Summary
在这里，我们描述了细菌中RIBO-seq样品收集和制备的阶段。根据这些准则对图书馆进行排序，可以获得足够的数据，以便进行全面的生物信息分析。我们目前的协议很简单，使用标准的实验室设备，从裂解到获得库需要七天时间。
Abstract
核糖体分析技术（RIBO-seq）是目前研究 体内蛋白质合成过程的最有效工具。与其他方法相比，这种方法的优点是它能够通过精确绘制 mRNA 成绩单上核糖体的位置和数量来监控翻译。
本文介绍了细菌中RIBO-seq方法的样品采集和制备的连续阶段，突出了与实验规划和执行相关的细节。
由于RIBO-seq依赖于完整的核糖体和相关的mRNA，关键步骤是快速抑制转化和细胞的充分解体。因此，我们建议在液氮中过滤和闪光冷冻，用于细胞采集，并可选使用氯霉素进行预处理，以阻止细菌的转化。对于解体，我们建议用砂浆研磨冷冻细胞，在氧化铝的存在下缠缠，以机械地破坏细胞壁。在此协议中，不需要蔗糖垫或蔗糖梯度超中心化用于单体净化。相反，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 进行 mRNA 分离，然后应用核糖体足迹切除 （28-30 nt 波段），并提供令人满意的结果。这在很大程度上简化了方法，并减少了程序的时间和设备要求。为了准备图书馆，我们建议使用市售的小型RNA套件，用于新英格兰生物实验室的照明测序，遵循制造商的指南，并进行一定程度的优化。
由此产生的 cDNA 库为下一代测序 （NGS） 提出了所需的适当数量和质量。根据上述协议对准备的库进行排序，每个样本可绘制 2 到 10 毫升的独特映射读数，为全面的生物信息分析提供足够的数据。我们介绍的协议是快速和相对容易的，可以用标准的实验室设备执行。
Introduction
核糖体分析技术（RIBO-seq）是在加州大学旧金山分校乔纳森·魏斯曼的实验室里开发的。与用于研究转化水平基因表达的其他方法相比，RIBO-seq 专注于与 mRNA 结合的每个核糖体，并提供有关其位置和成绩单上核糖体的相对数量的信息。它能够监测体内蛋白质合成的过程，并可以提供单一的圆环分辨率和精度，从而能够测量细胞中单个 mRNA 和整个转录组的核糖体密度。RIBO-seq 技术的基础在于，在翻译过程中，核糖体将 mRNA 分子结合，从而保护脚本的埋藏片段免受核糖化的消化。加入核糖这些片段称为核糖体脚印（RF），然后可以分离、测序并映射到它们产生的脚本上，从而检测核糖体的确切位置。事实上，自20世纪60年代以来，保护mRNA片段的核糖体能力一直被用来研究核糖体结合和翻译启动站点（TIS）2，3，4。然而，随着深测序技术的进步，RIBO-seq已成为翻译监测5的黄金标准，通过核糖体的参与，可以提供蛋白质合成6的全基因组信息。核糖体分析填补了抄本组和原型6号之间存在的技术空白。
要进行核糖体分析，我们需要获得在调查条件下生长的生物体的细胞裂解。在细胞收集和裂解过程中破坏这些条件可能会提供不可靠的数据。为了防止这种情况，通常使用液氮中的转化抑制剂、快速收获和闪光冷冻。细胞可以通过机械同质化器（如搅拌机7、8或珠子搅拌机9）中的低温研磨来解冻，也可以通过移液器10或针11进行三次搅拌。裂解缓冲器可以在细胞粉碎之前或之后添加。在我们的协议中，我们使用液氮来预冷砂浆和虫害，以及氧化铝作为一种更温和的方法来破坏细菌细胞壁，防止RNA剪切经常遇到，当方法，如声化应用。粉碎后，我们将冰冷裂解缓冲器添加到砂浆的冷却内容中。选择适当的裂解缓冲区对于获得核糖体足迹的最佳分辨率非常重要。由于离子强度影响RF大小和读数帧精度，目前建议使用低离子强度和缓冲容量的裂解缓冲器，即使缓冲成分似乎不影响mRNA11，12的核糖体占用率。裂解缓冲的重要成分是镁离子，其存在可防止核糖核酸亚单位的分离，并抑制细菌核糖体11、13的自发构象变化。钙离子也起着重要作用，对于细菌核糖核酸（MNase）在细菌核糖体分析方法14中使用的活性至关重要。添加瓜诺辛5×[β，γ-米多]三磷酸盐（GMP-PNP），GTP的不可水解的模拟，以及氯霉素抑制在裂解15期间的翻译。
获得裂解剂时，通过离心机进行澄清，并分为两部分，每部分用于 RIBO-seq 和高通量总 mRNA 测序 （RNA-seq），因为它们同时执行 （图 1）。RNA-seq 提供了一个参考点，可在数据分析期间比较来自 RIBO-seq 和 RNA-seq 的数据。被调查的转子是由核糖体足迹正常化到mRNA丰度16来定义的。来自RNA-seq的数据也有助于识别克隆或测序文物17。
图1。为RIBO-seq和RNA-seq准备的mRNA样本的原理图。 对于 RIBO-seq 库的准备，RNA 会用 MNase （A） 进行消化，然后选择长度为 ~28-30 nt 长度的 RF 大小（B）;RNA-seq RNA 是孤立的 （C），耗尽了 rRNA （D），由此产生的 mRNA 被随机分割成不同长度的片段 （E）。 请单击此处查看此图的较大版本。
RIBO-seq 和 RNA-seq 的样品制备程序的初始步骤略有不同（图 1）。对于核糖体分析，裂解酶需要由特定的内毒酶消化，以降解不受核糖体保护的mRNA分子。在标准协议中，获得的单体通过蔗糖垫超中心化或蔗糖梯度超中心化8，14回收。在本文中，我们表明，这一步骤是没有必要隔离的RF所需的RIBO-seq细菌，同样为真核细胞18，和大小选择适当的长度mRNA片段从多晶酰胺凝胶是足够的。
对于RNA-seq，mRNA是通过从总RNA-rRNA分子中耗尽到生物基化寡核苷酸探头获得的，后者与链球菌涂层的磁珠结合。然后用磁铁从样品中取出rRNA-寡核苷酸-珠复合物，导致rRNA耗尽样本19，20。纯化的mRNA分子然后随机碎片碱性水解。获得的 mRNA 片段以及核骨足迹被转换为 cDNA 库，并准备进行深测序（图 2）。这涉及碱性水解（用于 mRNA）和酶消化（用于 RF）后所需的末端修复：3' 端的脱磷，然后是 5' 端的磷酸化。接下来的步骤是适配器配合和反向转录，以创建 cDNA 插入，这些插入由使用 Illlumina 平台的下一代测序 （NGS） 所需的序列所示。库准备的最后阶段是 PCR 反应，其中结构被放大并贴上样品特定条形码的标签，以便在一个通道上对各种样品进行复用和排序。测序前，通过芯片电泳高灵敏度DNA评估库的质量和数量。然后，可以汇集和排序具有适当参数的 cDNA 库。可在不同的光照平台上进行排序，如 MiSeq、NextSeq 或 HighSeq，具体取决于库的数量、所需的读取长度和测序深度。测序后，进行生物信息分析。
图2。图书馆准备。 库准备包括末端修复、适配器结块、反向转录和用条形码放大。 请单击此处查看此图的较大版本。
核糖体剖析是一种通用的方法，可以根据科学问题进行易于修改和调整。最初它被用于酵母1，但不久后，它被应用于细菌细胞21以及真核模型生物，包括小鼠10，斑马鱼22，果蝇23和阿拉伯多普西塔利亚纳24。它也用于研究不同的核糖体类型：细胞质，线粒体25，26和叶绿体27，28。在欧盟核生物RIBO-seq是常见的适应和改进，以调查翻译的具体方面，包括启动10，11，29，30，31，32，拉长1，10，11，31，33，核糖体停滞33和构象变化33。大多数修改涉及使用不同的翻译抑制剂。然而，在细菌中，类似的研究一直难以进行，因为缺乏与行动34所需的机制的抑制剂。细菌中最常用的转化抑制剂是氯霉素 （CAM），它与肽转移酶中心 （PTC） 结合，防止氨基-tRNA在 A 站点的正确定位。因此，CAM阻止形成肽键，导致逮捕拉长核糖体35。细菌中翻译抑制剂的其他示例是四环素 （TET）36、雷塔帕穆林 （RET）34和 Onc11237，它们已用于调查翻译启动站点。TET，通过直接与A-site tRNA的抗子茎环重叠来防止tRNA输送到核糖体，最初用于验证从CAM治疗获得的结果，因为它们都是抑制翻译拉长38的抗生素。TET被发现检测原发性TIS，但无法显示内部TIS36。RET 结合细菌核糖体的 PTC，并通过干扰 A 站点中的拉长器氨基-tRNA 来防止形成第一个肽键。应用 RET 结果在小学和内部 TIS34中都会导致核糖体逮捕。Onc112，一种富含丙线的抗菌肽，在出口隧道中结合，并阻断核糖体A部位的氨基酸-tRNA结合。因此，Onc112 阻止启动复合物进入拉长阶段37。
核糖体分析提供的主要信息是核糖体密度及其在mRNA上的位置。它成功地用于研究不同生长条件下的翻译水平上的微分基因表达1、6、测量转化效率1、38、39，并检测利博索马尔暂停10等翻译调控事件。RIBO-seq还允许发现注释的ncRNA，伪基因和未注释的小开放读取帧（ORF）的翻译，导致识别新颖和/或非常短的蛋白质编码基因10，12，22，30，37。在这种情况下，RIBO-seq 可以微调和改进基因组注释。由于它对翻译的ORF的识别具有很高的敏感性和定量性质，核糖体分析也可以作为蛋白质组测定或辅助蛋白质组学研究31，34，39的代理。通过映射TIS，核糖体特征分析揭示了已知蛋白质10、32的N-末端延伸和截断等形。RIBO-seq也被改编为研究蛋白质14，21，24的共转化折叠。这种方法能够测量个体胶子6的拉长速率1、10、39或解码速度，并有助于开发翻译17的定量模型。核糖体分析方法还能够提供机械的见解，在细菌7，15，17，帧移位40，停止科顿读数21，终止/回收缺陷41，42和核糖体构象变化33在真核生物。RIBO-seq还被调整，以研究特定的转作用因子对翻译的影响，如miRNA6和RNA结合蛋白在真核生物16，43。然而，重要的是要承认，实验设计和获得的RIBO-seq分辨率决定了从由此产生的测序数据12中可以提取的信息量。
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Protocol
1. 样本收集
- 准备细菌培养。我们建议每个样本的文化量为 100 mL。
- 准备设备和试剂进行样品收集：每个样品两勺，无菌0.45微米混合纤维素酯膜（MCE）过滤器，50mL无菌管，液氮，50毫克/mL氯霉素在70%（vol/vol）乙醇（可选）。刺穿50mL管的盖子，使液氮蒸发，防止封闭管的爆炸。用实验室洗涤剂和 70% 乙醇去污勺子。
- 预热过滤设备和细菌培养的生长温度的勺子之一。
注：我们推荐一个带漏斗、碎底座、接地接头和47毫米弹簧夹的全玻璃过滤装置。 - 在采样前，将氯霉素加入细菌培养中，最终浓度为100微克/mL，孵育1分钟（可选）。
- 将液氮倒入 50 mL 无菌管中，并将第二勺放入管内冷却。
谨慎！液氮会导致封闭的容器爆炸，因为蒸发时压力变化。为了防止这种情况，有必要在50mL管的盖子上打几个洞，以便液氮蒸发。 - 通过过滤收集细胞。当介质通过膜时停止过滤，但不允许滤镜完全干燥。
- 通过使用预热铲快速刮掉过滤盘上的细胞来收集细菌颗粒。立即将整个勺子与收获的细胞放在充满液氮的 50 mL 管中。收获的颗粒应完全覆盖在液氮中。
- 让颗粒彻底冻结，并用先前冷却的第二勺清除冷冻细胞。关闭被刺穿的盖子，将管子转移到 -80°C 停止点
注：每次采集样品后对铲子进行消毒。
2. 细胞裂解
- 准备0.1 M GMP-PNP在10米特里斯pH 8，DNase I和1.5 mL反应管的铦，并保持他们在冰上。将离心机冷却至4°C。
- 准备裂解缓冲区 （20 mM TRIS pH 7.6， 10 mM MgAcet， 150 mM 卡塞特， 0.4% TRITON X-100， 6 mM β -麦加托乙醇， 5 mM 卡Cl2 和可选 1 mM 氯霉素）.将每个样品的裂解缓冲液的 500 μL 引用到 1.5 mL 反应管中，并将其放置在冰上。
- 用实验室洗涤剂和 70% 乙醇净化砂浆和害虫，并干燥。通过向砂浆中注入液氮来冷却砂浆和虫害。
- 将冷冻颗粒转移到预冷砂浆中，将其研磨成粉末。用铲子，加入大约1卷氧化铝，然后继续研磨。必要时浇注液氮，使砂浆、虫害和细胞保持冷却，不要让砂浆中的内容解冻。
- 在使用裂解缓冲之前，将 GMP-PNP 和 DNase I 添加到溶解缓冲液中，最终浓度分别为 2 mM 和 100 U/mL。将溶液与电池和氧化铝一起转移到砂浆中，并继续研磨。让岩茶在研磨时慢慢解冻，将混合物转移到预冷却的1.5 mL反应管中，并立即放在冰上。
- 离心解体在20 000 x g 下在4°C下5分钟。 将超自然分子转移到新的预冷却的1，5 mL反应管中，并把它们放在冰上。
- 用纳米滴测量每个样品中的RNA浓度。在无核糖水中使用 1：10 稀释样品和 1：10 稀释裂解缓冲液作为空白。
注意：请注意，氯霉素在260纳米时表现出显著的吸收。 - 将每个裂解水分成两部分：一部分用于RIBO-seq（0.5 - 1毫克RNA），另一部分用于RNA-seq（其余部分）。
- 根据制造商的协议，使用市售的 RNA 清理套件清洁 RNA-seq 的样品。
注意：我们建议使用 Zymo RNA 清洁和浓缩 -25 套件（参见 材料表）。我们还建议在样品和结合缓冲器中加入 4.5 卷乙醇（与样品量相比），用于核糖体足迹和碎裂的 mRNA，以提高短 RNA 片段的纯化效率。 - 将用于RNA-seq的样品存储在-80°C。 RNA-seq 的程序将从第 5 步开始继续。
3. 对RIBO-seq样品进行MNase消化
- 到 1 毫克 RNA 添加 3.8 μL 的 187.5 U/μL MNase 在 10 mM Tris pH 8 和充值与裂解缓冲器到总体积 500 μL。
- 在 25 °C，300 RPM 的温室中孵化 45 分钟。
- 使用市售的 RNA 清理套件清洁样品（如步骤 2.9）。
- 将样品存放在 -80 °C （停止点） 或进行大小选择。
4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 和 RIBO-seq 样品的大小选择
- 准备一个15%的聚丙烯酰胺-TBE凝胶与8M尿素，并将其放置在一个坦克与TBE缓冲。在200 V的恒定电压下预运行至少10分钟。
- 将样品与 TBE-尿素样品缓冲区混合，在 95 °C 下脱自然 1 分钟，并立即将其放置在冰上。
- 使用注射器将 TBE 缓冲器注入凝胶井，洗净尿素。加载样品，在样品之间留出一个井空间，以分离每个样品并防止交叉污染。使用29 nt寡核苷酸和26 nt和32 nt寡核苷酸的混合物作为标记。以180 V的恒定电压运行电泳。
- 为夜间孵化准备无菌缓冲（5 mM EDTA，10 mM NaOAc pH 5）。
- 电泳后，在 SYBR 金浴中染色凝胶约 2-3 分钟，用无核糖水冲洗凝胶。
- 使用无菌针头或剃须刀叶片将凝胶碎片在 26 至 32 nt 之间，并将凝胶碎片单独放置在每个样品的 1.5 mL 管中。在样品之间更换针头或剃须刀刀片。
- 在每个反应管中加入 200 μL 的隔夜潜伏缓冲。
- 在 10 °C、1000 RPM 的温混合器中隔夜孵化样品。
- 第二天，按照步骤 2.9 清洁样品。在 80μL 的无核水中留下脚印。
- 将样品存放在-80°C.停止点。RIBO-seq 的程序将从第 7 步开始继续。
5. 通过从RNA-seq样品中耗尽rRNA来净化细菌mRNA
- 用细菌 mRNA 净化试剂盒（例如，英异原 MICROB 快报）从样品中取出 rRNA。按照制造商的协议。
- 按照步骤 2.9 清洁样品。将 mRNA 在 50 μL 的无核糖水中排出。
- 将样品储存在-80°C（停止点）或继续碱性碎片化。
6. RNA-seq样品碱性碎片化
- 准备碱性水解缓冲（混合 220 μL 0.1 M NaHCO3， 30 μL 的 0.1 M Na2CO3 和 1μL 的 0.5 M EDTA）.将 1 卷 （50 μL） 碱性缓冲器与 1 卷 （50 μL） 样本混合，在 95 °C 孵化 25 分钟。
- 添加 5 μL 的 3 M NaOAc pH 5.5 以阻止反应。
- 按照步骤 2.9 清洁样品，并在 80 μL 的无核糖水中清除样品。
- 可能的停止点：将RNA-seq样品存储在-80°C。 但是，我们建议直接进入第 7 步，以避免不必要的冻结和解冻。
7. RNA-和RIBO-seq样品的脱磷和磷化
- 在每个样品中加入 10μL 的 10 倍反应缓冲器 PNK 和 5 μL T4 PNK。在37°C孵育1.5小时，以去磷酸化3'结束。
- 加入3微升的1m ATP，在37°C孵育1小时，以磷酸化5'结束。
- 清洁样品，如步骤2.9，在30微l无核糖水。
- 将样品存放在-80°C.停止点。
8. 图书馆准备使用NEBNext多路复用小RNA图书馆准备集为照明
- 在 6 μL 无核糖水中准备 100-1000 ng 的输入 RNA（获得 mRNA 片段和核糖体脚印），并添加 1 μL 的 3' SR 适配器。根据制造商的协议孵化。
- 添加 10 μL 的 3' 液化反应缓冲器 （2X） 和 3 μL 的 3' 脂酶混合，在 37 °C 下孵育 2.5 小时，而不是制造商协议规定在 25 °C 处 1 小时。
- 根据制造商的协议，使用修改后的程序混合反向转录引言：75 °C 5 分钟，30 分钟 37 °C，4 °C 保持。
- 利盖特5'SR适配器。按照制造商的协议进行一个更改：在 37 °C 下进行 2.5 小时的孵化，而不是在 25 °C 时执行 1 小时。
- 根据制造商的协议执行反向转录。
- 可能的停止点：在 70 °C 下孵育含有合成 cDNAs 的样品 15 分钟，以激活反向转录酶并将其存储在 -80 °C。 但是，我们建议直接进入后续步骤，以避免不必要的样品冻结和解冻。
- 将每个 cDNA 库的一半存储在 -80 °C 作为备份。
- 根据制造商的协议执行 PCR 放大。使用一半的反应组合。将已获得的库存储在-80°C停止点。
9. 使用 PAGE 对 cDNA 库进行大小选择
- 准备 6% 多丙烯酰胺-TBE 凝胶，并将其放置在带 TBE 缓冲器的罐中。在200 V的恒定电压下预运行至少10分钟。
- 将样品与凝胶加载染料（蓝色 （6X） 混合，并将它们加载到凝胶上。使用快速加载 pBR322 DNA-MspI 文摘作为梯子。在开始时，以120 V的恒定电压运行电泳，使DNA进入凝胶，然后将电压更改为180 V。
- 电泳完成后，将凝胶在 SYBR 金浴中染色约 2-3 分钟，用无核糖水冲洗凝胶。
- 含有库的凝胶片段。对于RNA-seq样本，在135-180 nt之间消费税，在135-170 nt之间为RIBO-seq。使用无菌针头或剃须刀刀片，将切除的凝胶碎片放在单独的 1.5 mL 反应管中。请记住在样品之间更换针头或剃须刀刀片。
注：来自NEBNext多路复用小RNA库准备集的适配器和条形码总共有119 nt，这决定了较低的切除截止。 - 在每个切除的凝胶碎片中加入 100 μL 的无核糖水。
- 在 10 °C、450 RPM 的热混合器中隔夜孵化凝胶碎片。
- 根据制造商的协议，用商业DNA清理套件清洁和浓缩 cDNA 库。
注：我们建议使用 Zymo DNA 清洁和浓缩 -5 套件（参见材料表）。 - 将纯化的 cDNA 库存储在 -80 °C 停止点。
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Representative Results
这里提出的示范性结果是在一项研究WT 杆菌亚蒂利细胞 的孢子细胞的翻译规则的研究中取得的。隔夜培养物被稀释到600 OD 600 等于 0.1 在 100 mL 的丰富中等和孵育在 37 °C 与剧烈摇晃，直到 OD600 达到 0.5-0.6。然后，丰富的介质被最少的介质取代，以诱导孢子过程，潜伏持续了长达四个小时。从 T0 开始每小时采集一次细胞 - 旋转感应 - 导致五个时间点。收获前一分钟，按照上述协议，用氯霉素处理培养物。细胞通过过滤在预热玻璃过滤系统中使用0.45μm混合纤维素酯膜（MCE）过滤器收集，并在液氮中闪光冻结。
赖苏中获得的核糖核酸量取决于生长条件、培养量和密度。按照我们的协议，100mL的细菌培养（杆菌亚提利）平均产生1-4毫克RNA。从上述实验中获得的利萨特示例见表1。
| RNA 浓度 [ng/μL] | RNA量[毫克] | A260/A280 | A260/A230 | |
| WT0 | 5845 | 3.21 | 1.57 | 0.83 |
| WT1 | 6275 | 3.45 | 1.58 | 0.79 |
| WT2 | 3525 | 1.94 | 1.38 | 0.56 |
| WT3 | 3717 | 2.04 | 1.37 | 0.61 |
| WT4 | 1653 | 0.91 | 1.11 | 0.43 |
表1。 B. 亚蒂利斯利 萨特代表性样品中的RNA浓度和量。 该表包括在孢子感应 （0） 和 1 小时 （1）、 2 （2）、 3 （3） 或 4 （4） 小时孢子感应后收获的野生类型 B. subtilis 的样本。用含有氯霉素的550μL裂解缓冲器进行裂解。可以注意到，随着孢子的进行，获得的RNA量会减少。
当RNA量低于1毫克时，0.25毫克RNA用于RIBO-seq，而不是1-0.5毫克，然后分别调整MNase量。核糖消化后的代表性RNA量和浓度显示在 表2中。消化和清洁后RNA的平均量为50微克，从0.5毫克的RNA输入。
| RNA 浓度 [ng/μL] | RNA 量 [μg] | A260/A280 | A260/A230 | |
| WT0-R | 1015 | 50.75 | 2.12 | 1.84 |
| WT1-R | 1157.4 | 57.87 | 2.10 | 2.19 |
| 瓦特2-R | 847.2 | 42.36 | 2.10 | 2.00 |
| WT3-R | 983.6 | 49.18 | 2.09 | 2.16 |
| WT4-R | 206 | 10.30 | 2.13 | 1.00 |
表2。核苷酸消化RIBO-seq代表性样品后RNA的量和浓度。 该表包括从野生类型 （WT） B. 亚蒂利斯 的样本，这些亚提利在孢子感应 （0） 和 1 小时 （1） 、2 （2）、3 （3） 或 4 （4） 小时后在孢子感应后收获：字母"R"是指RIBO-seq的样本。由于WT4-R样本的RNA浓度较低，因此消化了0.25毫克RNA，而剩余样品的0.5毫克RNA用于核糖体足迹生成。用于消化的MNase在WT4-R中为178.125 U，在WT4-R中为0.25毫克RNA，在其他样品中为356.25 U，用于0.5毫克RNA。消化后，用商用RNA清理套件清洗样品，用纳米滴测量核糖核酸浓度。
MNase 消化后，在 PAGE 的帮助下进行大小选择。图 3显示了一个15%的TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶与消化样本的例子。26 至 32 nt 之间的凝胶碎片用无菌剃须刀刀片切除，并在夜间孵化缓冲区过夜孵化。第二天，用商业RNA清理套件清理了核糖核糖体脚印。
图3。15% TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶与具有代表性的样品后，MNase 消化。 该图包括在孢子感应 （0） 和 1 小时 （1）、 2 （2）、 3 （3） 或 4 （4） 小时孢子感应后收获的野生类型 （WT） B. 亚提利 的样本：字母"R"是指RIBO-seq的样本。15 μL 的变性样品按顺序加载到凝胶井中：WT2-R、WT3-R、WT4-R、WT0-R、WT1-R，其余体积存储在 -80 °C 作为备份。29 nt寡核苷酸和26 nt和32 nt寡核苷酸的混合物被用作标记。电泳如上所述，凝胶在SYBR金浴中沾染。 请单击此处查看此图的较大版本。
与核酶消化平行，用商用RNA清理套件清洗RNA-seq的lysates，用纳米滴测量RNA获得的浓度。代表性的结果见 表3。清洁后，核糖核酸的含量降至40-500微克。
| RNA 浓度 [ng/μL] | RNA 量 [μg] | A260/A280 | A260/A230 | |
| WT0-m | 10274.1 | 513.70 | 2.14 | 2.35 |
| WT1-m | 10118.3 | 505.92 | 2.12 | 2.33 |
| WT2-m | 5599.7 | 279.98 | 2.15 | 2.29 |
| WT3-m | 6562.2 | 328.11 | 2.08 | 2.31 |
| WT4-m | 757 | 37.85 | 2.01 | 1.95 |
表3。RNA纯化后RNA-seq样品的RNA量和浓度。 该表包括从野生类型 （WT） B. 亚蒂利斯 的样本，这些亚提利在孢子感应 （0） 和 1 小时 （1） 、2 （2）、3 （3） 或 4 （4） 小时后在孢子感应后收获：字母"m"是指RNA-seq（mRNA）的样本。
获得RNA-seq样本的RNA浓度用于定义RNA消耗的输入。根据制造商的协议，每个RNA-seq样品中的8微克RNA与MICROBExpress细菌mRNA净化试剂盒（见 材料表）一起使用，然后用商用RNA清理套件进行清洗。rRNA耗竭的代表性结果显示在 表4中。
| RNA 浓度 [ng/μL] | A260/A280 | A260/A230 | RNA 量 [μg] | |
| WT0-m | 62.7 | 1.99 | 1.75 | 3.1 |
| WT1-m | 59.3 | 2.00 | 2.16 | 2.9 |
| WT2-m | 93.7 | 1.97 | 1.69 | 4.7 |
| WT3-m | 68.3 | 1.99 | 2.33 | 3.4 |
| WT4-m | 85.0 | 1.97 | 2.00 | 4.2 |
表4。rRNA耗竭后具有代表性的RNA量和浓度。 该表包括从野生类型 （WT） B. 亚蒂利斯 的样本，这些亚提利在孢子感应 （0） 和 1 小时 （1） 、2 （2）、3 （3） 或 4 （4） 小时后在孢子感应后收获：字母"m"是指RNA-seq的样本。8 μg 的 RNA 来自 RNA-seq 的样品，用于 rRNA 耗竭，并在之后使用商业 RNA 清理套件进行清洁。
接下来，获得的 mRNA 被碱性水解分片，并按协议中描述的商业套件进行清洁。根据上述协议，碎片的 mRNA 和核糖体脚印在 3' 端脱磷，在 5' 端脱磷。然后，这些样本用于构建 CDNA 库，用于照明测序，如协议所述。 图4 显示了一个6%的多丙烯酰胺凝胶与获得库的例子。RNA-seq 的凝胶碎片范围为 135-180 nt，RIBO-seq 的凝胶碎片为 135-170 nt，用无菌剃须刀叶片切除，并在无核糖水中一夜之间孵育。图书馆用商业DNA清理包进行清理，使用安捷伦2100生物分析仪对片上高灵敏度DNA电泳进行质量和数量评估。
图4。6% cDNA 库的聚丙烯酰胺凝胶在大小选择前后。 快速加载 pBR322 DNA-MspI 文摘用作梯子。25 μL 的样品按以下顺序加载到凝胶中：三个 RIBO-seq 库和六个 RNA-seq 库。剩余的样品量储存在-80°C作为备份。该图包括从野生类型（WT）B.亚蒂利斯采集的样本，这些 亚提提斯在 孢子感应后一小时（1）、2（2）、3（3）或4（4）小时收获：字母"R"是指RIBO-seq的样品，字母"m"是指RNA-seq的样本。 请单击此处查看此图的较大版本。
从安捷伦2100生物分析仪获得的虚拟凝胶图像和电图示例见 图5。与代表 RNA-seq 库的频段和峰值相比，代表 RIBO-seq 库的波段和峰值更窄、定义更好。根据片上电泳，库长约150 bp，这是一个预期的库大小。库准备中使用的适配器和条形码为 119 nt 长，插入物为 29-30 nt 长（用于 RIBO-seq），或在 25 至 50 nt（RNA-seq）之间。从 RIBO-seq 库获得的接近 200 bp 的额外峰值可能表示在生物信息分析过程中可以丢弃的 PCR 人工制品，当从测序中获得的数据被修剪并过滤 rRNA/tRNA 时。DNA的平均数量为32 ng，为下一代测序提供了足够的材料量。
图5。来自高灵敏度DNA片上电泳的电球图和虚拟凝胶图像的例子。 该图包括在孢子感应 （0） 和 1 小时 （1）、 2 （2）、 3 （3） 或 4 （4） 小时孢子感应后收获的野生类型 （WT） B. 亚提利 的样本：字母"R"是指RIBO-seq库，字母"m"是指RNA-seq库。 请单击此处查看此图的较大版本。
经过芯片上电泳的质量控制后，图书馆被汇集到 Illumina 的下一个 Seq500 平台上进行单端 50 bp 测序（每个通道 10 个库，每个通道至少 350 毫升读数）。RNA-seq 库的每个样本测序产生 3000 万至 5700 万读数，RIBO-seq 库每个样本产生 3000-5000 万读数。修剪适配器和质量差的序列导致 RNA-seq 样品每个样本读数为 24-47 毫升，RIBO-seq 样本每个样本读数为 25-50 毫升。与STAR44一起进行的映射，为RNA-seq样本每个样本产生了240万至960万个唯一映射读数（占读数总数的8-16.8%）和230-1040万个唯一映射读数（7.7-22.1%）用于里博-塞克样品。获得的数据是质量控制检查与快速QC45。FastQC 为修剪序列制作的质量图示示见图 6中。兴趣长度的序列，这是<32 nt为RIBO-seq和<50 nt为RNA-seq，提出了非常好的质量。GC 内容的情节和序列长度分布在所有修剪序列的示例显示在图 7中。RIBO-seq库GC分布图中72%的额外峰值可能表明rRNA污染，在通过rRNA过滤46、47、48进行生物信息分析时，rRNA污染可以消除。RIBO-seq 库的序列长度分布非常狭窄，峰值为 26-27 nt，而 RNA-seq 库的序列长度分布较宽，范围在 15 至 50 nt 之间。
图6。RIBO-seq 和 RNA-seq 库修剪后，所有基础的盒装和胡须图的质量分数示例。 该图包括从野生类型 （WT） B. 亚蒂利斯 的样本，这些亚提利是在孢子感应 （0） 之前收获的，在孢子感应后 4 （4） 小时：字母"R"指RIBO-seq样品，字母"m"指RNA-seq样本。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7。修剪后，RIBO-seq 和 RNA-seq 库的所有序列的 GC 内容图和序列长度分布示例。 图为野生类型 （WT）B.亚提利的样本，这些亚提利 在喷发感应后4小时收获：字母"R"是指RIBO-seq的样本，字母"m"是指RNA-seq的样本。 请单击此处查看此图的较大版本。
为了验证RIBO-seq数据是否提供了关于真实核骨足迹的信息，而不是所选长度的随机mRNA片段，我们比较了来自RIBO-seq和RNA-seq的测序数据，RiboToolkit是RIBO-seq数据分析49的一个网络服务器。Ribo-seq 数据表现出三倍周期和高大狭窄的峰值，与 8A 图中显示的 RF 的启动核糖体和特征相对应，这在 RNA-seq 数据（图 8B）中未显示。此外，显示编码序列 （CDS） 中射频和 mRNA 片段平均覆盖范围的元数据图图图显示，与预期一样，在 RIBO-seq 数据集（图 8C）中映射到 CDS 的读数比例较高。
图8。元周期图和CDS上RF和mRNA片段的平均覆盖范围。 元数据配置文件是获得与里博图尔基特，一个集成的网络服务器49。CDS 长度标准化为 1 值，每个 CDS 被分成 100 个相等的箱。图为野生类型 （WT）B.亚提利的样本，这些亚提利在 孢子感应后收获了1（1）小时：字母"R"是指RIBO-seq的样本，字母"m"是指RNA-seq的样本。 请单击此处查看此图的较大版本。
为了比较此处介绍的 RIBO-seq 协议是否产生的结果与标准 RF 恢复方法（蔗糖梯度超中心化）获得的结果相似，我们将以下两种方法编写的库的测序结果平行。研究WT B.亚提利 在孢子层分离期间的翻译调节的实验是根据所提出的RIBO-seq协议进行的，并遵循标准协议，其中包括蔗糖梯度超中心化的单体恢复。从这两个实验中获得的核糖体覆盖剖面图的结果显示在 图9中。映射 RF 的可视化在两个实验之间非常相似，并在生物信息分析中得出了类似的结果。
图9。获得的射频映射到基因组上的可视化。 该图包括从野生 B 型 亚提利斯 收获的 RF，在喷发感应后 4 小时收获，并根据标准协议（WT4-R-s、上面板）或所呈现的协议（WT4-R，下面板）进行准备。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
核糖体分析的关键技术挑战是需要快速抑制翻译，以便在特定的生理兴趣状态下捕获 mRNA 上的核糖体快照。为此，通常使用液氮中的转化抑制剂、快速收获和闪光冷冻。使用抗生素是可选的，因为它们会导致人工制品。氯霉素是一种常用的药物，用于抑制细菌RIBO-seq中拉长的核糖体。然而，它并不阻止启动，导致核糖体的积累约6个科顿下游的翻译启动网站14。此外，其抑制肽转移酶反应的能力可能取决于核糖体P-和A部位基材的性质。据推测，CAM逮捕核糖体更有效地与格利，阿拉，塞尔，赛斯，或Thr作为倒数第二个氨基酸的新生肽17，38，50。在实验设计和生物信息分析中，特别是在研究核糖核糖暂停17时，值得考虑。CAM也已被证明通过促进停止科顿读取和帧转换51影响转化精度。尽管如此，CAM抑制是相对快速和足够的典型的RIBO-seq研究14，并没有诱发误入51。抗生素引起的一些文物可以通过增加药物量9来避免。在我们的协议中应用的CAM浓度是RIBO-seq实验7、14、21中使用的典型量，但是，不同微生物的浓度可能有所不同，在采样前应进行优化。由于应用翻译抑制剂可能导致文物的发生，建议在研究问题没有必要时避免使用抑制剂治疗，如果可能快速收获的话。快速细胞收集是至关重要的，特别是如果它执行没有抑制剂治疗，因为长时间收获可能导致多体和/或改变的转子，作为对不断变化的环境条件的反应14。因此，我们建议使用过滤作为收获方法，因为它可以在与培养增长相同或相似的条件下进行，包括温度和/或摇晃。在过滤表面收集的过滤细胞不断与生长介质冲洗，阻碍他们从感应转移的细胞密度，氧合和氨基酸和其他营养物质的水平14。过滤更温和，可能比离心快，如果培养的密度适中，否则大量的细胞可以堵塞过滤毛孔并减慢过程。如果有长期过滤的可能，我们建议对培养物进行氯霉素预处理，从而导致翻译逮捕，并允许延长收获时间。如果由于过滤器堵塞而难以完成过滤，我们建议停止过滤，去除过滤器上收集的培养的多余培养和闪光冻结分数。我们观察到，50mL的密集细菌培养足以执行RIBO-seq。随后液氮细胞的闪光冻结是立即停止翻译8，21，52的最普遍和有效的方法。
核糖核糖体消化是获得优质射频的关键步骤。选择正确的酶很重要，因为核糖最初，RNase I用于消化真核生物1中的mRNA和射频生成。由于这种酶似乎在细菌中不活跃，它被从金黄色葡萄球菌21微细胞核糖（MNase）所取代。后来发现，RNAse I实际上可以进行细菌样本的消化，然而MNase仍然常用于此目的53。MNase 的缺点在于其催化活性的序列偏差，即接近 A 或 T 的 30 倍，导致 80% 的 mRNA 片段从 A 或 T 开始，在 5+ 端14。然而，这已被克服的观察，大部分长度的变化发生在RF的5+端，并分配核糖体密度到3+端产生准确和准确的信息，关于核糖体位置7。MNase 活性受酶浓度、pH 和消化时间的影响，应确定每个新的 MNase 批次。核糖体活性增加会导致 rRNA 污染增加，而活动减少会导致核骨足迹的不准确。这可能会降低RF在大小选择性凝胶净化过程中的整体产量，并提供不太准确的信息，在mRNA14的核糖体位置。因此，应仔细确定所需的 MNase 量。在我们的实验中，我们应用了每1毫克RNA712.5U的微可核糖，而文献中报告的浓度在50 U38、450U 34、1000 U14和1500 U15、21、36/1毫克RNA之间变化。如上所述，MNase 的活动需要存在钙离子。在标准协议EGTA中，二价离子的溷合剂，与镁54相比，对钙的亲和力更高，用于通过结合钙和灭活MNase来阻止消化。然而，在我们的协议中，消化反应通过使用RNA清洁套件直接停止后，孵化与核酸。
在标准协议中，下一步是通过蔗糖垫超集中或蔗糖梯度超中心化8，14恢复核糖体。蔗糖梯度离心使单体与亚单位和多体有选择地分离，但它需要特定设备，如梯度搅拌机和超中心燃料。此外，此方法的吞吐量仅限于 500-700 μL 的利萨特。另一方面，蔗糖垫超集中式颗粒大多数核糖核酸颗粒，能够处理十几毫升的裂解物，在所需的仪器方面要求较低。然而，这两种方法都很长，因为它们至少需要4至6.5小时14，需要超中心。在我们的协议中，当我们直接在 15% TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶中进行大小选择时，省略了这一步骤。电泳是在变性条件下进行的，以展开RNA的次要结构并防止分子内部相互作用。我们使用 26 nt、29 nt 和 32 nt 寡核苷酸作为去除狭窄范围的核糖体足迹的标记。我们假设实际射频的浓度大大超过潜在的污染与假射频被认为是随机的，不受该范围内的核糖体mRNA或rRNA长度片段的保护。使用我们的协议获得的结果确实显示了在选定的大小范围内 RF 的丰富分数。与安捷伦 2100 生物分析仪的质量检查显示 RIBO-seq 库为单一的，定义良好的波段和峰值，与 RNA-seq 库形成鲜明对比，后者可视化为显著更宽的涂片和峰值（图 5）。此外，获得的Ribo-seq数据表现出三倍周期（图8A），这在RNA-seq数据（图8B）中没有观察到。此外，无论我们的生物信息学分析（图9）进一步确认的足迹隔离方法如何，绘制在基因组上的获得射频的可视化显示非常相似的表达模式。不过，我们知道，虚假的射频可以绘制出可能干扰获得信号的基因组图谱。然而，假RF是随机生成的事实意味着它们不应该累积到基因组上的一个地方，因此，不应该导致人工制品和虚假结果。此外，必须指出，细菌研究中对于应分离出53、55的射频大小没有共识，只选择长度范围的子折射可能导致对结果的曲解。研究表明，细菌足迹的宽长度特征是亲核糖体行为的结果，而不是MNase消化55的结果。例如，16S rRNA在小核糖核子单位中的3+端和mRNA中的闪亮-达尔加诺图案之间的互补相互作用可能导致更长的RF56。考虑到细菌足迹的范围很广，穆罕默德等人。建议执行大小选择之间15和40 nt17，55。这应导致可能的整个射频范围的隔离，并确保在转化周期的不同阶段获得核糖体的全面表示。由于正在进行的讨论，切口范围应仔细考虑，重要的是要记住，错误的选择可能会排除射频的某些子字幕，并导致在随后的分析中出现偏差。
由于核糖消化后直接进行的大小选择，以及通过超集中式蒸发省略单体隔离，我们的协议是快速的，相对容易的，可以用标准的实验室设备进行。使用专用工具包清洁RNA和DNA，mRNA的纯化和库制备确保标准化和可重复性。在RNA清洁过程中增加乙醇的使用量，可以提高<200 ntRNA片段57的净化效率。对库制备的修改 - 延长孵化时间和在适配器配对期间增加温度 - 用于降低甲基化RNA（如 rRNA）的连接效率，并减少 rRNA 污染58。我们的协议已用于调查各种生长条件下的翻译法规（正在编写的出版物），但可用于研究翻译的其他方面，如TIS检测或改善基因组注释和协助蛋白质组学研究。根据研究问题，可以很容易地包括对协议的进一步修改，例如将核糖体与感兴趣的蛋白质交叉连接，或将感兴趣的核糖体的亲和力纯化，从而产生丰富的核糖体分数。根据我们的协议，RIBO-seq程序更容易为科学家所接受，因此，可能会刺激新的发现，加速该领域的发展。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
ALS 感谢 EMBO 安装赠款 IG 3914 和 POIR 的财政支持。04.04.00-00-3E9C/17-00 在欧洲联盟根据欧洲区域发展基金共同资助的波兰科学基金会第一小组方案内进行。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X TBE (powder) | Invitrogen | AM9864 | |
| 2-Mercaptoethanol, 99%, pure | Acros Organics | 125472500 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
| Aluminium oxide calcinated pure p.a. | Chempur | 114560600 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881-500G | |
| Chloramphenicol | MP Biomedicals | 190321 | |
| DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4004 | |
| Dnase I recombinant, Rnase-free | Roche | 4716728001 | |
| EDTA disodium salt | Fisher Scientific | E/P140/48 | |
| Ethyl Alcohol Absolut 99,8% Pure-P.A.-Basic | POCH Avantor Performance Materials Poland S.A | BA6480111 | |
| Filtration apparatus | VWR Collection | 511-0265 | all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask |
| Gel 40 (19:1) | Rotiphorese | 3030.1 | |
| Gel Loading Dye, Blue, 6X | New England Biolabs | E6138G | |
| Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G0635-25MG | |
| labZAP | A&A Biotechnology | 040-500 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| MCE membrane fiter | Alfatec Technology | M47MCE45GWS | pore size: 0.45um |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Purification | Invitrogen | AM1905 | |
| Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina | New England Biolabs | E7300S | |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9937 | |
| Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A. | POCH Avantor Performance Materials Poland S.A | 744330113 | |
| Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | E7323A | |
| RNA Clean & Concentrator -25 | Zymo Research | R1018 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250G | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | 223530-500G | |
| Sodium hydrogen carbonate pure p.a. | POCH Avantor Performance Materials Poland S.A | 810530115 | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Life Technologies | S11494 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0201S | |
| TBE-Urea Sample Buffer (2x) | Invitrogen | LC6876 | |
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9% | AlfaAesar | J65594 | |
| Triton X-100, 98% | Acros Organics | 327371000 | |
| Urea G.R. | lach:ner | 40096-AP0 |
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