Summary
多機能Ser/ThrキナーゼAURKAの活性化は、Thr288の自己リン酸化によって特徴付けられます。ここでは、プローブエンジニアリングの戦略と、有糸分裂全体のキナーゼ活性化に従う迅速なFRETプロトコルを示す。
Abstract
上皮癌は、しばしばSer/ThrキナーゼオーロラA /AURKAの過剰発現によって特徴付けられます。AURKAはThr288での自己リン酸化時に活性化する多機能タンパク質であり、有糸分裂におけるAURKAの豊富なピークは、有糸性紡錘の安定性と忠実度、および有糸分裂の全体的な効率を制御する。構造レベルで十分に特徴付けられるが、細胞周期を通してAURKAの活性化の一貫したモニタリングが欠けている。可能な解決策は、遺伝的にコード化されたフェルスターの共鳴エネルギー伝達(FRET)バイオセンサーを使用して、十分な時間的解像度でAURKAの自己リン酸化に関する洞察を得ることから成り立っています。ここでは、Thr288自動リン酸化を検出するFRETバイオセンサーを設計するプロトコルと、この変化を有糸分裂中にどう従うかについて説明する。まず、ドナー/アクセプターFRETペアの概要を説明し、哺乳動物細胞におけるAURKA FRETバイオセンサーのクローニングおよび挿入方法について説明します。次に、カスタム構築されたセットアップで蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)による迅速なFRET測定のステップバイステップ分析を行います。ただし、このプロトコルは、代替の商用ソリューションにも適用できます。我々は、AURKAベースのバイオセンサーに最も適切なFRET制御を検討し、このツールの感度をさらに高めるための潜在的な将来の改善を強調することによって結論付ける。
Introduction
オーロラキナーゼA/AURKAは多機能なセリン/スレオニンキナーゼであり、細胞周期を通して、そして異なる細胞内の区画1で活性である。AURKAはしばしば上皮性および造影性悪性腫瘍で過剰発現し、患者は現在利用可能な治療法に対する反応性が低いため、その広範な時空間的活性化を理解することは癌において特に重要である2。
構造研究は、AURKAが非アクティブからアクティブキナーゼに変換するために2つのステップを受けることを明らかにしました。まず、Thr288の自己リン酸化はキナーゼの運動用ポケットの立体構造を変化させ、それを活性化させる3,4,5,6。このステップは、ヒト細胞およびゼノプスlaevis3,6,7におけるAURKAの触媒活性を増加させ、キナーゼを完全な活性のためにプライミングする。一度活性化されると、AURKAとXklp2(TPX2)の標的タンパク質との相互作用は、第2の立体構造変化を誘導する5。このさらなる変更により、AURKAはセル5,8,9,10の基質に向かって完全な酵素活性に達することができます。
約20年間、AURKAの活性化と活性に関する洞察は、主に生化学的アプローチの組み合わせを通じて得られました。これらには、AURKA活性化の特徴として細胞または生体内でリン酸化Thr288の検出、結晶学的分析、およびAURKA1の活性をプローブするインビトロまたはセルロキナーゼアッセイが含まれる。しかし、これらのアプローチの時空間的な解決は貧弱または存在せず、これら2つの事象のダイナミクスの知識を広げるためには新しい解決策が必要であった。
ここ数年の蛍光プローブの開発は、生細胞におけるAURKAのモニタリングを促進し、より大きな時空間分解能で以下の活性化を可能にした。これまでに開発されたAURKAの最も特異的なセンサは、FRET原理(Försterの共振エネルギー伝達)11に依存して、非アクティブなAURKAとアクティブなAURKAを区別しています。最初に開発されたセンサは、AURKAキナーゼ活性の基質ベースのバイオセンサーであった。基質ベースのバイオセンサーは、リン酸化のために与えられたキナーゼによって標的となる短いアミノ酸配列によって構成され、ドナー/アクセプタFRETペアおよびリン酸化残基を認識する結合ドメイン内に挿入され、効率的なFRETプロセス12のためのバイオセンサーの折り畳みを助ける。AURKAの場合、リン酸化によって標的となるKIF2Cの14アミノ酸フラグメントをCFP-YFPドナー/アクセプタpair13の間に挿入した。しかし、このセンサには大きな欠点があります。まず、このプローブに使用されるKIF2C配列をAURKAと密接に関連するキナーゼAURKBの両方で標的化することができ、これによりこのバイオセンサの特異性を低下させることができる。第二に、センサーは、リン酸化のために内因性キナーゼに依存しています。したがって、FRETの効率は、キナーゼの量が制限されている場合(例えば、細胞内区画または細胞周期段階で)検出できないか、または有意ではない。これらの制限を克服するために、新しいクラスのAURKAセンサーが「立体構造センサー」と呼ばれる新しいクラスを作られました。これらのプローブでは、AURKAの全長配列をN末流のドナー蛍光素内に挿入し、C末語でアクセプターフルオロフォアを挿入した。非アクティブなAURKAは、キナーゼのN-およびC末語を互いに遠ざける「オープン」な立体構造を提示する。2つの末語間(>10 nm)間の距離を持つドナー/アクソクサのペアは、FRETの非許容構成になります。それどころか、自己リン酸化AURKAは、2つのタンパク質末語と2つのフルオロフォアが近接して「閉じた」立体構造を採用しています。これは、ドナーとアクセクサとの間のFRETを可能にすることが示された、ドナー寿命14,15の変動を用いて測定することができる。このようなプローブはいくつかの利点を提示する。まず、それらは遺伝的にコードされ、細胞内の内因性キナーゼを置き換えるために使用することができる。第二に、AURKAのノックダウンによって誘発された表型を救出し、細胞内で機能していることを示す。第三に、それらは異なる細胞内区画および細胞周期を通してキナーゼの活性化に従うことを可能にする。このプローブは、キナーゼが活性化することが知られている場所(すなわちセントロソームおよび有糸性紡錘)でAURKAの活性化を検出し、またミトコンドリア16でAURKAの活性化を発見することに関与した。最後に、これらのセンサはFRET/FLIMに基づく高含有スクリーニングを可能にし、そこでAURKAの立体構造変化を使用して新しい薬理学的阻害剤を同定した17。
本研究では、培養細胞におけるAURKA活性化を可視化する手順について説明する。まず、FRETの蛍光ポアペアの可能性について洞察を行います。最も適したドナー/アクソクサペアの選択は、利用可能な顕微鏡のセットアップ、または多重FRET18,19として特定の下流アプリケーションに従って行われます。次に、迅速なFRET/FLIM顕微鏡セットアップで選択したバイオセンサの挙動を探るパイプラインを提案する。このパイプラインは、細胞培養および同期手順から FLIM 取得およびデータ分析まで拡張されます。最後に、バイオセンサ設計の類似戦略を他のキナーゼに適用し、他のFRETベースのイメージングシステムでも使用することができるので、このプロトコルの潜在的な利点について議論します。
Protocol
注意:このプロトコルで使用されるU2OS細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC、HTB-96)から購入され、マイコプラズマから無料でテストされました。ステップ2.1から2.7は細胞および試薬を無菌に保つために層流フードの下で行われるべきである。
1. ドナー/アクソクターのFRETペアの選択
- 最も適したドナー/アクティバクターFRETペアの選択については、文献を参照してください。有用な例は20、21、22、23、24で見つけることができますが、最終的な選択はFRET / FLIMセットアップの特性(利用可能なレーザーライン、フィルタなど)に従って行う必要があります。以下は、ドナー/アクセクサペアの選択方法に関する考慮事項です。
- ドナーの選択:利用可能な蛍光タンパク質に関する完全な情報については、FPベース(https://www.fpbase.org/)を参照してください。このデータベースは、新しく開発されたすべてのフルオロフォアで常に更新されます。
- 使用されているそれぞれの蛍光タンパク質とともに、文献ですでに入手可能なバイオセンサーの詳細については、蛍光バイオセンサーデータベース(https://biosensordb.ucsd.edu/index.php)を参照してください。
- 一般的な出発点として、明るいドナー蛍光色素を選択してください。候補としては、mTFP1またはECFPとしてシアン蛍光タンパク質、またはEGFPまたはmEGFPとしてGFP変異体が適しています。
- オリゴマーは、タンパク質の局在および/または機能に影響を与える可能性があります25.CFPの単量体変異体をmTurquoise226、またはアクアマリン27,28として使用することを検討してください。これらの変異体はまた、良好な量子収量と絶滅係数を有し、FRETドナーとして良好な候補となる。
- FRETの効率は、これらのパラメータ29によって大きな影響を受ける可能性がありますので、蛍光タンパク質(ドナーまたはアクセプターの両方)が、細胞内pH23のような環境変化に対して無神経な、または光漂白25に優先的に与えます。今日では、mTurquoise2やmTFP1のようなフルオロフォアは、その良好な写真安定性22,25,26のおかげで、ドナーとして広く使用されています。
- アクセプターの選択:シアンドナーは、多くの場合、mVenus、シトリン、YPet20、21、22,30として、黄色蛍光タンパク質(YFP)変異体と組み合わせられます。しかし、これらのタンパク質はpHに対してはるかに大きな感度を有し、世界的に貧弱な写真安定性を示すことを留意すべきである。
- 新たに開発された、PH感受性黄色の変種をpH-Lemon31、緑色フルオロフォアをmNeonGreen23として、またはmTurquoise2の以前に検証された蛍光アクセプターとしてmScarlet-I23,32として使用することを検討してください。
- あるいは、FreT/FLIM実験でシアン蛍光ドナーの良好なアクセクサとして振る舞うことを示したShadowG33 またはShadowY34としてYFPの非蛍光/暗い誘導体を使用することを検討してください。
- mEGFPをドナーとして使用する場合は、単量体赤色アクセクターをmCherryとして使用することを検討してください。
- FP ベース Web サイトで利用可能なツールを使用して、選択したドナー/アクセクター ペアのスペクトルプロパティを確認します。mEGFP/mCherry ペアの例については 、図 1 を参照してください。
- FP ベース Web サイトで、[ ツール ] ドロップダウン メニューを選択し、[ スペクトル ビューアー] を選択します。
- ドロップダウンメニューで、視覚化するフルオロフォアペアの名前(例えば、mEGFPとmCherry)を入力します。
- ドロップダウン メニューで特定のレーザーを選択して、ドナー/アクサクタ ペアと特定の光源のプロパティをシミュレートします。または、[レーザーの 追加] を選択して特定のレーザー波長を入力します。蛍光素スペクトルを希望の波長に合わせるには 、[この 発光を正規化]オプションをクリックします。ここで、GFPを励起するために使用される波長は、10nm±480である。
- 選択したドナー/アクセプターペアを、AURKAの全長配列のN末流に1つ、およびC末語に1つを加えることによってクローンを作成します。好ましいクローニング法のガイドラインに従って、この構築物を選択した哺乳類発現ベクターに挿入する。
2. 細胞培養、トランスフェクション、同期
- 1日目。U2OS細胞用培地を調製する:10%の胎児性牛血清(FBS)、1%ペニシリンストレプトマイシン、1%L-グルタミン(ここから、 完全な成長培地)を添加したダルベックの改変イーグル培地(DMEM)を使用してください。あるいは, 事前補充 L-グルタミンと DMEM も使用できます。.
- 細胞が凍結している場合、実験の少なくとも8日前にバイアルを解凍する(すなわち、ポイント2.5以降)。
- 哺乳類細胞培養専用のインキュベーターで細胞を37°C、5%CO2で増殖させます。汚染を避けるために定期的にインキュベーターを洗浄し、滅菌してください。
- 細胞が約80%の合流に達すると:
- Ca2+およびMg2+なしで滅菌1xリン酸緩衝液生理食塩素(PBS)で簡単に洗浄してください。
- トリプシンは、メーカーのプロトコルに従い、1〜3分間インキュベーターに細胞を置くことによって、無菌0.05%トリプシン-EDTAで細胞をトリプシン化します。
- 完全な成長培地の2倍の量を追加することによりトリプシンを非活性化;よく混ぜる。
- 細胞懸濁液を800xgで3〜5分間遠心する。
- ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、翌日のチャンバースライドで〜70〜80%の合流度に適切な希釈量を計算します。あるいは、生細胞イメージングに対する同様の支持も使用できる。
- 選択した生細胞イメージングサポート内の細胞の対応する容積をピペトし、翌日まで細胞をインキュベーターに戻す。
- 2日目。トランスフェクションを進めます。最適なトランスフェクション効率(〜50/80%)を得るために好ましい一時的なトランスフェクション方法のガイドラインに従ってください。具体的なトランスフェクション方法は必要ありません。なお、トランスフェクション効率は、使用する細胞株に応じて変化し得る。48時間インキュベート。
注:3つのベクターを含む安定クローンを作製し、一過性トランスフェクションの必要性を回避してください。この段階では、2 種類のコントロールを計画する必要があります。まず、全長AURKAの存在がmTurquoise2の寿命を摂動しないことを確認するために、「ドナー専用」制御が必要である。第二に、キナーゼ死んだ変異を運ぶバイオセンサは、FRETが廃止または著しく低下する陰性制御として使用されるべきである。あるいはキナーゼ死性変異体に対して、ATPアナログMLN8237としてAURKA活性化の化学的阻害剤を陰性対照として用いることができる。- 3つのトランスフェクション条件を事前に計画し、それぞれが独立した井戸で計画します。
「ドナーのみ」ベクター(例えば、AURKA-mTurquoise2)
「バイオセンサー」(例えば、スーパーYFP-AURKA-mTurquoise2)
キナーゼデッド/"K162M"バイオセンサー(例えば、スーパーYFP-AURKA K162M-mTurquoise2)または代替的に、AURKA活性化の阻害剤(例えば、MLN8237) - 比較する独立したドナー/アクサクサペアごとに3つの条件を実行します。
- 同期していない細胞とG2/M同期セルを比較する場合は、トランスフェクションウェルの数を2倍にすることを検討してください(ステップ2.6を参照)。
- 3つのトランスフェクション条件を事前に計画し、それぞれが独立した井戸で計画します。
- 3日目。G2/M.の細胞を同期化し、DMSOに溶解した100ng/mLノコダゾールを添加し、光暴露を回避し、16時間インキュベートするトランスフェクトウェル(好ましくは一晩)を行う。非同期細胞とG2/M同期セルを比較する場合は、ノコダゾールまたはDMSOの等量で各トランスフェクション状態を処理します。同期効率を向上させるため、DMSOでノコダゾールの単独使用アリコートを用意し、-20°Cで保存し、使用後に廃棄してください。
メモ: セルの同期効率は、セルラインによって異なる場合があります。ノコダゾールの最適濃度とそのインキュベーション時間は、FRET/FLIM実験の前にフローサイトメトリーアプローチによって実験的に決定されるべきである。統計的に関連するFRET/FLIM分析では、G2/Mの同期効率は、細胞全体の人口の少なくとも50%を推奨します。 - 4日目。糸球菌細胞におけるノコダゾール洗浄とFRET/FLIMイメージング
- 培養液をピペットで取り出し、事前に温めた無菌PBSに交換します。可能であれば光の露出を避けてください。そっとプレートを揺らします。
- 常に光の露出を避けて、洗浄手順を繰り返します。
- 2番目のPBS洗浄を取り除き、20%の胎児ウシ血清(FBS)と1%ペニシリン・ストレプトマイシン(ここから 画像媒体)を補充し、事前に温められて無菌のライボヴィッツL-15培地に置き換えます。
注:イメージングメディアは、pHインジケータ(例えば、フェノールレッド)とリボフラビンなどの培地成分なしで購入する必要があります。これらの物質は、生涯価値を摂動する可能性のある自己蛍光の源です。 - FRET/FLIM イメージングを続行します。温度の急激な変化を最小限にし、できるだけ速く撮像ステップ(ステップ3)に進みます。サンプルを顕微鏡のセットアップに運ぶ際に、試料を光から保護することを検討してください(すなわち、アルミホイルに包むか、箱に入れることによって)。
3. フレット/FLIMの買収
注: このプロトコルでの FRET/FLIM の取得は、35 で説明されているカスタム構築されたセットアップで行われ、in15,17 のような制御ソリューションが装備されています(図 2)。セットアップは現在、Inscoperによって製品化され、それは脈拍励起のための白いレーザー、およびカメラの前に高率のタイムゲート増強を用いる回転円盤顕微鏡で作られる。10 nsのタイムウィンドウ内の2nsの時間ゲートは、5つのタイムゲート画像のスタックを取得するために順番に使用されます。これらの画像は、次の式に従ってピクセル単位の平均蛍光寿命を計算するために使用されます: τ = ΣΔti • ΣΤi / Σ)。.この方法は、迅速なFLIM測定を保証します:フィッティングまたはビニングステップは必要なく、寿命は最小限のフォトン予算でオンラインモードで計算することができます。システムはまたユーザーフレンドリーなソフトウェアインターフェイスを示す。しかし、FLIM測定用に装備されている他の商用顕微鏡の設定でも同じ実験を行うことができます。
- G2/Mブロックから有糸分裂への細胞の最適な放出を確実にするために、37°Cで実験を行う。 可能であれば、サーモスタット室を装備した顕微鏡設定でFRET/FLIM実験を行います。
- 実験の少なくとも30分から1時間前に、顕微鏡のサーモスタット室をオンにします。
- レーザー、カメラ、顕微鏡のセットアップ、イメージングソフトウェアのスイッチをオンにします(図2)。
- ドナー蛍光色素に適した励起波長と発光波長を選択します。便利な波長オプションは、λex 440/10 nmおよびλem 483/35 mTurquoise2用(図3A)です。GFP用のλex 488/10 nmおよびλem 525/50 nm)(図3B)。
- 露光時間を、通常は30~100ミリ秒に設定します(図3)。過度のレーザーパワーは、光漂白として誘導光毒性効果をもたらし、蛍光寿命37を変更する可能性があることを注意してください。セットアップでは、タイムラプス獲得中に第1ゲートの蛍光強度を監視することにより、光漂白イベントの欠如を検証します。蛍光強度の変動が観察可能な場合は、取得を破棄し、レーザーパワーを調整します。
注: ここでのセットアップで、最初のゲートで最低 3000 グレーのレベルを許可する露出時間を選択します。それ以外の場合、ソフトウェアはドナーの寿命を計算しません。このグレーのレベル値は、関連するライフタイム値を取得するために必要な最小フォトン予算に対応します。 - FRET/FLIMの獲得を開始する前に、細胞が双極性スピンドル(U2OS細胞で約20/30分)の出現まで待つことによって有糸分裂に入っていることを確認してください。この構造で主に有糸分裂性AURKAが局地化するため、顕微鏡下で直接細胞内の紡錘の形成をスクリーニングし、外的な光源を用いて有糸状体の進行を検証する(図1)。有糸分裂の進行に必要な時間は、使用される細胞株によって異なる場合があることに注意してください。
- MLN8237による治療が計画されている場合は、顕微鏡下に細胞を置き、メタフェーズ(ノコダゾール洗浄後約20分)に到達できるようにします。DMSOに溶解した250nM MLN8237を、ドナーのみの構築物を発現する細胞とバイオセンサーを発現する細胞の両方に添加する。
- 上記のようにトランスフェクトされた細胞に対してこの状態を制御し、同量のDMSOでインキュベートする。より良いAURKA阻害のために、DMSOでMLN8237の単独使用アリコートを準備し、-80°Cで保管してください。 氷の上にアリコートを置いて解凍し、使用後に廃棄します。
- 10分間インキュベートします。この期間の後、有糸性紡錘は縮小し、単一の、強烈な点だけが残されます。K162M変異体が使用される場合にも同様の表現型が認められる。
- 有糸組み合せスピンドルの解像度を向上させるために、少なくとも63倍の目的を使用してください(図3)。
- メタフェーズのセルが見つかったら (メタフェーズのセルの例として 図 4 を参照)、 xyz 座標を調整して、視野の中心に配置します。
- イメージを高速化するには、1 つの z 平面を 1 つ選択します。有糸組み合わせたスピンドルがより目に見える、または強い平面を選択します。
- 記録を開始します。取得時間は、使用する FLIM セットアップによって異なる場合があります (数秒から分まで)。市場で入手可能な市販のセットアップの大半は、蛍光顕微鏡写真とピクセル単位の生涯マップの両方を詳しく説明します。両方の画像を保存します。
- 各トランスフェクションおよび/または治療条件から少なくとも10個の独立した画像を取得します。
4. Δの寿命の計算とドナー/アクサプリクサペア間のFLIM値の比較
- ピクセル単位の有効期間マップ全体 (つまり、ミトティック スピンドル全体)から有効期間値を抽出するか、特定のサブ領域に対応する関心領域 (ROI) を選択します。
注: 使用される FRET/FLIM セットアップによると、寿命計算は取得ソフトウェアで直接実行されるか、または汎用画像処理ソリューション (例: Fiji/ImageJ: https://fiji.sc/) で抽出されます。直接寿命値を計算するソフトウェア ( オンライン モードとも呼ばれます) よりユーザーフレンドリーなソリューションを提供します, 初心者や FRET/FLIM に完全に精通していない顕微鏡ユーザーに適しています.逆に、取得後の生涯値の抽出には、多くの場合、フィッティング手順が必要です。このオプションは、フィッティングの数学的モデルに関するいくつかの以前の知識が必要であるため、初心者にはアクセスが少なくなります。 - 一旦可視化または抽出されると、「ドナーのみ」ベクターを発現する細胞の平均寿命(例えば、AURKA-mTurquoise2)を算出し、このことは ドナーの寿命を意味する。
- ステップ 4.1 で計算された各独立した生涯値を平均ドナーの寿命から差し引きます。分析されたすべての条件のすべてのセルに対してこの手順を繰り返すと、各条件に対して ΔLifetime が与えます。
- 「ドナーのみ」、"バイオセンサー"と"K162M"、またはDMSOとMLN8237条件のΔLifetime値を比較します。
注: 「ドナーのみ」条件の場合、ΔLifetime はゼロに近い値となり、生涯値の実験変動に対応する必要があります。「バイオセンサー」条件の場合、ΔLifetime 値は 2 つの構成要素の間の正味の差を生じるはずです (図示の例については 図 4 を参照)。 - 異なるドナー/アクイザのペア間でΔLifetime値を比較します。
- 「バイオセンサー」条件を比較する:彼らは同様のΔLifetimeを示していますか?
- 「K162M」またはMLN8237条件は、それらの間で同様のΔLifetimeを示していますか?彼らのΔLifetimeは「ドナーのみ」の状態に似ていますか?
Representative Results
我々は、異なるスペクトル特性を有する2つのバイオセンサーを用いて、Thr288上のAURKAの自己リン酸化を記録するために上記の手順に従った。我々は、初期のGFP-AURKa-mCherryプローブ14を、異なるスペクトル特性を有する2つのバイオセンサーと比較した。これらの2つのプローブは、蛍光ドナーmTurquoise2と1つのケースでは非蛍光アクセプター(ShadowG)、または2番目のケースでは黄色のアクセプタ(superYFP)に依存しています。その後、各ドナー/アクサクサペア内にAURKAの全長シーケンスを挿入しました。AURKAの活性化に対して負の制御を持つために、2つの戦略を追求することができます。まず、小さなATP-アナログ(MLN8237)を使用すると、キナーゼの運動ポケット内のATPの結合を妨害し、その活性化を防止する38。第二に、Lys162のMet(K162M)への変異により、14,15,39を活性化することができない各バイオセンサーのキナーゼデッドバージョンを作成する。この突然変異は、Lys162とGlu181の間に通常確立された塩橋の破壊を誘発し、キナーゼの運動用ポケットの安定した開口部をもたらし、その全体的な不活性化を引き起こす40。FRETのネガティブコントロールとして、アクセプターを欠いた構造(GFP-AURKAまたはAURKA-mTurquoise2)を使用しました。
G2/Mの細胞を同期させ、有糸分裂に放出した後、有糸性紡錘で全てのトランスフェクトされたコンストラクトの寿命を測定した(図4)。なお、この構造は全体として考慮され、スピンドル内のROIは分析されなかった。その後、すべての条件に対してΔLifetimeを計算しました。予想通り、GFP-AURKAまたはAURKA-mTurquoise2("ドナーのみ"条件)の寿命は0近くであり、これらの構成体に対して測定された値が平均値の周りに変動したことを示す(図4A、4B)。逆に、GFP-AURKA-mCherryのΔLifetime値はドナーのみの状態と統計的に異なり、ΔLifetimeは〜130 ps増加した(図4A)。同様の観測値は、shadowG-AURKA-mTurquoise2とスーパーYFP-AURKA-mTurquoise2で行われ、ΔLifetimeはドナーのみの状態からそれぞれ〜150と〜220ps増加しました(図4B、4C)。これらのデータは、疑似色参照テーブル (LUT) を使用して単一セルで簡単に視覚化できます。この場合、ΔLifetime の 0 前後の値は疑似色の黄色、より大きな違いは赤/紫の擬似色です。実際、ピクセルバイピクセルLUTはドナーのみの構成体を発現する細胞では黄色に近く、バイオセンサーを発現する細胞では赤色/紫色スペクトルが多かった(図4A、4B)。これは、GFP-AURKA-mCherryバイオセンサーを薬理阻害剤MLN8237で治療した場合にも観察された。
次に、キナーゼ死死んだバイオセンサーのΔLifetimeを分析した。これらの構成体は中間ΔLifetime値を示した:ΔLifetimeはドナーのみの状態(図4B,4C)と比較すると有意に高かったが、また、通常の比較よりも有意に低かった(図4B、4D)。MLN8237で処理された細胞またはキナーゼ死んだバイオセンサーを発現する細胞との比較は、各ドナー/アクセプターペアのΔLifetime変動がAURKAの活性化のみに関連しているかどうかを推定する必要がある。GFP-AURKA-mCherryの場合、AURKA特異的阻害剤を使用するとΔLifetimeバリエーションが廃止されます。逆に、ΔLifetimeのバリエーションは主に、シャドウG-AURKA-mTurquoise2およびスーパーYFP-AURKA-mTurquoise2の場合にはAURKA活性化に排他的にリンクされていません。
図1:GFP(ドナー)とmCherry(アクセクサ)の励起および発光スペクトル。
スペクトルはFPベースウェブサイト(https://www.fpbase.org/)から取得および適合し、480 nmレーザー励起に調整した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:実験ワークスペースの画像。
(1) 制御ソリューション(2) 白レーザー光源(3) CCDカメラ(4)顕微鏡のセットアップ;(5)試料の眼スクリーニング用の外部光源/ランプ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:FLIM取得用ソフトウェアの代表的な画像。
(A、B)(1) ドナーの励起および放出パラメータ( AのCFP、または BのGFP)(2) 露光時間;(3)目的の選択。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:AURKAフレットバイオセンサーとその陰性制御の代表的な画像。
(A) (顕微鏡写真) 蛍光 (グリーンチャネル) および GFP-AURKA または GFP-AURKA-mCherry を発現する U2OS 細胞のピクセル単位 ΔLifetime (ドナーのみ – バイオセンサー) G2/M で同期し、バイポーラスピンドルが見えるまで放出し、DMSO または MLN 8237 で処理します。ΔLifetime は、擬似色のスケール ("Fire" ルックアップ テーブル) で示されています。(グラフ)示された条件に対応する定量化と双方向の分散分析。(B)(顕微鏡写真)蛍光(シアンチャネル)と対応するピクセル単位ΔLifetime(ドナーのみ – バイオセンサー)シャドウG-AURKA-mTurquoise2(上パネル)またはスーパーYFP-AURKA-mTurquoise2(下部パネル)を発現するU2OS細胞の蛍光(シアンチャネル)と対応するピクセル単位ΔLifetime(上部パネル)、G2/Mで同期し、双極性スピンルが見えるまで放出される。ΔLifetime は、擬似色のスケール ("Fire" ルックアップ テーブル) で示されています。(グラフ)上記の顕微鏡写真に示された条件の対応する定量化および一方向のANOVA分析。(C)(顕微鏡写真)AURKA-mTurquoise2(上パネル)、シャドウG-AURKA K162M-mTurquoise2(中央パネル)、スーパーYFP-AURKA K162M-mTurquoise2の画像を取得し、顕微鏡写真のように表現。(グラフ)示されたトランスフェクション条件に対する双方向の分散分析。箱ひげ図のバーは中央値を表します。ウィスカーは、1つの代表的な実験(3つの)の条件ごとに最大 n =10細胞に分から伸びる。個々の値はドットで表されます。スケールバー:10 μm. *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001(A)の各示された条件に対して(A)「AURKA-mTurquoise2」条件(B)、および(C)の各示された条件に対して。NS:重要ではありません。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
遺伝子組み換えFRETバイオセンサーは、単一タンパク質またはシグナル伝達経路全体の活性化を測定するための信頼性の高いツールである41。特に、AURKA FRETバイオセンサーは、時間と空間におけるキナーゼの活性化を探索する優先的な方法を構成する。しかし、FRETバイオセンサーを設計または最適化する際には、一般的な用語だけでなく、AURKAに対して特に注意を払う必要がある要素もあります。
第一に、ドナー/アクセプターFRETペアの性質と相対位置を、このキナーゼの特定の機能に適合させることができる。AURKAは有糸分裂の間に有糸球体で非常に富化されるが、それは細胞周期全体および異なった細胞の位置(例えば、セントロソーム、核およびミトコンドリア)1,2に存在する。バイオセンサーが、酸性pHに到達できるミトコンドリアのような特定のコンパートメントで使用される場合、mTurquoise2/shadowGとしてpH感受性ドナーアクセプターFRETペアを選択する必要があります。さらに、FRETドナーをC末に置くことで、この細胞下コンパートメントでバイオセンサーをよりよく視覚化することができ、AURKA N末語がミトコンドリア16,42で部分的に切断することが示されたことを考えると、FRET検出を最適化する可能性さえある。
第二に、AURKA FRETバイオセンサーを最適化する未踏の方法は、フルレングスAURKAとドナー/アクセクサペアの間のリンカーのより慎重な設計を必要とするであろう。蛍光対間の距離だけでなく、リンカー自体の特性もFRET効率を向上させる重要な要因であることが示された43,44,45,46。この光の中で、リンカーの剛性または柔軟性を高めることは、FRET効率に有害であるか、またはさらに改善することができる。
第3に、AURKAの過剰発現が有数の細胞2の割合で有糸分裂性紡錘異常を誘導することが知られている。哺乳動物発現ベクターに見られる最も一般的なプロモーターの1つであるサイトメガロウイルス(CMV)のような強力なプロモーターの下で、またはAURKA最小プロモーター配列(CTTCCGG)14,47の下で同じFRET構築物を発現することによって得られたΔLifetimeを比較することは興味深いだろう。このプロモーターは、キナーゼのノックダウン後に生じる単極性または多極スピンドルを救出することが以前に示され、その使用はse14,47当たりの細胞周期摂動を誘発しなかった。FLIMはcell11のタンパク質発現レベルおよび相対濃度に対して無神経であるが、同じバイオセンサーのセットアップで2つのプロモーターを完全に比較することによって利益を得ることは、任意の場所で活性化されたAURKAのプールの理解を広げるだろう。さらに、上皮癌および血液学的癌のパラダイムに関連する過剰発現時にAURKA活性化がどのように変化するかについての新しい洞察を提供するであろう。
最後に、ダウンストリームの FRET アプリケーションも考慮する必要があります。AURKAの分野における将来の展望は、基質ベースのバイオセンサーを用いてキナーゼ立体構造バイオセンサーを累積することである。2つのバイオセンサーのFRET挙動を同時に分析する(マルチプレックスFRETと呼ばれるプロセス)は、第2のドナーチャネルでスペクトルブリードを避けるために、第1のバイオセンサーに暗いアクセクターを必要とします。AURKAの文脈では、これは第1のバイオセンサーでキナーゼの活性化を検出するエキサイティングな新しい視点を開き、第2のバイオセンサーと与えられた基板に向かってその酵素活性を開くだろう。マルチプレキシングの最近の開発により、同時に最大3つのバイオセンサーを一度に累積できるようになりました48.AURKAの文脈で同様の方法を適用することは、キナーゼの活性化活動相互作用をテストするだけでなく、前例のない時空間的解像度でAURKAシグナル伝達カスケードを探索する非常に有望な戦略を表す可能性があります。
結論として、FRET/FLIMはタンパク質活性に関する知識を深める便利な方法です。一方で、少なくとも1つの蛍光部分のおかげで、生細胞内の特定のタンパク質の局在を可視化することができます。一方、タンパク質の立体構造の変化を解明することができ、タンパク質の活性化や活性に有益である可能性があります。したがって、FRET/FLIMおよび立体構造FRETバイオセンサーは、生細胞のシグナル伝達経路に従う広範な方法になり、絶妙な時空間分解能を有する可能性を秘めている。
Disclosures
G.B実験を行い、原稿を書いてレビューし、資金を提供し、M.T.は原稿を見直し、支援を提供しました。M.T.は、この原稿に示されている迅速なFLIM測定のためのソリューションを生産するインスコープ会社(フランス)の科学顧問および株主です。インスコープは、原稿のオープンアクセス出版物を部分的にサポートしました。インスコープは、実験設計、データ処理、原稿の執筆に関与していなかった。
Acknowledgments
顕微鏡レンヌイメージングセンター(MRic、BIOSIT、レンヌ、フランス)のエンジニアに、アドバイスと助け、特にX.ピンソンの原稿を批判的に読んでくださったことに感謝します。MRicは、フランス国家研究庁(ANR-10-INBS-04)が支援する国家インフラフランスバイオイメージングのメンバーです。この作品は、 センター・ナショナル・デ・ラ・レシェルシュ・サイエンティフィック (CNRS)、 リーグ・コントル・ル・ガン・コミテ・ディレ・エ・ヴィレーヌ、デ・コート・ダルモール・エ・デュ・フィニステール、協会が ラ・レシェルシュ・コントル・ル・ガン(ARC)を G.Bに注ぎます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alisertib (MLN8237) | SelleckChem | S1133 | Use at a 250 nM final dilution |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
41966052 | High glucose + L-glutamine + Sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
10270106 | |
| L15 | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
21083027 | Leibovitz's L15 medium + L-glutamine, no Phenol red |
| LabTek | Nunc | 2515380 | |
| Nocodazole | Merck Brand: Sigma-Aldrich |
M1404 | Use at a 100 ng/mL final dilution |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
15140122 | Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x) |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
14190169 | DPBS, no calcium, no magnesium |
| Trypsin/EDTA | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
25300096 | Trypsin-EDTA 0.05%, Phenol Red (1x) |
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