רסיס המקביל NCCR מתוך מבנה מסונתז. דנ א יכול להיות מבודד לחילופין מדגימות שתן. עם זאת, מאז BKPyV מופרש גם לתוך שתן על ידי אנשים המוסמכים חיסונית לא בהכרח משקפים שכפול פעיל, הרלוונטיות הקלינית היא מוגבלת. באופן אידיאלי, ה-DNA יכול גם להיות מבודד מתוך ביופסיה כליות שבה PVAN בעבר יכול להיות זיהה היסטולוגית (להשוות עם Korth et al., 201919).
על ידי מדידת העוצמה הפלואורסצנטית ממוצע של תאים פלורסנט ירוק ואדום, שיטה זו מאפשרת לכמת NCCR-נגזר הנגזרת/פעילות ללא הטיה של יעילות העברה והשפעות נגד ההתרבות של סוכני נבדק (g., כפול mTOR מעכבי INK128 או PP242)5.
יישום נוסף של מערכת העיתונאי הוא האפשרות לנתח את ההשלכות של הוספות, מחיקות, או כפילויות ב-NCCR שנמצאו בתוך מבודד קליני על פעילות הקדם מוקדם ומאוחרת. במחקרים קודמים, הסוכנים המדכא נחקרו לווסת את פעילות NCCR; עם זאת, לא נמצאו מוטציות או סידורים מחדש של NCCR המשפיעים על הרגישות. עם זאת, מוטציות עשויות להשפיע על התגובה של חומרים חדשים שעשויים להיות מאושרים בעתיד הקרוב.
זה יכול להיות רלוונטי מאז בניגוד לאזורי הקידוד גדול אנטיגן T או VP1 capsid חלבון, NCCR כמו השם מרמז מייצג אזור שאינו קידוד, ולכן אינו מכיל לחץ סלקטיבי ברמת חומצת אמינו.
בפרוטוקול זה, הבחירה של שכפולים חיוביים המכילים את ה-NCCR מאומתת על-ידי העיכול של AgeI ושפיי. עם זאת, ה-PCR המושבה עשויה לייצג גישה חלופית למסך במהירות עבור מוסיף NCCR ישירות מ -E. coli מצופה על צלחות אגר. עבור גישה זו, השתמש פריימר זוג BKV-CR-2-fw-AgeI ו-EGFP-N (טבלה 1). לאחר הזיהום, התאים נבדקים לקרינה פלואורסצנטית אדומה וירוקה באמצעות מיקרוסקופ קרינה (איור 4). לחילופין, ניתן לקבוע תאים באמצעות 3% בכיוון הכיתה של 20 דקות ב -22 ° c. במקרה זה, לשטוף עם PBS, להוסיף 0.2% שאינם ביונית כביסה ב-PBS ו-דגירה עבור 10 דקות. תאים קבועים ניתן לאחר מכן להיות מוכתם עם DAPI ב-PBS (1 μg/mL) עבור 10 דקות ב 22 ° צ' ו נתון ניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטית ודמיינו עם אור UV (340-380 ננומטר).
מכיוון ששני fluorophores הנמל אותו אותות פוליאדלציה אותו, השפעה של יעילות פוליאדלציה יכול להיות קבע. עם זאת, בהשוואה eGFP, tdTomato הוא חלבון dimeric אשר חייב להיות משועתק לתוך mRNA ארוך יותר (קידוד רצף: 745 לעומת 1431 bp, בהתאמה). עם זאת, מאז הפעילות של היזמים מן התאים המטופלת עם חומרים מפריעים מושווים תמיד יחסית לתאים לא מטופלים (DMSO), הבדל זה משחק תפקיד קטן. בשל נוכחותם של מקור השכפול, המעבר של הכתב הפלמאני בתאים ביטוי באופן מסביר את SV40PyV T גדול אנטיגן מאפשר העברת פלמידים לתאי הבת. זה הוכח כי הSV40 נגזר אנטיגן גדול T יכול להפעיל SV40 ו BKPyV NCCR ו ויראלי שכפול DNA20. עם זאת, מאז האנטיגן T גדול מעורב גם במעבר מוקדם לשלב מאוחר של זיהום, מצב מלאכותי ניתנת. השימוש בשיטה זו, חייב להיחשב שהשלב המגביל ביותר הוא הביטוי המוקדם המוביל לביטוי של אנטיגן T גדול. כדי למפות את מחזור השכפול המלא, יש למדוד את mrnas המוקדמים והמאוחרים בתאים נגועים על ידי רביעיית ה-PCR כפי שמתואר במקום אחר5,12.
שיטה דומה כבר בשימוש על ידי קבוצות השוויצרי והגרמני לנתח הארכיטיפוסי ו מסודר bkpyv nccr הנגזרת פעילויות מקדם, אם כי עם מערכות וקטוריות בנפרד משוכפל5,9. Gosert ועמיתים מבאזל בשימוש שיטה דומה כדי לקבוע את הפעילות של nccr יזם של bkpyv ו jcpyv זנים9,10,11. שתי השיטות השתמשו ב-eGFP לזריחה ירוקה; עם זאת, קבוצת באזל השתמשה ב-RFP בזמן שבפרוטוקול tdTomato הנוכחי שימש לזריחה אדומה. היתרון של tdTomato מעל RFP הוא פוטויציבות הרבה יותר גבוהה; עם זאת, חלבון dimeric מקודד על ידי רצף זה כפול כל עוד RFP21. יתר על כן, מחצית החיים של החלבונים עשוי להיות שונה, וכתוצאה מכך ריכוז שווים 72 h הצבה לאחר ההעברה. עם זאת, בעיה זו עשויה להיות רלוונטית רק כאשר משווים באופן ישיר את שני עוצמות הקרינה. Gosert ואח ' בשימוש באתר האינטרנט של מגבלה ו NotI באתרי ההגבלה, בעוד שבפרוטוקול AgeI ו-SpeI מאגפים את רצף ה-NCCR. באמצעות שתי השיטות, התייחסות מאמץ דנלופ16 הניבו דפוסי הזריחה המקבילה עם חזקה מוקדם אך חלש מיזם מאוחר המבצע9,10. בהסכם נוסף, nccr-הסדרים עם הוספות באזור P-הביא לעלייה משמעותית בתחילת הפעילות מיזם מוקדם ומאוחר בהשוואה wt-nccr5,9.
למרות שכבר הוכח כי SV40 נגזר אנטיגן גדול T ניתן להפעיל SV40 ו BKPyV נגזר NCCRs20, זה עשוי להיות מעניין להשתמש בתאים אנושיים כי באופן מפורש את האנטיגן T גדול של BKPyV ולא אב טיפוס וירוס SV40 במחקרים עתידיים . עם זאת, במקרה זה הקו הנייד צריך להיות קל transfect (למשל, HEK293).
מאז היזמים NCCR של וירוסים מפוליפונים דומים מאוד, שיטה זו יכולה לשמש גם (עם עיבוד קטן ברצפים התחל) כדי לחקור את פעילות היזם ואת ההשפעה של סוכנים אנטי ויראליים על הפעילות של JC-פולידונים וירוס (JCPyV) שאינם אזורי בקרת קוד11. מאז jcpyv הוא סוכן סיבתי של leukoencephalopathy מולטי וקד מתקדם (pml), מחלה נדירה מערכת העצבים המרכזית שניתן לעתים נדירות להתרחש בחולים עם ליקויים חיסוני וכתוצאה נוירופתולוגיה חמורה, יש גם צורך דחוף למצוא הפעלת חומרים אנטי-ויראליות באופן ישיר לטיפול בחולים שנפגעו מהמערכת. מעניין, סידורים מחדש נמצאים גם ב JC NCCRs11. מאז JCPyV יש ביטוי neurotropism ולכן כמויות גדולות של וירוסים נמצאים משקאות חריפים, רכישת מדגם צריך להיות מותאם DNA נגזר משקאות. עם זאת, ניתן להתאים בקלות את הצעדים הבאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יוהנס קורה קיבל מענקים לתשלום הדובר והוצאות נסיעה מאסטאלה ונובארטיס. מארק ווידרה קיבל דמי ייעוץ מנוברטיס. אוליבר ויצקה קיבל מענקים למחקרים קליניים, אגרת דובר, כבוד והוצאות נסיעה מ Amgen, אלכדון, אסטאלה, באסאה, ביוטסט, בריסטול-מאיירס-סקוויבי, קורביבו, צ'יסי, גלעד, הקסאל, ינסן, ד ר פ. קוצ'לר כלומר, MSD, נוברטיס, רוש, פייזר, Sanofi וטבע.
Acknowledgments
המחברים מודים לברברה בלקמן על סיוע טכני מעולה. מחקרים אלה תמכו על ידי IFORES-תוכנית של אוניברסיטת Duisburg-אסן הספר לרפואה ואת RIMUR-תוכנית של הברית האוניברסיטה הרוהר ומרקטור מרכז מחקר רוהר (MERCUR). המחברים מודים לג-מנצ-סטיפטונג עבור מלגת הדוקטורט של הלן סרצניג ותמיכה מתמדת. האיסוף והשימוש בחומר המטופל אושר על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה של האוניברסיטה Duisburg-אסן (14-6028-BO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
References
- Drachenberg, C. B., et al. Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load. American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).
- Korth, J., et al. Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function. Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).
- Hirsch, H. H., et al. European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation. Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).
- Masutani, K., et al. The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome. American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).
- Korth, J., et al. Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region. Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).
- Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12. Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).
- Sanchez Fructuoso, A. I., et al. Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients. Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).
- Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis. Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).
- Gosert, R., et al. Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology. Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).
- Bethge, T., et al. Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression. Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).
- Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate. Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).
- Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression. American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).
- Widera, M., et al. HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia. Medical Microbiology Immunology. , (2017).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).
- Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland. Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).
- Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals. Virology. 198 (1), 59-70 (1994).
- Teutsch, K., et al. Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy. Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).
- Korth, J., et al. The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation. Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).
- Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens. Virology. 152 (2), 459-465 (1986).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
