Summary
In dit manuscript wordt een protocol gepresenteerd voor het uitvoeren van FACS-based meting van de transcriptionele activiteit van BK-polyomavirus door gebruik te maken van HEK293T cellen met een bidirectionele reporter plasmide die tdTomato en eGFP uitdrukt. Deze methode maakt het mogelijk om de invloed van nieuwe verbindingen op virale transcriptie kwantitatief te bepalen.
Abstract
Polyomavirussen, zoals het BK-polyomavirus (BKPyV), kunnen ernstige pathologieën veroorzaken bij immuungecompromitteerde patiënten. Echter, aangezien zeer effectieve antivirale middelen momenteel niet beschikbaar zijn, zijn methoden voor het meten van de impact van potentiële antivirale agenten vereist. Hier werd een dubbele fluorescentie reporter die de analyse van de BKPyV non-coding Control-Region (NCCR) gedreven vroege en late promotor activiteit mogelijk gemaakt om de impact van potentiële antivirale geneesmiddelen op virale genexpressie via tdTomato en eGFP te kwantificeren. Expressie. Bovendien kan door het klonen van BKPyV-NCCR-amplicons die in dit protocol voorbeeld zijn verkregen uit het bloed afgeleide DNA van immuungecompromitteerde niertransplantatiepatiënten, de impact van NCCR-rearrangementen op virale genexpressie worden bepaald. Na het klonen van de patiënt afgeleide amplicons, HEK293T cellen werden met de reporter-plasmiden, en behandeld met potentiële antivirale middelen. Vervolgens werden de cellen onderworpen aan FACS-analyse voor het meten van de gemiddelde fluorescentie intensiteiten 72 h post transfectie. Om ook de analyse van geneesmiddelen die een potentiële celcyclus remming van effect te testen, alleen getransffecteerd en dus fluorescerende cellen worden gebruikt. Aangezien deze test wordt uitgevoerd in een groot T-antigeen dat cellen uitdrukt, kan de impact van vroegtijdige en late expressie op een wederzijds onafhankelijke manier worden geanalyseerd.
Introduction
Polyomavirussen vertegenwoordigen een onafhankelijke familie van kleine dubbel-gestrande DNA (dsDNA) virussen met het Simian virus 40 (SV40) als prototype soort. De primaire infectie treedt voornamelijk op tijdens de kindertijd, die meestal doorgaat zonder ziektesymptomen en meestal latente infecties veroorzaken in immuun competente hosts. Het BK-polyomavirus (BKPyV) blijft voornamelijk bestaan in nierbuisjes cellen zonder nefropathologieën, echter, in geval van aantasting van de immuun-competentie na niertransplantatie het virus kan reactiveren en veroorzaken ernstige schade en verminderde transplantaat functie bij het bereiken van een hoge hersenen (1 x 104 bkpyv DNA-kopieën/ml)1,2. Bij ongeveer 10% van de niertransplantatie ontvangers resulteert reactivering van het BK-polyomavirussen (bkpyv) in een met polyomavirussen geassocieerde nefropathie (pyvan), die tot 80% geassocieerd met een hoog risico op renale allotransplantaat storingen3,4 . Aangezien er geen goedgekeurde antivirale middelen beschikbaar zijn, is de huidige therapie gebaseerd op de reductie van immunosuppressie. Interessant, mTOR-remmers lijken te hebben een antivirale effect; Zo kan het overschakelen van de immunosuppressieve therapie op mtor-gebaseerde immunosuppressie een alternatieve benadering zijn om progressie van de bkpyv hersenen5,6,7te voorkomen. Echter, het mTOR gebaseerde antivirale mechanisme is momenteel nog niet volledig begrepen. Daarom zijn methoden vereist voor het meten van de impact van potentiële antivirale middelen in klinisch relevante concentraties.
Het circulaire genoom van de BKPyV bestaat uit ongeveer 5 KB die een niet-coderende controle regio (NCCR) verveelt die dient als een bron van replicatie en tegelijkertijd een bidirectionele promotor die de uitdrukking van vroege en late fase mRNA transcripten besturen. Aangezien spontaan voorkomende nccr-herschikkingen, verwijderingen en duplicaties worden aangetroffen in pathogene bkpyv8 en aanzienlijk worden opgehoopt bij patiënten die lijden aan pvan5,9, een vergelijking van archetypische (WT) en Re-gerangschikte (RR) NCCR-activiteiten zijn nuttig om virale replicatieve fitness te karakteriseren.
Zoals samengevat in Figuur 1, beschrijft dit protocol een veelgebruikte methode om de BKPyV nccr-transcriptionele activiteit te meten door de fluorescentie van twee fluoroforen tdTomato en EGFP te kwantificeren, uitgedrukt door een reporter plasmide5, 9,10,11. De procedure wordt uitgevoerd in de aanwezigheid van het SV40 grote T-antigeen (lTAg), die het mogelijk maakt om de impact van potentiële antivirale middelen op de vroege en late NCCR-activiteit afzonderlijk te analyseren5. Deze assay analyseert verder de impact van herschikkingen op de nccr-activiteit en vergelijking met WT-nccrs5,9. De reporter plasmide herbergt het SV40 late polyadenylatie signaal stroomafwaarts van elk de open reading frame om te zorgen voor een vergelijkbare en efficiënte verwerking van beide transcripten voor respectievelijk tdtomato en EGFP. Vergeleken met QRT-PCR-gebaseerde methoden5,12, vertegenwoordigt deze op FACS gebaseerde aanpak een laaggeprijsde en hoge doorvoer compatibel alternatief omdat geen ingewikkelde extractie protocollen voor geïnfecteerde celcultuur en geen dure Er zijn antilichamen voor immuun fluorescentie kleuring nodig. Bovendien, aangezien een bepaalde hoeveelheid fluorescerende cellen wordt geanalyseerd via Flowcytometrie, is de analyse van celcyclus remmende middelen ook mogelijk op een kwantitatieve manier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt de richtlijnen van menselijk onderzoek zoals goedgekeurd door de ethiek Committee van de medische faculteit van de Universiteit van Duisburg-Essen (14-6028-Bo).
1. verzameling van bloed-of urine monsters en isolatie van polyomavirussen-DNA
- Verzamel ten minste 3 mL bloed in EDTA-buisjes of urine in acquisitie buisjes.
- Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 2.500 x g . Indien nodig, Pipetteer plasma in een nieuwe buis en bewaar de plasma monsters gedurende meerdere dagen bij 4 °C of Vries bij-20 °C voor langere opslag.
- Bereid 40 μl proteïnase K in een micro centrifugebuis van 1,5 ml en voeg met Pipetting 400 μl plasma toe.
- Lyse het monster door toevoeging van 400 μL lysisbuffer, Vortex voor 15 s, en incuberen gedurende 10 min bij 56 °C.
- Isoleer het DNA met behulp van een DNA bloed extractie Kit zoals beschreven in de instructies van de fabrikant. Kort, voeg alcohol toe en laad de lysaten op een spin kolom met een DNA bindend membraan op basis van silica. Was de kolommen meerdere malen om puur DNA te leveren.
- Het opgeleverd DNA in 30-50 μL te buffer te Elderen.
2. versterking van het niet-coderings controlegebied (NCCR)
- Voer de volgende procedure uit in fysiek gescheiden ruimten. Gebruik een geïsoleerde ruimte om de reagentia voor te bereiden en verdeel de mix naar de PCR-buisjes.
- Bereid de Master mix voor de pre-PCR met primer pair A (tabel 1) in een totaal volume van 50 μL en gebruik het eerder geïsoleerde DNA uit stap 1,6. Het Pipetteer schema voor het voorbereiden van de Master mix voor de pre-en geneste PCR wordt afgedrukt in tabel 2.
- Verdeel 45 μL van de Master mix in de PCR-buisjes.
- Voeg 5 μL van het geïsoleerde DNA toe aan de PCR-buisjes.
Opmerking: gebruik een andere ruimte dan die voor de Master Mix voorbereiding om verontreiniging te voorkomen. - Voer de PCR uit met de reactieomstandigheden zoals geïllustreerd in tabel 3. Herhaal denaturatie, gloeien en uitbreiding in 35 cycli.
- Voor het geneste versterkings gebruik primer paar B harkotteren de beperkings locaties voor AgeI en SpeI (tabel 1).
- Voer de geneste PCR uit met de reactieomstandigheden zoals beschreven in de stappen 2,2 tot en met 2,5 met 5 μL van de pre-PCR.
- Meng 10 μL van het PCR-product met 2 μL 6x gel laad kleurstof. Laad 10 μL van de mix op een 1,5% agarose gel en voer de gel gedurende 30 minuten uit bij 60 mA.
- Visualiseer de gel met behulp van een geschikt UV-documentatiesysteem.
Opmerking: de grootte van de ampliconlengte voor Temp is naar verwachting tussen 300-500 BP afhankelijk van of herschikkingen (verwijderingen, inserties of duplicaties) hebben plaatsgevonden (figuur 2c). - Reinig de PCR-amplicons met behulp van een PCR-zuiverings pakket volgens de instructies van de fabrikant. De PCR-amplicons worden in 30 μL elutie buffer elute.
- Stuur de amplicons voor Sanger-sequencing met primer pair B.
3. klonen van de NCCR in de dubbele fluorescentie reporter
- Verteren de gezuiverde amplicons (stap 2,10) met AgeI en SpeI voor 2 uur bij 37 °C, zoals beschreven in tabel 4.
- Herhaal stap 2,10 en zuivert de verteerde amplicons.
- Parallel, ook verteren de plasmide ruggengraat (1,5 μg) met AgeI en SpeI voor 2 h bij 37 ° c zoals beschreven in tabel 5. Deze stap hoeft slechts eenmaal te worden uitgevoerd. Voor volgende reacties, Vries de spijsvertering bij-20 °C.
- Analyseer de verteerde plasmide ruggengraat op een 0,8% lage smelt agarose gel.
Opmerking: Voer de gel niet uit met een stroom van meer dan 40 mA. De verwachte wisselplaat van het spacer gebied oorspronkelijk afgeleid van de plasmide pEX-K4 2-LTR CD313 is 128 BP (figuur 2c). - Visualiseer DNA-fragmenten met behulp van UV-licht met lange golf (320 nm) en knip de ruggengraat band uit met een schone scalpel. Breng het low Melt gel fragment over in een nieuwe micro centrifugebuis van 1,5 mL. Vermijd lange UV-belichtingstijden om DNA-beschadiging te voorkomen.
Opmerking: omdat een laag smelt agarose wordt gebruikt, is het niet nodig om het DNA te zuiveren voor de ligatie. - Verwarm de ruggengraat met het lage smelt agarose-stuk gedurende 10 minuten bij 65 °C om het gelstuk te smelten en om de 2 minuten te mengen met zachte vortexing. De gesmolten gel kan direct worden gebruikt voor ligatie.
- Ligate de ruggengraat en de verteerde ampliconlengte voor Temp met behulp van T4 DNA ligase tijdens de nacht bij 16 ° c met behulp van het schema weergegeven in tabel 6.
- Voer transformatie in E. coli met behulp van de heat shock methode, plaat bacteriën op lb-amp platen, en cultuur bij 37 °c gedurende de nacht.
- Selecteer de volgende dag drie positieve klonen en bereid 's nachts E. coli culturen (5 ml lb-amp) en cultuur bij 37 °c.
- Isoleer het plasmide-DNA met behulp van standaardprotocollen zoals elders beschreven14, voer agei en Spei digestie uit om te controleren op positieve klonen en uitsnede fragmenten te visualiseren op een 1% agarose gel. De afstandbandband (128 BP) wordt vervangen door de grotere NCCR-sequentie (300-500 BP, zie hierboven).
- Stuur het plasmide voor Sanger-sequencing met behulp van de primer EGFP-N of primer pair B (tabel 1).
- Aangezien mutaties spontaan kunnen optreden, vergelijkt u de sequentie resultaten met de sequentie resultaten die met de amplicon zijn verkregen. Gebruik alleen de klonen met identieke sequenties in vergelijking met de amplicon.
- Gebruik een moleculaire Workbench-software (bijvoorbeeld freeware GENtle 1.9.4 of andere sequence-bewerkingsprogramma's) om de verkregen sequenties uit te lijnen en te bewerken (Figuur 3).
- Start zachte 1.9.4 en importeer de DNA-sequenties door te klikken op de knop importeren (groene pijl omlaag).
- Klik vervolgens op gereedschap en selecteer uitlijning in het menu (gebruik CTRL + G als snelkoppeling) en kies de DNA-sequenties voor uitlijning.
- Voeg een sequentie toe aan de uitlijning door te klikken op toevoegen of verwijderen van een reeks door te klikken op verwijderen. Voeg een archetypische NCCR-consensussequentie zoals JN19243815, gebruik niet de nccr-sequentie van de vaak gebruikte Dunlop-stam16, omdat het herschikkingen en duplicaties anderen dan de archetypische bkpyv Stammen.
Opmerking: de NCCR bevat al de translationele start codon (Figuur 3). - Kies een methode voor de uitlijning door te klikken op de algoritme in de werkbalk en kies Clustal W. Stel de uitlijnings parameters in op 2; gap-extensie penalty-1; kloof penalty-2 en klik op OK om de uitlijning uit te voeren.
4. voorbijgaande transfectie van HEK293T cellen met de reporter plasmide en behandeling met potentiële antivirale middelen
- Voor het bereiden van voldoende hoeveelheden plasmide DNA voor daaropvolgende transfectie experimenten bereiden een 150 mL nacht cultuur. Isoleer het plasmide DNA met een plasmide isolatiekit. Als alternatief kunnen andere plasmide zuiverings kits worden gebruikt.
- Zaad 1 x 105 HEK293T cellen in DMEM bevattende 10% FCS, penicillaire en streptomycine (1x) per put van een 12-goed plaat 24 h voorafgaand aan de transfectie en incuberen 's nachts bij 37 ° c en 5% Co2 om actieve proliferatie tijdens de trans fectie te behouden.
Opmerking: cellen moeten ongeveer 80% Confluent Health zijn bij transfectie. - Plaats 250 μL verlaagde serum media in een steriele buis en voeg 1 μg van elke reporter plasmide DNA toe en meng zachtjes door Pipetting.
- Voeg 3 μL van het transfectiereagens toe aan het DNA-mengsel, meng zachtjes door pipetteren en inincuberen gedurende 15 min. Verwarm het transfectie-reagens voor op de omgevingstemperatuur van 22 °c en draai zachtjes voor gebruik.
- Voeg het mengsel drop-Wise toe aan de putjes en verdeel zachtjes naar de put.
- Vervang na 4 uur het supernatant met vers medium dat de teststoffen en oplosmiddel controle bevat. Inincuberen bij 37 °C tot de analyse. In dit voorbeeld werden de mTOR remmers INK128 (100 ng/mL) en rapamycine (100 ng/mL) gebruikt.
5. fluorescentiemicroscopie en Flowcytometrie
- Controleer de cellen op de rode en groene fluorescentie onder de fluorescentiemicroscoop (Figuur 4).
Opmerking: rode en groene fluorescentie komen overeen met respectievelijk de vroege en de late BKPyV-genexpressie. - Na 72 h post transfectie, aspireren de supernatant en was de cellen tweemaal met 1 mL koude PBS.
- Voeg voorzichtig 500 μL trypsine toe en draai de plaat enigszins om vroegtijdige loslating van de cellen te voorkomen. Deze stap is belangrijk om te voorkomen dat celdubbeltjes.
- Verwijder na toevoeging de trypsine direct met dezelfde pipetpunt.
- Inincuberen de cellen gedurende ten minste 5 min bij 37 °C.
- Respendeer trypsinized cellen met 1 mL PBS met 3% FCS en breng de suspensie over in voorgelabelde FACS tubes.
- Voeg DAPI (1 μg/mL) toe vóór de FACS-analyse.
- Analyseer de cellen met behulp van een flow cytometer. Meet voor elk monster ten minste 10.000 levende cellen, die negatief zijn voor DAPI-kleuring.
6. gegevensanalyse
- Importeer de gegevens in de flow flowcytometrieonderzoeken analyse software en voeg samples toe door te klikken en te slepen naar de werkruimte.
- Dubbelklik op het geïmporteerde bestand en maak een grafiek plot. Kies FSC-A versus SSC-A door op de x-en y-as te klikken. Poort de belangrijkste celpopulatie door te klikken op polygoon op de werkbalk en framing van de celpopulatie (Figuur 5). Noem de gekozen celpopulatie zoals vereist (bijvoorbeeld "enkelvoudige cellen"). De "enkelvoudige cellen" wordt weergegeven als een nieuwe werkruimte.
- Ga door met het gating van "enkelvoudige cellen" voor DAPI-negatief (d.w.z. "levende cellen"). Om levende cellen te identificeren, vergelijkt u de celpopulatie met en zonder DAPI-kleuring. In beide percelen kiest u FSC-A versus Pacific-Blue-A.
- Klik op de rechthoek en kies de DAPI-negatieve celpopulatie, noem de gekozen celpopulatie "levende cellen", en maak een nieuw punt-plot dat FITC (eGFP) versus PE (tdTomato) weergeeft, zoals eerder beschreven.
- Voeg kwadranten toe in "levende cellen" door Quad te kiezen uit de werkbalk. Poort de populatie door het midden van het Kwadrant naar de rand van elke populatie te slepen. De kwadranten vertegenwoordigen 1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM +, 3) eGFP + tdTOM-, 4) eGFP + tdTOM +.
Opmerking: vanwege de spectrale overlay van emissiespectra tussen FITC en PE is initiële compensatie essentieel om een onderscheid te maken tussen rode en groene signalen en om nauwkeurige resultaten te behalen. - Bepaal de gemiddelde fluorescentie intensiteiten (Mfi's) door met de rechtermuisknop op het Kwadrant te klikken en Statistieken toevoegente kiezen. Kies mean en klik op OK. De gemiddelde MFI wordt nu onder de populatie weergegeven in de rubriek "statistiek". Kwadranten 2 en 4 komen overeen met vroege expressie, terwijl kwadranten 3 en 4 late uitdrukking vertegenwoordigen.
- Voeg extra replicaten op dezelfde manier toe voor statistische energie.
- Voor gegevens interpretatie plot MFI-waarden van vroeg en laat in een staafdiagram:
- Om NCCR-activiteiten te vergelijken die zijn verkregen van verschillende donoren of virusstammen, voegt u een archetypische controle of de Dunlop-stam16 toe en stelt u de relatieve mfi's in op 100% en berekent u de relatieve MFI-waarden. Herhaal dit met elke replicatie en bepaal het gemiddelde en de standaarddeviatie.
- Om een effect van potentiële verbindingen op de transcriptionele activiteit te evalueren, stelt u de oplosmiddel controle in op 100% en plot de MFI van de behandelde cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit representatieve experiment werd de door de BK-polyomavirus niet-coderende controle regio gestuurde transcriptionele activiteit gemeten via Flowcytometrie. Bovendien werd een mTOR-remmer, die zou kunnen worden gebruikt voor de behandeling van patiënten na BKPyV reactivatie, getest op de remming van de virale vroege genexpressie. Hiertoe werd een dubbele fluorescentie-reporter test gebruikt zoals eerder gepubliceerd5. Het algemene workflowschema van de experimentele opstelling wordt geïllustreerd in Falgoritmisch 1. Eerste, bloedmonsters van immuungecompromitteerde niertransplantaties patiënten werden verzameld volgens de richtlijnen van menselijke onderzoek zoals goedgekeurd door de institutionele ethische commissie. Het bloed werd verzameld in EDTA-bevattende buisjes en de fasen werden gescheiden door centrifugeren. Vervolgens werd 400 μL plasma gebruikt voor isolatie van het polyomavirussen-DNA. De niet-coderende controle regio (NCCR) werd versterkt met behulp van een geneste-PCR-Protocol zoals geïllustreerd in Figuur 2a met behulp van de buitenste primer paar BKV-CR-1fw en BKV-CR-1rv, de binnenste primer pair BKV-CR-2Fw-agei (primer agei) en BKV-CR-2Rv-Spei ( Primer SpeI)17, waarvan de laatste de beperkings locaties voor agei en Spei herbergt. De ampliconlengte voor temp controle werd uitgevoerd via agarose gel elektroforese zoals weergegeven in Figuur 2b. Terwijl de amplicons afgeleid van archetypische NCCR-sequenties (WT) een homogene grootteverdeling in de gel hadden, waren die afgeleid van herschikt NCCRs met inserties (RRins) en verwijderingen (RRdel) verscheeld in hun grootte (ca. 300-500 BP). Met name, als gevolg van herschikkingen, de Dunlop NCCR Reference sequentie16 (dun), die werd opgenomen als een controle, was groter dan de nccr verkregen uit archetypische virussen. Omdat de amplicons overeenkwamen met de voorspelde maten, werden de gezuiverde PCR-producten verzonden voor Sanger-sequencing voor latere vergelijking met de sequenties gekloond in de reporter plasmide voor verdere analyse.
Voor het klonen van de amplicons, werd de spijsvertering uitgevoerd met behulp van de twee beperkings enzymen AgeI en SpeI. Na het klonen in de dubbele fluorescentie Reporter, die werd uitgevoerd met behulp van standaard kloon procedure, werd de selectie van positieve klonen met de NCCR geverifieerd door AgeI en SpeI spijsvertering (figuur 2c). Hier werd de kleine spacer Region (NC, 128 BP) vervangen door de grotere NCCR-fragmenten (ca. 300-500 BP) die duiden op positieve klonen. Plasmide DNA geïsoleerd van geverifieerde klonen werden verzonden voor Sanger sequencing en vergeleken met de sequenties verkregen van ampliconlengte voor temp sequencing (niet weergegeven). Alleen de klonen die overeenkomen met de reeks ampliconlengte voor temp zijn gekozen voor verdere verwerking. Zoals afgebeeld in Figuur 3, werden de sequentie resultaten vergeleken met een archetypische nccr-SEQUENTIE (JN192438). In dit voorbeeld zijn een verwijdering in het P-blok en een vervanging in O-Block gedetecteerd.
Om vervolgens de transcriptionele activiteit van de gekloonde NCCR-sequenties in de celcultuur te testen, werden HEK293T cellen transitioneel overgeschreven met de respectievelijke reporter constructies (figuur 4a). Zoals gevisualiseerd in figuur 4b, werden de transfectie-efficiëntie en de nccr-activiteit gemonitord via fluorescentiemicroscopie. Rode en groene fluorescentie kwam overeen met de vroege en late BKPyV genexpressie, respectievelijk5. De cellen uitgedrukt beide fluoroforen wijzen op efficiënte vroege en late promotor activiteit. Zoals geïllustreerd door de twee voorbeelden, liet de eerste NCCR (NCCR1) een sterke late genexpressie zien, terwijl het tweede voorbeeld (NCCR2) een relatief sterke vroege maar gematigde late genexpressie (figuur 4b) had. Zo werden monsters voorbereid voor de Flowcytometrie meting. Zoals beschreven in Protocol sectie 6, werden DAPI-negatieve cellen afgesloten (afbeelding 5a, onderste paneel) en werd een puntplot gemaakt met EGFP versus tdTomato. Monsters die negatief waren (Figuur 5b), evenals de positieve voor tdTomato (figuur 5C) of EGFP (figuur 5d), werden opgenomen in de analyse. Opmerking: initiële compensatie werd uitgevoerd, wat essentieel is om rode en groene signalen te onderscheiden en nauwkeurige resultaten te behalen18. De gemiddelde fluorescentie intensiteiten zijn afgeleid van elke test kloon. Hier, tdTomato positieve cellen correspondeerde met vroege uitdrukking terwijl eGFP positieve cellen late uitdrukking vertegenwoordigd. In dit voorbeeld heeft de behandeling met de dubbele mTOR-remmer INK128 de tdTomato MFI significant verlaagd (figuur 5e-F), wat betekent dat vroege expressie werd geremd.
Figuur 1 : Workflowschema voor de experimentele Setup. 1) verzameling van bloed (alternatief urine) monsters, 2) isolatie van polyomavirussen DNA 3) versterking van de niet-coderende controle regio (nccr) met behulp van een geneste-PCR-Protocol, 4) agarose gel elektroforese en ampliconlengte voor temp verificatie, 5) Sanger-sequencing van de PCR-amplicon, 6) klonen van de nccr in de dubbele fluorescentie reporter met agei en Spei, 7) selectie van positieve klonen, 8) SANGER-sequencing van het plasmide DNA, 9) Voorbijgaande transfectie van HEK293T cellen met de reporter plasmide en toevoeging van te testen stoffen, 10) fluorescentiemicroscopie om efficiënte Transfectie te controleren, 11) Flowcytometrie analyse, 12) gating en analyse van eGFP tdTomato expressie, 13) gegevens interpretatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : GENESTE PCR en representatieve analyse van patiënten afgeleide NCCR-amplicons. A) DNA dat is afgeleid van immuungecompromitteerde niertransplanteerpatiënten werd onderworpen aan semi-geneste PCR-amplificatie met oligonucleotide-primers die verband houden met beperkings sites agei en Spei. Primer namen en lengte (basis paren) van archetypische O, P, Q, R en S-blokken van BKPyV stam JN192438 worden tussen haakjes aangegeven. B) amplicons werden geanalyseerd door elektroforese in 1,5% agarose gel en gevisualiseerd met behulp van DNA-kleuring. M1 = 100 BP ladder, WT = wild type (archetypisch), RR = herschikt, ins = inserties, del = VERWIJDERINGEN, dun = Dunlop stam. C) plasmide spijsvertering met agei en Spei. Verteerde fragmenten werden geanalyseerd door elektroforese in 1,5% agarose gel en gevisualiseerd met behulp van DNA-kleuring. M1 = 100 BP ladder, m2 = 2-log ladder. NC = negatieve controle (afstandhouder). + = positieve kloon. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Klonen en validering van de NCCR in de dubbele fluorescentie Reporter. Representatieve resultaten van plasmide sequencing. Amplicons werden gezuiverd met behulp van een PCR-zuiverings pakket en onderworpen aan Sanger-sequencing. De respectieve sequenties werden uitgelijnd op de NCCR sequentie afgeleid van archetypische BKPyV stam JN192438. Verwijderingen en vervangingen zijn rood gemarkeerd. De AgeI en SpeI restrictie sites, translationele start van eGFP open Lees frame (gedrukt in vet) en de NCCR blokken O-S worden aangegeven. De respectieve blokken en de beperkings sites worden in kleur gemarkeerd. De lengte van elk NCCR-blok in basis paren wordt tussen haakjes afgedrukt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Representatieve fluorescentiemicroscopie analyse van vroege en late NCCR Promoter activiteit. A) genkaart van de dubbele fluorescentie reporter onder controle van de bidirectionele promotor. Zoals eerder beschreven5 de plasmide PTA-tdtom-nccr-EGFP (6.009 BP) herbergt het SV40 late polyadenylatie signaal stroomafwaarts van elke expressie cassette om te zorgen voor een vergelijkbare en efficiënte verwerking van beide transcripten voor tdtomato (vroege expressie) en eGFP (late expressie), respectievelijk. NCCR wordt geflankeerd door AgeI en SpeI. De vector bevat een ampicillaire weerstands cassette voor selectie tijdens de kloon procedure. B) HEK293T cellen werden getransffecteerd met dubbele fluorescentie reporter constructies elk onder de controle van patiënt afgeleide nccr sequenties (NCCR1-2). Cellen werden onderworpen aan brightfield en fluorescentiemicroscopie analyse 72 h post transfectie. De filter instellingen van de Microscoop werden gebruikt in het volgende excitatie bereik: groen voor tdTomato (515-560 Nm) en blauw voor eGFP (450-490 nm). De schaalbalk (200 μm) is in de rechterbenedenhoek van elke fotografie aangegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Representatieve FACS-analyse. Getoond is de eenvoudige gating strategie die nodig is voor deze methode. Er worden twee-parameter dichtheid of punt plots gebruikt. A) eerst wordt FSC uitgezet tegen Pacific Blue, terwijl alleen DAPI-negatieve (d.w.z. levende cellen) verder worden verwerkt. B-F) FITC (eGFP) versus PE (tdTomato) worden uitgezet. C-D) Voeg uitsluitend groene en rode fluorescerende cellen toe om de compensatie op de flow cytometer aan te passen. E-F) In dit voorbeeld worden de mTOR-remmers INK128 en de tdTomato MFI significant verlaagd, wat overeenkomt met een verlaging van de vroege genexpressie van de BKPyV. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Naam primer | Sequentie (5 ' → 3 ') |
| BK-CR-fwd1 | CCCAGGCAGCTCTTTCAAGGC |
| BK-CR-rev1 | Een van de meest gebruikte. |
| BKV-CR-2-FW-AgeI | AAAAAAAccggtttttgcaaaaattgcaaaagaatagg |
| BKV-CR-2-RV-SpeI | TTTTTTActagtctggcgcagaaccatggcctt |
| EGFP-N | Van de CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG |
Tabel 1: In dit Protocol gebruikte oligonucleotiden. De onderstreepte basen geven respectievelijk de restrictie-enzym locaties voor AgeI en SpeI aan.
| Component | Volume/reactie (μl) | eindconcentratie |
| RNase-vrij water | 32,8 μL | - |
| 10x PCR-buffer | 5 μL | 1x |
| dNTPs (10 mM van elk) | 1 μL | 0,2 mM van elke dNTP |
| FWD-primer (10 μM) | 3 μL | 0,3 μM |
| Rev-primer (10 μM) | 3 μL | 0,3 μM |
| Taq polymerase | 0,2 μL | 2 eenheid/reactie |
| Template DNA | 5 μL | < 0,5 μg/50 μL reactie |
Tabel 2: Master Mix voorbereidings protocol. De instructie is van toepassing op zowel pre-als geneste PCR-reacties zoals beschreven in respectievelijk de stappen 2,2 en 2,7.
| Temperatuur | Duur | PCR-Step | Cycli |
| 95 °C | 5 min. | Initiële denaturatie | |
| 95 °C | 30 sec | Denaturatie | |
| 55 °C | 34 SEC | Annealing | x35 |
| 72 °C | 1 min | Extensie | |
| 72 °C | 10 min. | Final extensie | |
| 4 °C | ∞ | Koeling |
Tabel 3: PCR-programma gebruikt voor NCCR-versterking. De instructie is van toepassing op zowel pre-als geneste PCR-reacties.
| Reagens | Volume/reactie (μl) | eindconcentratie |
| DNase-gratis H20 | 6 | tot 20 μl |
| 10x buffer | 2 | 1x |
| AgeI | 1 | 10 eenheden |
| SpeI | 1 | 10 eenheden |
| gezuiverde PCR-amplicon | 10 | Variabele |
Tabel 4: Amplicon spijsvertering protocol. De instructie geldt voor de gelijktijdige vertering van het ampliconlengte voor temp-DNA met twee beperkings enzymen zoals beschreven in stap 3,1.
| Reagens | Volume/reactie (μl) | eindconcentratie |
| DNase-gratis H20 | 14,5 | tot 20 μl |
| 10x buffer | 2 | 1x |
| AgeI | 1 | 10 eenheden |
| SpeI | 1 | 10 eenheden |
| Plasmide ruggengraat (1 μg/μL) | 1,5 | 1,5 μg |
Tabel 5: Plasmide spijsvertering protocol. De instructie is van toepassing op de gelijktijdige vertering van de plasmide DNA-backbone met twee beperkings enzymen zoals beschreven in stap 3,3.
| Reagens | Volume/reactie (μl) | eindconcentratie |
| DNase-gratis H20 | 7 | tot 20 μl |
| T4 DNA ligase | 1 | 20 |
| 10x T4 DNA ligase buffer | 2 | 1x |
| Gezuiverde plasmide ruggengraat Low Melt verdund 1/2 van stap 3,5 |
2 | Variabele |
| Verteerde en gezuiverde PCR-amplicon vanaf stap 2,7 | 8 | Variabele |
Tabel 6: Plasmide ligatie protocol. De instructie geldt voor de ligatie van de plasmide DNA-backbone met het verteerde PCR-ampliconlengte voor temp-DNA zoals beschreven in stap 3,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel wordt een veelgebruikte methode gepresenteerd die de analyse van de BKPyV non-coding Control-Region (NCCR) gedreven vroege en late Promoter activiteit mogelijk maakt. De NCCR-activiteit kan gelijktijdig worden gemeten en heeft geen lysis nodig van de getransfunteerde cellen. Bovendien kan een relatief groot aantal cellen worden geanalyseerd en is de co-transfectie van extra markers voor normalisatie van de fluorescentie waarden niet nodig.
Een essentieel onderdeel van deze methode is dat de gekloonde nccr exact dezelfde reeksen moet bevatten als geïdentificeerd door de ampliconlengte voor temp-sequencing, die overeenkomt met de meerderheids varianten in het plasma van de patiënt. Om nauwkeurige resultaten te bereiken en om PCR-gevoelige fouten te minimaliseren, wordt het ten zeerste aanbevolen om een polymerase te gebruiken met een proof leesactiviteit. Als alternatief kunnen sequenties worden besteld door commerciële gensynthese diensten. De aangewezen nccr-sequenties kunnen worden besteld met inbegrip van flankerende agei en Spei restrictie sites voor direct klonen. Verwerk in dit geval het plasmide parallel met de ruggengraat plasmide en vervang de Spacer insert door het corresponderende NCCR-fragment uit de gesynthetiseerde constructie. DNA kan ook worden geïsoleerd uit urine monsters. Echter, aangezien BKPyV ook wordt uitgescheiden in de urine door immunocompetente individuen en niet noodzakelijkerwijs weerspiegelen actieve replicatie, de klinische relevantie is beperkt. Idealiter kan het DNA ook worden geïsoleerd van renale biopsieën waarin eerder PVAN histologisch kon worden gedetecteerd (vergelijk met Korth et al., 201919).
Door de gemiddelde fluorescentie intensiteit van groene en rode fluorescerende cellen te meten, maakt deze methode het mogelijk om NCCR-afgeleide fluorescentie/activiteit te kwantificeren zonder de bias van de transfectie-efficiëntie en de anti-proliferatieve effecten van de geteste agentia (bijv. dubbele mTOR remmers INK128 of PP242)5.
Een andere toepassing van het reporter systeem is de mogelijkheid van het analyseren van de gevolgen van inserties, verwijderingen, of duplicaties in de NCCR gevonden in klinische isolaten op de vroege en late promotor activiteit. In eerdere studies zijn immunosuppressieve agentia bestudeerd om de NCCR-activiteit te moduleren; Er werden echter geen mutaties of NCCR-herschikkingen gevonden die de gevoeligheid beïnvloeden. Mutaties kunnen echter invloed hebben op de respons van nieuwe stoffen die in de nabije toekomst kunnen worden goedgekeurd.
Dit kan relevant zijn, omdat in tegenstelling tot de codeer gebieden groot T-antigeen of VP1 capside-eiwit, de NCCR zoals de naam impliceert een niet-coderende regio vertegenwoordigt en dus geen selectieve druk op het aminozuur niveau ten grondslag ligt.
In dit protocol wordt de selectie van positieve klonen met de NCCR geverifieerd door AgeI en SpeI spijsvertering. Echter, een kolonie PCR kan een alternatieve benadering voor het snel scherm voor NCCR inserts rechtstreeks uit E. coli verguld op agar platen vertegenwoordigen. Gebruik voor deze benadering primer paar BKV-CR-2-FW-AgeI en EGFP-N (tabel 1). Na transfectie worden cellen gecontroleerd op rode en groene fluorescentie met fluorescentiemicroscopie (Figuur 4). Als alternatief kunnen cellen worden opgelost met 3% PFA gedurende 20 minuten bij 22 °C. In dit geval, wassen met PBS, toevoegen 0,2% niet-ionische wasmiddel in PBS en inbroed 10 min. vaste cellen kunnen vervolgens worden gekleurd met DAPI in PBS (1 μg/mL) gedurende 10 minuten bij 22 °C en worden blootgesteld aan fluorescentiemicroscopie analyse en gevisualiseerd met UV-licht (340-380 nm).
Aangezien zowel fluorophores haven dezelfde polyadenylatie signalen, een effect van polyadenylatie efficiëntie kan worden geregeerd. In vergelijking met eGFP is tdTomato echter een dimere proteïne dat dienovereenkomstig moet worden getranscribeerd in een langere mRNA (codeer volgorde: 745 versus 1431 BP). Aangezien de activiteit van de promotors uit de cellen die met storende stoffen worden behandeld, echter altijd ten opzichte van onbehandelde (DMSO) cellen wordt vergeleken, speelt dit verschil weinig rol. Vanwege de aanwezigheid van de oorsprong van de replicatie, de transfectie van de reporter plasmide in cellen stabiel uitdrukken van de SV40PyV grote T antigeen maakt de overdracht van plasmiden naar de dochtercellen. Het is aangetoond dat het SV40 afgeleide grote T-antigeen SV40 en BKPyV NCCR en virale DNA-replicatie kan transactiveren20. Echter, aangezien een groot T-antigeen ook betrokken is bij de overgang van de vroege naar de late fase van infectie, wordt een kunstmatige situatie gegeven. Met deze test moet worden overwogen dat de meest replicatie beperkende stap de vroege uitdrukking is die leidt tot de uitdrukking van het grote T-antigeen. Om de volledige replicatiecyclus in kaart te brengen, moeten de vroege en de late mrna's worden gemeten in geïnfecteerde cellen door QRT-PCR, zoals elders beschreven5,12.
Zwitserse en Duitse groepen hebben reeds een vergelijkbare methode gebruikt om archetypische en geherarrangeerde bkpyv nccr-afgeleide promotor-activiteiten te analyseren, zij het met onafhankelijk gekloonde vector systemen5,5. Gosert en collega's uit Bazel gebruikten een soortgelijke methode om de nccr Promoter activiteit van bkpyv en jcpyv stammen9,10,11te bepalen. Beide methoden gebruikt eGFP voor groene fluorescentie; de Bazel-groep gebruikte echter RFP terwijl in het huidige protocol tdTomato werd gebruikt voor rode fluorescentie. Het voordeel van tdTomato boven RFP is de veel hogere foto stabiliteit; het dimere-eiwit wordt echter gecodeerd door een reeks die twee keer zo lang is als RFP21. Bovendien kan de halfwaardetijd van de eiwitten verschillend zijn, resulterend in ongelijke concentratie 72 h post transfectie. Dit probleem kan echter alleen relevant zijn bij het rechtstreeks vergelijken van beide fluorescentie intensiteiten. Gosert et al. gebruikt BamHI en NotI als restrictie sites terwijl in het huidige protocol AgeI en SpeI de NCCR-sequentie flaneren. Met behulp van beide methoden leverde de referentie Dunlop stam16 vergelijkbare fluorescentie patronen op met sterke vroege, maar zwakke, late promotor-activiteit9,10. In verdere overeenstemming resulteerde de nccr-herschikking met invoegingen in de P-regio in een aanzienlijke toename van de vroege en late promotor-activiteit in vergelijking met WT-nccr5,5.
Hoewel is aangetoond dat het SV40 afgeleide grote T-antigeen SV40 en BKPyV afgeleide NCCRs20kan transactiveren, is het misschien interessant om menselijke cellen te gebruiken die het grote t-antigeen van de bkpyv stabiel uitdrukken en niet het prototype virus SV40 in toekomstige studies . In dit geval moet de cellijn echter eenvoudig te transfect zijn (bijv. HEK293).
Aangezien de NCCR-organisatoren van poly omavirussen zeer vergelijkbaar zijn, kan deze methode ook worden gebruikt (met kleine aanpassing in de primer sequenties) om de promotor activiteit en de invloed van krachtige antivirale middelen op de activiteit van JC-polyomavirus (JCPyV) te onderzoeken afgeleide gebieden met niet-Codeer controle11. Aangezien JCPyV de veroorzaker is van de progressieve multifocale leuko-encefalopathie (PML), een zeldzame aandoening van het centrale zenuwstelsel die zelden kan optreden bij patiënten met immunodeficiënties resulterend in ernstige Neuropathologie, is er ook een dringende behoefte om direct werkende antivirale stoffen voor de behandeling van immuungecompromitteerde patiënten. Belangwekkend, herschikkingen zijn ook te vinden in JC NCCRs11. Aangezien JCPyV neurotropisme heeft uitgesproken en dus grote hoeveelheden virussen worden aangetroffen in drank, moet de monster overname worden aangepast aan het DNA van de drank. De volgende stappen kunnen echter eenvoudig worden aangepast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Johannes Korth ontving subsidies voor spreker's fee en reiskosten van Astellas en Novartis. Marek Widera heeft consultancykosten van Novartis ontvangen. Oliver Witzke heeft subsidies ontvangen voor klinische studies, spreker's fee, honorarium en reiskosten van Amgen, Alexion, Astellas, Basilea, Biotest, Bristol-Myers-Squibb, Correvio, Chiesi, Gilead, HEXAL, Janssen, Dr. F. Köhler chemie, MSD, Novartis, Roche, Pfizer, Sanofi en TEVA.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Barbara Bleekmann voor de uitstekende technische assistentie. Deze studies werden ondersteund door het IFORES-programma van de Universiteit van Duisburg-Essen Medical School en het RIMUR-programma van de University Alliance Ruhr en Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). De auteurs danken de Jürgen-manchot-Stiftung voor het doctoraats Genootschap van Helene Sertznig en voortdurende steun. Het verzamelen en gebruiken van patiëntenmateriaal is goedgekeurd door de ethische commissie van de medische faculteit van de Universiteit Duisburg-Essen (14-6028-BO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
References
- Drachenberg, C. B., et al. Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load. American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).
- Korth, J., et al. Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function. Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).
- Hirsch, H. H., et al. European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation. Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).
- Masutani, K., et al. The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome. American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).
- Korth, J., et al. Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region. Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).
- Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12. Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).
- Sanchez Fructuoso, A. I., et al. Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients. Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).
- Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis. Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).
- Gosert, R., et al. Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology. Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).
- Bethge, T., et al. Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression. Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).
- Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate. Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).
- Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression. American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).
- Widera, M., et al. HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia. Medical Microbiology Immunology. , (2017).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).
- Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland. Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).
- Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals. Virology. 198 (1), 59-70 (1994).
- Teutsch, K., et al. Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy. Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).
- Korth, J., et al. The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation. Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).
- Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens. Virology. 152 (2), 459-465 (1986).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
