Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

RIBO-seq i bakterier: en prøvesamling og biblioteksforberedelsesprotokol til NGS-sekventering

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62544
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2, 1,2
1Laboratory of Gene Expression, ECOTECH-Complex, Maria Curie-Sklodowska University, 2Department of Molecular Biology, Institute of Biological Sciences, Maria Curie-Sklodowska University, 3Faculty of Information Technology, Polish-Japanese Academy of Information Technology

Summary

Her beskriver vi stadierne i prøveindsamling og forberedelse til RIBO-seq i bakterier. Rækkefølgen af de biblioteker, der er udarbejdet i henhold til disse retningslinjer, resulterer i tilstrækkelige data til omfattende bioinformatikanalyse. Den protokol, vi præsenterer, er enkel, bruger standardlaboratorieudstyr og tager syv dage fra lysis til at få biblioteker.

Abstract

Ribosome-profileringsteknikken (RIBO-seq) er i øjeblikket det mest effektive værktøj til at studere processen med proteinsyntese in vivo. Fordelen ved denne metode, i forhold til andre tilgange, er dens evne til at overvåge oversættelse ved præcist at kortlægge placeringen og antallet af ribosomer på en mRNA-udskrift.

I denne artikel beskriver vi de efterfølgende stadier af prøveindsamling og forberedelse til RIBO-seq-metoden i bakterier og fremhæver de detaljer, der er relevante for planlægningen og udførelsen af eksperimentet.

Da RIBO-seq er afhængig af intakte ribosomer og relaterede mRNA'er, er det vigtigste trin hurtig hæmning af oversættelse og tilstrækkelig opløsning af celler. Således foreslår vi filtrering og flash-frysning i flydende nitrogen til cellehøst med en valgfri forbehandling med chloramphenicol for at arrestere oversættelse i bakterier. Til opløsning foreslår vi slibning af frosne celler med mørtel og støder i nærværelse af aluminiumoxid for mekanisk at forstyrre cellevæggen. I denne protokol kræves der ikke saccharosepude eller en saccharosegradient ultracentrifugering til monosomerensning. I stedet anvendes mRNA-adskillelse ved hjælp af polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) efterfulgt af ribosomal fodaftryk excision (28-30 nt bånd) og giver tilfredsstillende resultater. Dette forenkler i vid udstrækning metoden samt reducerer tids- og udstyrskravene til proceduren. Til biblioteksforberedelse anbefaler vi at bruge det kommercielt tilgængelige lille RNA-sæt til Illumina-sekventering fra New England Biolabs efter producentens retningslinjer med en vis grad af optimering.

De resulterende cDNA-biblioteker præsenterer passende mængde og kvalitet, der kræves til næste generations sekventering (NGS). Sekvensering af biblioteker udarbejdet i henhold til den beskrevne protokol resulterer i 2 til 10 mln entydigt kortlagt læser per prøve giver tilstrækkelige data til omfattende bioinformatik analyse. Den protokol, vi præsenterer, er hurtig og relativt nem og kan udføres med standardlaboratorieudstyr.

Introduction

Den ribosome profilering teknik (RIBO-seq) blev udviklet i laboratoriet af Jonathan Weissman ved University of California, San Francisco1. I forhold til andre metoder, der anvendes til at studere genekspression på oversættelsesniveau, fokuserer RIBO-seq på hver ribosombinding til mRNA og giver information om dets placering og det relative antal ribosomer på en udskrift. Det gør det muligt at overvåge processen med proteinsyntese in vivo og kan give enkelt codonopløsning og nøjagtighed, der gør det muligt at måle ribosomtætheden på begge, det enkelte mRNA og langs hele transskriptomet i cellen. Ved grundlæggelsen af RIBO-seq teknikken ligger det faktum, at ribosomet under oversættelsen binder mRNA-molekylet og dermed beskytter det begravede fragment af transskriptionen mod en ribonukleas fordøjelse. Ved tilsætning af ribonuklease fordøjes det ubeskyttede mRNA, og fragmenterne omgivet af ribosomer - typisk på ~ 28-30 nt lange - forbliver intakte. Disse fragmenter, kaldet ribosomale fodspor (RF), kan derefter isoleres, sekventeres og kortlægges på udskriften, de stammer fra, hvilket resulterer i påvisning af ribosomernes nøjagtige position. Faktisk har ribosome evne til at beskytte mRNA fragmenter blevet brugt siden 1960'erne til at studere ribosomal bindende og oversættelse indledning sites (TIS)2,3,4. Men med avancement i dyb sekventering teknologi, RIBO-seq er blevet en guldstandard for oversættelse overvågning5, som gennem ribosome engagement, kan give et genom-dækkende oplysninger om proteinsyntese6. Ribosome profilering fyldte den teknologiske kløft, der eksisterede mellem at kvantificere transskriptionen og proteome6.

For at udføre ribosome profilering er vi nødt til at få celle lysat af organismen, der var vokset under de undersøgte forhold. Afbrydelse af disse tilstande under celleindsamling og lysis kan give upålidelige data. For at forhindre dette anvendes oversættelseshæmmere, hurtig høst og flashfrysning i flydende nitrogen. Celler kan lyses ved kryogen slibning i en mekanisk homogenisator som en mixermølle7,8 eller en perlebanker9og ved triturering gennem en pipette10 eller med en nål11. Lysisbufferen kan tilføjes lige før eller kort efter pulverisering af cellerne. I vores protokol bruger vi flydende nitrogen til at forkøle mørtel og støder på støder på aluminiumoxid som en blidere tilgang til forstyrrelse af bakteriecellevæggen, hvilket forhindrer RNA-klipning, der ofte opstår, når metoder som sonificering anvendes. Efter pulverisering tilføjer vi en iskold lysisbuffer i mørtelens afkølede indhold. Valg af en passende lysis buffer er vigtig for at opnå den bedste opløsning af ribosomale fodspor. Da ionisk styrke påvirker både RF-størrelsen og læserammens præcision, anbefales det i øjeblikket at bruge lysis buffere med lav ionisk styrke og bufferkapacitet, selvom det ser ud til, at buffersammensætningen ikke påvirker ribosomal belægning påmRNA'er 11,12. Vigtige komponenter i lysis bufferen er magnesiumioner, hvis tilstedeværelse forhindrer dissociation af ribosomale underenheder og hæmmer spontane kropsbygningsændringer i bakterielle ribosomer11,13. Calciumioner spiller også en væsentlig rolle og er afgørende for aktiviteten af mikrokokkerner (MNase), der anvendes i den bakterielle ribosome profilering metode14. Tilsætning af guanosin 5′-[β,γ-imido]triphosphat (GMP-PNP), en ikke-hydrolyserbar analog af GTP, sammen med chloramphenicol hæmmer oversættelse under lysis15.

Når lysatet opnås, afklares det ved centrifugering og opdeles i to portioner, hver for en RIBO-seq og en høj gennemløbssum mRNA-sekventering (RNA-sekt), da de udføres samtidigt (Figur 1). RNA-seq er et referencepunkt, der gør det muligt at sammenligne data fra både RIBO-seq og RNA-seq under dataanalyse. Den undersøgte oversættelse defineres ved normalisering af ribosomale fodspor til mRNA-overflod16. Data fra RNA-seq kan også hjælpe med at identificere kloning eller sekventering af artefakter17.

Figure 1
Figur 1. Skemaer over mRNA-prøveforberedelse til RIBO-seq og RNA-seq. For RIBO-seq bibliotek forberedelse, er RNA fordøjet med MNase (A), efterfulgt af størrelsen udvælgelse af RF på ~ 28-30 nt længde (B); for RNA-seq RNA er isoleret (C), udtømt af rRNA (D), og den resulterende mRNA er tilfældigt fragmenteret i fragmenter af varierende længde (E). Klik her for at se en større version af dette tal.

De første trin i proceduren for prøveforberedelse til RIBO-seq og RNA-seq varierer en smule (figur 1). Til ribosomal profilering skal lysatet fordøjes af en bestemt endonuklease for at nedbryde de mRNA-molekyler, der ikke er beskyttet af ribosomerne. I standardprotokoller genvindes de opnåede monosomer ved hjælp af en saccharosepude ultracentrifugering eller en saccharosegradient ultracentrifugering8,14. I denne artikel viser vi, at dette trin ikke er nødvendigt for at isolere RF, der kræves til RIBO-seq i bakterier, ligeledes for eukaryote celler18, og at størrelsesvalg af passende længde mRNA-fragmenter fra polyacrylamidgelen er tilstrækkelig.

For RNA-seq opnås mRNA ved udtømning af rRNA fra de samlede RNA - rRNA-molekyler hybridiseres til de biotinylerede oligonukleotidsondesonder, der binder sig til de strøede magnetiske perler. RRNA-oligonukleotidperleotidperle komplekserne fjernes derefter fra prøven med en magnet , hvilket resulterer i en rRNA-udtømt prøve19,20. De rensede mRNA molekyler er derefter tilfældigt fragmenteret af alkalisk hydrolyse. De opnåede fragmenter af mRNA samt ribosomale fodspor omdannes til cDNA-biblioteker og forberedes til dyb sekventering (Figur 2). Dette indebærer, at der er behov for reparation efter alkalisk hydrolyse (for mRNA) og enzymatisk fordøjelse (for RF): dephosphorylering af 3' ender efterfulgt af fosforylering af 5' ender. De næste skridt er adaptere ligation og den omvendte transskription til at skabe cDNA skær indrammet af sekvenser, der kræves for den næste generation sekventering (NGS) ved hjælp af Illumina platform. Den sidste fase af biblioteksforberedelsen er en PCR-reaktion, hvor konstruktionerne forstærkes og mærkes med prøvespecifikke stregkoder for at tillade multipleksering og sekventering af forskellige prøver på en kanal. Før sekventering vurderes bibliotekernes kvalitet og kvantitet af den højfølsomme DNA on-chip elektroforese. cDNA-biblioteker med passende parametre kan derefter grupperes og sekventeres. Sekventering kan udføres på forskellige Illumina-platforme, såsom MiSeq, NextSeq eller HighSeq, afhængigt af antallet af biblioteker, krævet læselængde og sekventeringsdybde. Efter sekventering udføres den bioinformatiske analyse.

Figure 2
Figur 2. Biblioteksforberedelse. Biblioteksforberedelse omfatter enderne reparation, adaptere ligation, omvendt transskribering og forstærkning med stregkoder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Ribosome-profilering er en universel metode, der let kan ændres og justeres i henhold til det videnskabelige spørgsmål. Oprindeligt blev det brugt i gær1, men kort efter blev det anvendt på bakterieceller21 samt eukaryote model organismer, herunder mus10, zebrafisk22, frugt flyve23 og Arabidopsis thaliana24. Det blev også brugt til at studere forskellige ribosomtyper: cytoplasmisk, mitokondrie25,26 og chloroplast27,28. I eukaryoter tilpasses og raffineres RIBO-seq almindeligvis til at undersøge specifikke aspekter af oversættelse, herunder indledning10,11,29,30,31,32, forlængelse1,10,11,31,33, ribosome stalling33 og kropsbygningsændring33. De fleste af ændringerne indebærer brug af forskellige oversættelseshæmmere. I bakterier har analoge undersøgelser imidlertid været vanskelige at gennemføre på grund af mangel på hæmmere med den krævede virkningsmekanisme34. Den mest anvendte oversættelseshæmmer i bakterier er chloramphenicol (CAM), som binder sig til peptidyl transferase center (PTC) og forhindrer korrekt placering af aminoacyl-tRNA i A-sitet. Som følge heraf forhindrer CAM dannelsen af en peptidbinding, hvilket fører til at arrestere de aflange ribosomer35. Andre eksempler på oversættelseshæmmere i bakterier er tetracyklin (TET)36, retapamulin (RET)34 og Onc11237, som er blevet brugt til at undersøge oversættelsesindledningssteder. TET, som forhindrer tRNA levering til ribosomet ved direkte overlapning med anticodon stem-loop af tRNA på A-sitet, blev oprindeligt anvendt til at kontrollere resultaterne fra CAM behandling, da de begge er antibiotika hæmmende oversættelse forlængelse38. TET blev fundet at opdage primære TIS, men var ude af stand til at afsløre interne TIS36. RET binder i PTC af bakterielle ribosom, og forhindrer dannelsen af den første peptid obligation ved at forstyrre en langstrakt aminoacyl-tRNA i A site. Anvendelse ret resulterer i ribosomer anholdelse på både primære såvel som interne TISs34. Onc112, en proline-rig antimikrobiel peptid, binder i exit tunnel og blokerer aminoacyl-tRNA binding i ribosomal A site. Som følge heraf forhindrer Onc112 indledningskomplekser i at komme ind i forlængelsesfasen37.

De vigtigste oplysninger ribosome profilering giver, er ribosomer tæthed og deres position på mRNA. Det blev anvendt med succes til at undersøge differentialgenudtryk på oversættelsesniveau under forskellige vækstbetingelser1,6, måle translationel effektivitet1,38,39 og opdage oversættelsesreguleringshændelser som ribosomal pause10. RIBO-seq giver også mulighed for at afdække oversættelsen af kommenterede ncRNA, pseudogener og ikke-kommenterede små åbne læserammer (ORF), der fører til identifikation af nye og / eller meget korte proteinkodningsgener10,12,22,30,37. I sådanne tilfælde kan RIBO-seq finjustere og forbedre genomanmærkning. Ribosome-profilering kan med sin høje følsomhed for identifikation af oversatte ORF'er og dens kvantitative karakter også tjene som en indikator for proteomebestemmelsen eller i støtteproteomics-undersøgelserne31,34,39. Ved kortlægning TIS, ribosome profilering afslører N-terminalt udvidet og afkortet isoformer af kendte proteiner10,32. RIBO-seq blev også tilpasset til at studere samtidig sammenlægning af proteiner14,21,24. Denne metode gør det muligt at måle forlængelseshastigheder1,10,39 eller afkodningshastigheder for de enkelte codoner6 og hjælper med at udvikle kvantitative oversættelsesmodeller17. Den ribosome profilering metode er også i stand til at give mekanistisk indsigt i ribosome pause i bakterier7,15,17, frameshifting40, stop-codon readthrough21, opsigelse / genanvendelse defekter41,42 og ribosomal kropsbygning ændringer33 i eukaryoter. RIBO-seq blev også tilpasset for at undersøge specifikke transvirkende faktorers indvirkning på oversættelse såsom miRNA6 og RNA-bindende proteiner i eukaryoter16,43. Det er dog vigtigt at erkende, at det eksperimentelle design og den opnåede opløsning af RIBO-seq bestemmer mængden af oplysninger, der kan udtrækkes fra de resulterende sekventeringsdata12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Prøveindsamling

  1. Forbered en bakteriekultur. Vi anbefaler et kulturvolumen på 100 mL pr. prøve.
  2. Forbered udstyr og reagenser til prøveopsamling: to scoopulas pr. prøve, sterile 0,45 μm blandede celluloseestere membranfiltre (MCE), 50 ml sterile rør, flydende nitrogen, 50 mg/ml chloramphenicol i 70% (vol/vol) ethanol (valgfrit). Låget på 50 mL rør punkteres, så flydende nitrogen fordampes, og der forhindres eksplosion af lukkede rør. Dekontaminere scoopulas med laboratorievaskemiddel og 70% ethanol.
  3. Prewarm filtreringsudstyret og en af scooplerne til væksttemperaturen i bakteriekulturen.
    BEMÆRK: Vi anbefaler et filtreringsapparat i glas i glas med tragt, fritted base, en bundkolbe og en 47 mm Ø fjederklemme.
  4. Før prøvehøsten tilsættes chloramphenicol i bakteriekulturen til den endelige koncentration på 100 μg/mL og inkuberes 1 minut (valgfrit).
  5. Hæld flydende nitrogen i 50 mL sterilt rør og læg den anden scoopula inde i røret for at køle af.
    forsigtighed! Flydende nitrogen kan få lukkede beholdere til at eksplodere på grund af trykændringen ved fordampning. For at forhindre dette er det nødvendigt at skabe et par huller i låget på 50 mL rør for at tillade flydende nitrogenfordampning.
  6. Indsamle celler ved filtrering. Stop filtreringen, når mediet har passeret membranen, men lad ikke filteret tørre helt.
  7. Opsamle bakteriel pellets ved hurtigt at skrabe cellerne ud af filterskiven ved hjælp af en forvarmet scoopula. Placer straks hele scoopulaen med de høstede celler i 50 mL røret fyldt med flydende nitrogen. Den høstede pellet skal være helt dækket af flydende nitrogen.
  8. Lad pellet fryse grundigt og løsne frosne celler ved hjælp af en tidligere afkølet anden scoopula. Luk det punkterede låg, og overfør røret til -80°C. STOPpunkt
    BEMÆRK: Desinficer scoopulas efter hver prøvehøst.

2. Celle lysis

  1. Forbered 0,1 M GMP-PNP i 10 mM Tris pH 8, DNase I og 1,5 mL reaktionsrør til lysater og hold dem på is. Centrifuge afkøles til 4 °C.
  2. Forbered lysis buffer (20 mM TRIS pH 7,6, 10 mM MgAcet, 150 mM KAcet, 0,4% TRITON X-100, 6 mM β-mercaptoethanol, 5 mM CaCl2 og valgfri 1 mM ampchlorhenicol). 500 μL lysisbuffer pr. prøve til 1,5 mL reaktionsrør og anbringes på is.
  3. Dekontaminere mørtel og støder med et laboratorievaskemiddel og 70% ethanol og tørrer dem. Afkøl mørtel og støder ved at hælde flydende nitrogen i mørtelen.
  4. Overfør frossen pellet i den forkølede mørtel og slib den til et pulver. Med en spatel tilsættes ca. 1 volumen aluminiumoxid og fortsættes slibning. Hold mørtel, støder og celler afkøles ved at hælde flydende nitrogen, når det er nødvendigt, lad ikke indholdet af mørtelen tø op.
  5. Lige før du bruger lysis buffer, tilsættes GMP-PNP og DNase I i lysis buffer aliquot til den endelige koncentration på henholdsvis 2 mM og 100 U/mL. Overfør opløsningen til mørtelen med celler og aluminiumoxid og fortsæt slibning. Lad lysatet tø langsomt op under slibning og overfør blandingen til det forkølede 1,5 mL reaktionsrør og læg straks på is.
  6. Centrifuge lyserer ved 20 000 x g i 5 minutter ved 4 °C. Overfør supernatants til nye, forkølede 1,5 mL reaktionsrør og hold dem på is.
  7. RNA-koncentrationen måles i hver prøve med en NanoDrop. Brug 1:10 fortyndinger af prøver og 1:10 fortynding af lysis buffer i nuklease-fri vand som en blank.
    BEMÆRK: Vær opmærksom på, at chloramphenicol udviser signifikant absorption ved 260 nm.
  8. Opdel hvert lysat i to portioner: en for RIBO-seq (0,5 - 1 mg RNA) og den anden for RNA-seq (resten).
  9. Rengør prøverne for RNA-seq ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt RNA-oprydningssæt i henhold til producentens protokol.
    BEMÆRK: Vi anbefaler, at du bruger Zymo RNA Clean &Koncentrat -25 kit (se Materialeoversigt). Vi anbefaler også, at der tilsættes 4,5 mængder ethanol (sammenlignet med prøvevolumen) til blandingen af prøve og bindingsbuffer til ribosomale fodaftryk og fragmenteret mRNA for at øge rensningseffektiviteten af korte RNA-fragmenter.
  10. Prøverne til RNA-seq opbevares ved -80 °C. Proceduren for RNA-seq vil fortsætte fra trin 5.

3. MNase fordøjelse af prøver til RIBO-seq

  1. Til 1 mg RNA tilsættes 3,8 μL af 187,5 U/μL MNase i 10 mM Tris pH 8 og fyldes op med lysis buffer til det samlede volumen på 500 μL.
  2. Inkuber ved 25 °C, 300 omdrejninger i minuttet i 45 minutter i en termomixer.
  3. Rengør prøverne med et kommercielt tilgængeligt RNA-oprydningssæt (som i trin 2.9).
  4. Prøverne for RIBO-seq opbevares ved -80 °C (STOP-punkt) eller foretages ved valg af størrelse.

4. Polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) og størrelsesvalg af prøver til RIBO-seq

  1. Forbered en 15% polyacrylamide-TBE gel med 8 M urinstof og læg den i en tank med TBE buffer. Forkør i mindst 10 minutter ved en konstant spænding på 200 V.
  2. Prøver blandes med prøvebuffer for TBE-Urea, denatureres ved 95 °C i 1 minut, og de anbringes straks på is.
  3. Urinstofvasken vaskes af ved at indsprøjte TBE-bufferen i gelbrønde ved hjælp af en sprøjte. Lad prøverne efterlade et godt mellemrum mellem dem for at adskille hver prøve og forhindre krydskontaminering. 29 nt oligonukleotid og en blanding af 26 nt og 32 nt oligonukleotider som markører. Kør elektroforese ved en konstant spænding på 180 V.
  4. Forbered steril buffer til inkubation natten over (5 mM EDTA, 10 mM NaOAc pH 5).
  5. Efter elektroforese, plette gelen i en SYBR Gold-bad i ca 2-3 minutter og skyl gelen med nuklease-fri vand.
  6. Punktfragmenter af gel mellem 26 og 32 nt med sterile nåle eller barberblade og læg gelfragmenterne i separate 1,5 mL rør for hver prøve. Skift kanylen eller barberbladet mellem prøverne.
  7. Der tilsættes 200 μL af inkubationsbufferen natten over til hvert reaktionsrør.
  8. Prøverne inkuberes ved 10 °C, 1000 omdr./min. natten over i en termomixer.
  9. Den næste dag skal du rengøre prøverne som i trin 2.9. Elute fodsporene i 80 μL nukleasefrit vand.
  10. Prøverne opbevares ved -80 °C. STOPpunktet. Proceduren for RIBO-seq vil fortsætte fra trin 7.

5. Rensning af bakteriel mRNA ved rRNA-udtømning fra prøver til RNA-seq

  1. Fjern rRNA fra prøver med et bakterielt mRNA-rensesæt (f.eks. Invitrogen MICROBExpress). Følg producentens protokol.
  2. Rengør prøverne som i trin 2.9. Elute mRNA i 50 μL nukleasefrit vand.
  3. Prøverne for RNA-seq opbevares ved -80 °C (STOP-punkt) eller fortsættes med alkalisk fragmentering.

6. Alkalisk fragmentering af prøver til RNA-seq

  1. Der fremstilles alkalisk hydrolysebuffer (bland 220 μL på 0,1 M NaHCO3, 30 μL på 0,1 M Na2CO3 og 1 μL på 0,5 M EDTA). 1 volumen (50 μL) alkalisk buffer blandes med 1 volumen (50 μL) af prøven, og der inkuberes ved 95 °C i 25 minutter.
  2. Der tilsættes 5 μL på 3 M NaOAc pH 5,5 for at stoppe reaktionen.
  3. Prøverne rengøres som i trin 2.9, og prøverne udtages i 80 μL kernefrit vand.
  4. Muligt STOPpunkt: RNA-seq prøver opbevares ved -80 °C. Vi anbefaler dog at gå direkte til trin 7 for at undgå unødvendig frysning og optøning.

7. Affosforylering og fosforylering af prøver til både RNA- og RIBO-seq

  1. Der tilsættes 10 μL 10x reaktionsbuffer PNK og 5 μL T4 PNK til hver prøve. Inkuber ved 37 °C i 1,5 time for at dephosphorylate de 3' ender.
  2. Der tilsættes 3 μL 1 mM ATP og inkuberes ved 37 °C i 1 time for at fosforrylatere de 5' ender.
  3. Prøverne rengøres som i trin 2.9, elute i 30 μL nukleasefrit vand.
  4. Prøverne opbevares ved -80 °C. STOPpunktet.

8. Bibliotek forberedelse ved hjælp af NEBNext Multiplex Lille RNA Bibliotek Prep Set for Illumina

  1. Der fremstilles 100-1000 ng input-RNA (opnåede mRNA-fragmenter og ribosomale fodaftryk) i 6 μL kernefrit vand, og der tilsættes 1 μL 3' SR-adapter. Inkuber i henhold til producentens protokol.
  2. Der tilsættes 10 μL 3' ligationsreaktionsbuffer (2X) og 3 μL 3' ligationsenzymblanding, og der inkuberes ved 37 °C i 2,5 time i stedet for 1 time ved 25 °C, som fabrikantens protokol specificerer.
  3. Den omvendte transskriberingsprimering hybridiseres i henhold til fabrikantens protokol med et ændret program: 5 minutter ved 75 °C, 30 minutter ved 37 °C og hold ved 4 °C.
  4. Ligate den 5 'SR Adapter. Følg fabrikantens protokol med én ændring: Inkubationen udføres ved 37 °C i 2,5 time i stedet for 1 time ved 25 °C.
  5. Udfør omvendt transskribering i henhold til producentens protokol.
  6. Muligt STOPpunkt: Inkuber prøverne, der indeholder syntetiserede CDA'er ved 70 °C i 15 minutter for at inaktivere den omvendte transskription og opbevare dem ved -80 °C. Vi anbefaler dog, at du går direkte videre til de næste trin for at undgå unødvendig frysning og optøning af prøverne.
  7. Gem halvdelen af hvert cDNA-bibliotek ved -80 °C som back-up.
  8. Udfør PCR-forstærkning i henhold til producentens protokol. Brug halvdelen af reaktionsblandingen. De opnåede biblioteker opbevares ved -80 °C. STOPpunkt.

9. Størrelsesvalg af cDNA-biblioteker ved hjælp af PAGE

  1. Forbered 6% polyacrylamide-TBE gel og læg den i en tank med TBE buffer. Forkør i mindst 10 minutter ved en konstant spænding på 200 V.
  2. Bland prøverne med Gel Loading Dye, Blue (6X) og læg dem på gelen. Brug Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest som stige. I begyndelsen skal du køre elektroforese ved en konstant spænding på 120 V for at tillade DNA at komme ind i gelen og derefter ændre spændingen til 180 V.
  3. Når elektroforese er færdig, plette gelen i en SYBR Gold-bad i ca 2-3 minutter og skyl gelen med nuklease-fri vand.
  4. Punktafgift gel fragmenter, der indeholder biblioteker. For RNA-seq prøver punktafgifter mellem 135-180 nt og for RIBO-seq mellem 135-170 nt. Brug steril nål eller barberblad og læg de punkterede gelfragmenter i separate 1,5 mL reaktionsrør. Husk at skifte nål eller barberblad mellem prøverne.
    BEMÆRK: Adaptere og stregkode fra NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina har 119 nt i alt, som bestemmer den nederste excision cut-off.
  5. Der tilsættes 100 μL nukleasefrit vand til hvert punktafgiftsgelfragment.
  6. Gelfragmenterne inkuberes ved 10 °C, 450 omdr./min. natten over i en termomixer.
  7. Rengør og koncentrer cDNA-bibliotekerne med et kommercielt DNA-oprydningssæt i henhold til producentens protokol.
    BEMÆRK: Vi anbefaler, at du bruger Zymo DNA Clean &Koncentrat -5-sæt (se Materialetabel).
  8. Opbevar rensede CDNA-biblioteker ved -80 °C. STOPpunkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De eksemplariske resultater, der præsenteres her, blev opnået i en undersøgelse, der undersøgte oversættelsesforordningen ved sporulering af WT Bacillus subtilis-celler. Fra den ene dag til den anden blev kulturerne fortyndet tilOD 600 svarende til 0,1 ud af 100 mL rigt medium og inkuberet ved 37 °C med kraftig rysten, indtil OD600 nåede 0,5-0,6. Det rige medium blev derefter erstattet med minimal medium for at fremkalde sporulationsproces, og inkubationen blev fortsat i op til fire timer. Celler blev høstet hver time begynder med T0 - sporulation induktion - resulterer i fem tidspunkter. Et minut før høsten blev kulturerne behandlet med chloramphenicol som beskrevet i protokollen ovenfor. Cellerne blev indsamlet ved filtrering i et forvarmet glasfiltreringssystem ved hjælp af 0,45 μm blandede celluloseesteremembranfiltre (MCE) og flashfrosset i flydende nitrogen.

Mængden af ribonukleinsyre opnået i lysatet afhænger af vækstforhold, dyrkningsvolumen og tæthed. Efter vores protokol giver 100 mL af bakteriekulturen (Bacillus subtilis) i gennemsnit 1-4 mg RNA. Eksempler på lysater fra ovennævnte forsøg er vist i tabel 1.

RNA-koncentration [ng/μL] RNA-mængde [mg] A260/A280 A260/A230
WT0 5845 3.21 1.57 0.83
WT1 6275 3.45 1.58 0.79
WT2 3525 1.94 1.38 0.56
WT3 3717 2.04 1.37 0.61
WT4 1653 0.91 1.11 0.43

Tabel 1. RNA-koncentration og mængde i repræsentative prøver af B. subtilis lysater. Tabellen omfatter prøver af den vilde type (WT) B. subtilis, som blev høstet før sporulation induktion (0) og en time (1), to (2), tre (3) eller fire (4) timer efter sporulation induktion. Lysis blev udført med 550 μL lysis buffer indeholdende chloramphenicol. Det kan bemærkes, at efterhånden som sporulationen fortsætter, falder mængden af opnået RNA.

Når mængden af RNA er lavere end 1 mg, anvendes 0,25 mg RNA til RIBO-seq i stedet for 1-0,5 mg, og mængden af MNase justeres derefter. Den repræsentative RNA-mængde og koncentration efter nuklease fordøjelse er vist i tabel 2. Den gennemsnitlige mængde RNA efter fordøjelse og rengøring er 50 μg fra 0,5 mg RNA-indgang.

RNA-koncentration [ng/μL] RNA-beløb [μg] A260/A280 A260/A230
WT0-R 1015 50.75 2.12 1.84
WT1-R 1157.4 57.87 2.10 2.19
WT2-R 847.2 42.36 2.10 2.00
WT3-R 983.6 49.18 2.09 2.16
WT4-R 206 10.30 2.13 1.00

Tabel 2. Mængden og koncentrationen af RNA efter nuklease fordøjelsen af de repræsentative prøver for RIBO-seq. Tabellen omfatter prøver af den vilde type (WT) B. subtilis, som blev høstet før sporulationsinduktion (0) og en time (1), to (2), tre (3) eller fire (4) timer efter sporulationsinduktion; bogstavet "R" henviser til prøver for RIBO-seq. Da RNA-koncentrationen af WT4-R-prøven var lav, blev 0,25 mg RNA fordøjet, mens 0,5 mg af RNA'et for de resterende prøver blev brugt til ribosomal footprint-produktion. Mængden af MNase til fordøjelsen var 178,125 U for 0,25 mg RNA i WT4-R og 356,25 U for 0,5 mg RNA i andre prøver. Efter fordøjelsen blev prøverne renset med det kommercielle RNA-oprydningssæt, og koncentrationen af ribonukleinsyre blev målt med NanoDrop.

Efter MNase fordøjelsen udføres størrelsesvalg ved hjælp af PAGE. Et eksempel på en 15% TBE-urea polyacrylamidgel med de fordøjede prøver er vist i figur 3. Fragmenter af gel mellem 26 og 32 nt blev fjernet med et sterilt barberblad og inkuberet natten over i natten inkubationsbuffer. Den næste dag blev ribosomale fodspor renset med det kommercielle RNA-oprydningssæt.

Figure 3
Figur 3. 15% TBE-urea polyacrylamid gel med repræsentative prøver efter MNase fordøjelse. Tallet omfatter prøver af den vilde type (WT) B. subtilis, som blev høstet før sporulation induktion (0) og en time (1), to (2), tre (3) eller fire (4) timer efter sporulation induktion; bogstavet "R" henviser til prøver for RIBO-seq. 15 μL denaturerede prøver blev lastet i gelbrøndene i rækkefølge: WT2-R, WT3-R, WT4-R, WT0-R, WT1-R og den resterende mængde blev opbevaret ved -80 °C som back-up. 29 nt oligonukleotid og blanding af 26 nt og 32 nt oligonukleotider blev anvendt som markører. Elektroforese blev udført som beskrevet ovenfor, og gelen blev farvet i et SYBR Gold-bad. Klik her for at se en større version af dette tal.

Parallelt med nuklease fordøjelsen blev lysater til RNA-seq renset med det kommercielle RNA-oprydningssæt, og de opnåede koncentrationer af RNA blev målt med NanoDrop. De repræsentative resultater fremgår af tabel 3. Efter rengøring faldt mængden af ribonukleinsyre til 40-500 μg.

RNA-koncentration [ng/μL] RNA-beløb [μg] A260/A280 A260/A230
WT0-m 10274.1 513.70 2.14 2.35
WT1-m 10118.3 505.92 2.12 2.33
WT2-m 5599.7 279.98 2.15 2.29
WT3-m 6562.2 328.11 2.08 2.31
WT4-m 757 37.85 2.01 1.95

Tabel 3 . RNA-mængde og koncentration af prøver til RNA-seq efter RNA-rensning. Tabellen omfatter prøver af den vilde type (WT) B. subtilis, som blev høstet før sporulationsinduktion (0) og en time (1), to (2), tre (3) eller fire (4) timer efter sporulationsinduktion; bogstavet "m" henviser til prøver for RNA-seq (mRNA).

De opnåede RNA-koncentrationer af prøverne for RNA-seq blev anvendt til at definere RNA-input til rRNA-udtømning. 8 μg RNA fra hver RNA-seq prøve blev anvendt sammen med MICROBExpress bakteriel mRNA-rensesæt (se materialetabel)i henhold til producentens protokol og blev derefter rengjort med det kommercielle RNA-oprydningssæt. De repræsentative resultater af udtømningen af rRNA fremgår af tabel 4.

RNA-koncentration [ng/μL] A260/A280 A260/A230 RNA-beløb [μg]
WT0-m 62.7 1.99 1.75 3.1
WT1-m 59.3 2.00 2.16 2.9
WT2-m 93.7 1.97 1.69 4.7
WT3-m 68.3 1.99 2.33 3.4
WT4-m 85.0 1.97 2.00 4.2

Tabel 4 . Den repræsentative RNA-mængde og koncentration efter udtømning af rRNA. Tabellen omfatter prøver af den vilde type (WT) B. subtilis, som blev høstet før sporulationsinduktion (0) og en time (1), to (2), tre (3) eller fire (4) timer efter sporulationsinduktion; bogstavet "m" henviser til prøver for RNA-seq. 8 μg RNA fra prøver til RNA-seq blev brugt til rRNA-udtømning og rengøres med et kommercielt RNA-oprydningssæt bagefter.

Dernæst blev det opnåede mRNA fragmenteret af alkalisk hydrolyse og rengjort med et kommercielt kit som beskrevet i protokollen. De fragmenterede mRNA- og ribosomale fodaftryk blev afphosphorylateret i 3' ender og fosfori i 5' ender i henhold til ovenstående protokol. Prøverne blev derefter brugt til at konstruere cDNA biblioteker til Illumina sekventering, som beskrevet i protokollen. Figur 4 viser et eksempel på en 6% polyacrylamidgel med de opnåede biblioteker. Gelfragmenter i området 135-180 nt for RNA-seq og 135-170 nt for RIBO-seq blev fjernet med sterile barberblade og inkuberet natten over i nukleasefrit vand. Biblioteker blev renset med et kommercielt DNA-oprydningssæt, og kvalitet og kvantitet blev vurderet af en højfølsom DNA on-chip elektroforese ved hjælp af Agilent 2100 Bioanalyzer.

Figure 4
Figur 4. 6% polyacrylamid gel af cDNA biblioteker før og efter størrelse udvælgelse. Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest blev brugt som stige. 25 μL prøver blev indlæst i gelen i følgende rækkefølge: tre RIBO-seq biblioteker og seks RNA-seq biblioteker. De resterende mængder prøver blev opbevaret ved -80 °C som back-up. Tallet omfatter prøver af den vilde type (WT) B. subtilis, som er høstet en time (1), to (2), tre (3) eller fire (4) timer efter sporulation induktion; bogstavet "R" henviser til prøver for RIBO-seq, og bogstavet "m" henviser til prøver for RNA-seq. Klik her for at se en større version af dette tal.

Eksemplerne på virtuelle gelbilleder og elektrofeerogrammer fra Agilent 2100 Bioanalyzer er vist i figur 5. Bånd og toppe, der repræsenterer RIBO-seq-bibliotekerne, er mere smalle og bedre definerede sammenlignet med dem, der repræsenterer RNA-seq-biblioteker. Ifølge on-chip elektrophoresis, biblioteker er cirka 150 bp lang, hvilket er en forventet bibliotek størrelse. Adapterne og stregkoden, der bruges i biblioteksforberedelsen, er 119 nt lang, og indsatserne er enten 29-30 nt lange (for RIBO-seq) eller i et interval mellem 25 og 50 nt (for RNA-seq). De ekstra toppe tættere på de 200 basispoint, der er opnået fra RIBO-seq-biblioteker, kan indikere PCR-artefakter, som kan kasseres under bioinformatatisk analyse, når de data, der er opnået ved sekventering, trimmes, og rRNA/tRNA filtreres. Den gennemsnitlige mængde DNA er 32 ng, hvilket giver tilstrækkelig mængde materiale, der kræves til næste generations sekventering.

Figure 5
Figur 5. Eksemplerne på elektrofemogrammer og virtuelle gelbilleder fra en højfølsom DNA on-chip elektroforese. Tallet omfatter prøver af den vilde type (WT) B. subtilis, som blev høstet før sporulation induktion (0) og en time (1), to (2), tre (3) eller fire (4) timer efter sporulation induktion; bogstavet "R" henviser til RIBO-seq biblioteker og bogstavet "m" henviser til RNA-seq biblioteker. Klik her for at se en større version af dette tal.

Efter kvalitetskontrol af on-chip elektrophoresis, biblioteker blev samlet til single-end 50 bp sekventering på Illumina's NextSeq500 platform (10 biblioteker per kanal, med mindst 350 mln læser per kanal). Sekventering gav 30-57 millioner læser per prøve for RNA-seq biblioteker og 30-50 millioner læser per prøve for RIBO-seq biblioteker. Trimning af adaptere og sekvenser af dårlig kvalitet resulterede i 24-47 mln aflæsninger pr. prøve for RNA-seqprøver og 25-50 mln aflæsninger pr. prøve for RIBO-seq prøver. Kortlægning, udført med STAR44, gav 2,4-9,6 millioner unikt kortlagt læser per prøve for RNA-seq prøver (som udgør 8-16,8% af det samlede antal læser) og 2,3-10,4 millioner unikt kortlagt læser (7,7-22,1%) for RIBO-seq prøver. De indhentede data blev kvalitetskontrol kontrolleret med FastQC45. Eksempler på de kvalitetsområder, som FastQC har produceret for de trimmede sekvenser, er vist i figur 6. Sekvenserne af interessens længde, som er <32 nt for RIBO-seq og <50 nt for RNA-seq, præsenterede meget god kvalitet. Eksemplerne på observationsområder med GC-indhold og fordelinger af sekvenslængder over alle trimmede sekvenser er vist i figur 7. Den ekstra top på 72 % i GC-distributionsområdet i RIBO-seq-biblioteket kan potentielt indikere rRNA-kontaminering , som kan fjernes under bioinformatatisk analyse ved rRNA-filtrering46,47,48. Fordelingen af sekvenslængder er meget smal for RIBO-seq-biblioteker med et højdepunkt på 26-27 nt, mens længdefordelingen for RNA-seq-biblioteker er bredere og ligger mellem 15 og 50 nt.

Figure 6
Figur 6. Eksemplerne på box-and-whisker plots af kvalitetsresultater på tværs af alle baser for RIBO-seq og RNA-seq biblioteker efter trimning. Tallet omfatter prøver af den vilde type (WT) B. subtilis, som blev høstet før sporulation induktion (0) og fire (4) timer efter sporulation induktion; Bogstavet "R" henviser til RIBO-seq-prøver, og bogstavet "m" henviser til RNA-seq-prøver. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7. Eksemplerne på plots af GC indhold og sekvens længde fordeling af alle sekvenser for RIBO-seq og RNA-seq biblioteker efter trimning. Figuren viser prøver af den vilde type (WT) B. subtilis, som blev høstet fire (4) timer efter sporulation induktion; bogstavet "R" henviser til prøve for RIBO-seq, og bogstavet "m" henviser til prøve for RNA-seq. Klik her for at se en større version af dette tal.

For at kontrollere, om RIBO-seq-dataene indeholder oplysninger om ægte ribosomale fodaftryk i stedet for tilfældige mRNA-fragmenter af den valgte længde, sammenlignede vi sekventeringsdata fra RIBO-sekt og RNA-seq ved hjælp af RiboToolkit, en webserver til RIBO-seq dataanalyse49. Ribo-seq-data udviser tre gange så meget periodicitet som en høj, smal top svarende til de igangsættende ribosomer og er karakteristisk for RF som vist i figur 8A, som ikke er observeret i RNA-seq-dataene (figur 8B). Desuden afslørede det metagene observationsområde, der viste profilerne for den gennemsnitlige dækning af RF- og mRNA-fragmenter på kodningssekvenserne (CDS'er), en større andel af de læseplaner, der var kortlagt cd'erne i RIBO-seq-datasættet (Figur 8C) som forventet.

Figure 8
Figur 8. Metagene periodicitetsplotter og gennemsnitlig dækning af RF- og mRNA-fragmenter på CDS'er. Metagene profiler blev opnået med RiboToolkit, en integreret webserver49. CDS-længden blev normaliseret til en værdi af 1, og hver CDS blev opdelt i 100 lige store placeringer. Figuren viser prøver af den vilde type (WT) B. subtilis, som blev høstet en (1) time efter sporulation induktion; bogstavet "R" henviser til prøve for RIBO-seq, og bogstavet "m" henviser til prøve for RNA-seq. Klik her for at se en større version af dette tal.

For at sammenligne, om den RIBO-seq-protokol, der præsenteres her, giver resultater svarende til dem, der opnås ved standardmetoden til RF-nyttiggørelse (saccharosegradient ultracentrifugering), parallelerede vi sekventeringsresultaterne fra biblioteker, der er udarbejdet efter de to metoder. De eksperimenter, der undersøgte oversættelsesforordning under sporulation i WT B. subtilis, blev udført i henhold til den præsenterede RIBO-seq-protokol samt efter standardprotokollen, som omfatter monosomer, der nyttiggørelse af en saccharosegradient ultracentrifugering. Resultaterne af ribosome-dækningsprofilerne fra de to forsøg er vist i figur 9. Visualiseringen af kortlagte FRR er meget ens mellem de to eksperimenter og gav lignende resultater ved bioinformatikanalyse.

Figure 9
Figur 9. Visualiseringen af den opnåede RF kortlagt på genomet. Figuren omfatter RF opnået af vilde type B. subtilis høstet fire timer efter sporulation induktion og udarbejdet i henhold til standardprotokollen (WT4-R-s, øverste panel) eller den præsenterede protokol (WT4-R, lavere panel). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den vigtigste tekniske udfordring ved ribosome profilering er behovet for hurtigt at hæmme oversættelsen for at fange et øjebliksbillede af ribosomer på mRNA'er på en bestemt fysiologisk tilstand af interesse. For at opnå dette anvendes oversættelseshæmmere, hurtig høst og flashfrysning i flydende nitrogen. Anvendelse af antibiotika er valgfrit, da de kan forårsage artefakter. Chloramphenicol er et almindeligt anvendt lægemiddel til at arrestere aflange ribosomer i bakteriel RIBO-seq. Det forhindrer dog ikke, at der indledes en procedure, hvilket resulterer i en akkumulering af ribosomer omkring seks codoner neden for oversættelsesinitieringsstedet14. Desuden kan dens evne til at hæmme peptidyltransferasereaktionen være afhængig af arten af ribosomal P- og A-site substrater. Formentlig, CAM anholdelser ribosomer mere effektivt med Gly, Ala, Ser, Cys, eller Thr som næstsidste aminosyre af den spirende peptid17,38,50. Dette er værd at tage i betragtning under eksperimentel design og bioinformatikanalyse, især når man studerer ribosomal pausing17. CAM har også vist sig at påvirke translationel nøjagtighed ved at fremme et stop codon gennemlæsning og frameshifting51. Alligevel cam hæmning er relativt hurtig og tilstrækkelig til typiske RIBO-seq forskning14 og ikke fremkalder misinkorporering51. Nogle af de artefakter forårsaget af antibiotika kan undgås ved at øge mængden af narkotika9. CAM koncentration anvendt i vores protokol er den typiske mængde, der anvendes i RIBO-seq eksperimenter7,14,21, men koncentrationen kan variere for forskellige mikroorganismer og bør optimeres før prøvehøst. På grund af muligheden for en forekomst af artefakter forårsaget af anvendelse af oversættelseshæmmere anbefales det at undgå hæmmerbehandlingen, hvis det ikke er nødvendigt for forskningsspørgsmålet, og hvis hurtig høst er mulig14. Hurtig celleindsamling er afgørende, især hvis den udføres uden hæmmerbehandlingen, da langvarig høst kan resultere i tab af polysomer og / eller ændring i oversættelsen som reaktion på de skiftende miljøforhold14. Vi anbefaler derfor, at du bruger filtrering som høstmetode, da den kan udføres under de samme eller lignende forhold som dyrkningsvæksten, herunder temperatur og/eller rysten. Under filtrering skylles celler, der opsamles på filteroverfladen, konstant med vækstmedium, hvilket forhindrer dem i at fornemme skift i celletæthed, iltning og niveau af aminosyrer og andre næringsstoffer14. Filtrering er blidere og kan være hurtigere end centrifugering, hvis tætheden af kulturen er moderat, ellers kan et stort antal celler tilstoppe filterporerne og bremse processen. Hvis der er sandsynlighed for en langvarig filtrering, anbefaler vi en chloramphenicol forbehandling af kulturen, hvilket resulterer i en oversættelsesstop og gør det muligt at forlænge høsttiden. Hvis filtrering bliver vanskelig at fuldføre på grund af filterstopningen, foreslår vi at stoppe filtreringen, fjerne den overskydende kultur og flash frysefraktionen af den kultur, der er indsamlet på filteret. Vi observerede, at 50 mL tæt bakteriekultur er tilstrækkelig til at udføre RIBO-seq. Den efterfølgende flash frysning af celler i flydende nitrogen er den mest universelle og effektive tilgang til straks at stoppe oversættelse8,21,52.

Ribonuklease fordøjelse er et kritisk skridt, der kræves for at opnå god kvalitet RF. Valg af det rigtige enzym er vigtigt, da ribosomale underenheder er sammensat af RNA-molekyler, der kan fordøjes, forstyrrer ribosomets integritet, forårsager rRNA-forurening og ødelægger RF44. Oprindeligt RNase jeg blev brugt til fordøjelsen af mRNA og RF generation i eukaryoter1. Da dette enzym syntes inaktivt i bakterier, blev det erstattet med en mikrokokkerne (MNase) fra Staphylococcus aureus21. Det blev senere vist, at RNA'er jeg faktisk kan udføre fordøjelsen af bakterieprøver, men MNase forbliver almindeligt anvendt til dette formål53. Ulempen ved MNase ligger i sekvensen bias af sin katalytiske aktivitet, som er 30 gange øget proksimal til A eller T, hvilket resulterer i 80% af mRNA fragmenter starter med A eller T på 5 'end14. Men dette er blevet overvundet af den observation, at de fleste af variationen i længden sker i 5′-slutningen af RF, og tildele ribosome tæthed til 3′-end udbytter præcise og præcise oplysninger om ribosom position7. MNase-aktiviteten påvirkes af enzymkoncentrationen, pH-lsen og fordøjelsestiden og bør bestemmes for hvert nyt MNase-parti. En øget nukleaseaktivitet resulterer i øget rRNA-forurening, mens nedsat aktivitet forårsager mindre nøjagtig kavalergang af ribosomale fodspor. Dette kan reducere det samlede udbytte af RF i den størrelsesselektive gelrensningsprocedure og give mindre nøjagtige oplysninger om ribosompositioner på mRNA14. Således bør den nødvendige mængde MNase bestemmes omhyggeligt. For vores eksperimenter anvender vi 712,5 U mikrokokkerne pr. 1 mg RNA, mens koncentrationen rapporteret i litteraturen varierer mellem 50 U38, 450 U34, 1000 U14 og 1500 U15,21,36 pr. 1 mg RNA. Som nævnt ovenfor kræver MNase tilstedeværelse af calciumioner for sin aktivitet. I standardprotokollerne EGTA anvendes et chelaterende middel til divalentioner, som har en højere affinitet for calcium sammenlignet med magnesium54, til at stoppe fordøjelsen ved at binde calcium og inaktivere MNase. I vores protokol stoppes fordøjelsesreaktionen dog ved hjælp af RNA-rengøringssæt direkte efter inkubation med nukleasen.

I standardprotokoller er det næste skridt ribosomer, der genvindes af en saccharosepude ultracentrifugering eller en saccharosegradient ultracentrifugering8,14. En saccharosegradientcentrifugering muliggør selektiv adskillelse af monosomerne fra underenhederne og polysomerne, men det kræver specifikt udstyr såsom en gradientblander og en ultracentrifuge. Gennemstrømningen af denne metode er også begrænset til 500-700 μL af lysatet. På den anden side gør saccharosepuden ultracentrifugering pellets mest ribosomale partikler det muligt at behandle over dusin milliliter lysat og er mindre krævende med hensyn til den nødvendige instrumentering. Begge tilgange er dog lange, da de tager mindst 4 til 6,5 timer14 og kræver en ultracentrifuge. I vores protokol udelades dette trin, da vi fortsætter direkte til størrelsesvalg i 15% TBE-urea polyacrylamidgel. Elektroforese udføres under denatureringsforhold for at udfolde RNA's sekundære strukturer og forhindre intramolekylære interaktioner. Vi bruger 26 nt, 29 nt og 32 nt oligonukleotider som markører til excising et smalt udvalg af ribosomale fodspor. Vi antager, at koncentrationen af den faktiske RF betydeligt overstiger den potentielle kontaminering med falsk RF, der betragtes som tilfældig, ubeskyttet af de ribosome mRNA- eller rRNA-længdefragmenter i dette område. De resultater, der blev opnået ved hjælp af vores protokol, viste faktisk beriget brøkdel af RF i det valgte størrelsesområde. Kvalitetstjekket med Agilent 2100 Bioanalyzer viser RIBO-seq biblioteker som en enkelt, veldefinere bands og toppe, i modsætning til RNA-seq biblioteker, der visualiseres som betydeligt bredere udtværinger og toppe (Figur 5). De opnåede Ribo-seq-data udviser også tredobbelt periodicitet (figur 8A), hvilket ikke er observeret i RNA-seq-dataene (figur 8B). Desuden viser visualiseringerne af den opnåede RF, der er kortlagt genomet, meget ens udtryksmønstre uanset fodaftryksisoleringsmetoden, hvilket yderligere blev bekræftet i vores bioinformatiske analyser (Figur 9). Alligevel er vi klar over, at falsk RF kunne kortlægge til genomet, som kan forstyrre det opnåede signal. Det faktum, at falsk RF genereres tilfældigt, indebærer imidlertid, at de ikke bør akkumuleres til ét sted på genomet og derfor ikke bør resultere i artefakter og falsk resultat. Det skal også bemærkes, at der ikke er enighed i bakterieundersøgelser om størrelsen af RF'er, der skal isoleres53,55, og at valg af kun en subfraktion af længdeinterval kan føre til fejlfortolkninger af resultaterne17. Det foreslås, at en lang række længder, der er karakteristiske for bakterielle fodspor, er en konsekvens af den prokaryote ribosomadfærd snarere end MNase fordøjelse55. For eksempel kan komplementær interaktion mellem de 3 ' slutningen af 16S rRNA i små ribosomale underenhed og en Shine-Dalgarno motiv i mRNA resultere i længere RF56. I betragtning af en bred vifte af længder af bakterielle fodspor, Mohammad et al. anbefaler at udføre størrelsesvalg mellem 15 og 40 nt17,55. Dette bør føre til isolering af potentielt en hel række FRR og sikre en omfattende repræsentation af ribosomer i forskellige faser af oversættelsescyklussen. På grund af den igangværende diskussion bør excision-området overvejes nøje, og det er vigtigt at huske, at det forkerte valg kan udelukke nogle subfractions af RF og føre til bias i den efterfølgende analyse.

På grund af størrelsesvalget udført direkte efter nuklease fordøjelsen og med at udelade den monosome isolation ved ultracentrifugation, er vores protokol hurtig, relativt let og kan udføres med et standardlaboratorieudstyr. Brug af dedikerede sæt til rengøring af RNA og DNA, rensning af mRNA og biblioteksforberedelse sikrer standardisering og repeterbarhed. Hvis der tilstås mere mængde ethanol under RNA-rengøringen, øges rensningseffektiviteten af <200 nt RNA-fragmenter57. Ændringer af bibliotekets forberedelse - forlængelse af inkubationstiden og forøgelse af temperaturen under adaptere ligation - anvendes til at reducere ligationseffektiviteten for methyleret RNA, såsom rRNA, og for at reducere rRNA-forurening58. Vores protokol er blevet brugt til at undersøge oversættelse regulering i forskellige vækstbetingelser (publikationer under udarbejdelse), men kan anvendes til at studere andre aspekter af oversættelse som TIS afsløre eller til at forbedre genom anmærkning og bistå proteomic undersøgelser. En yderligere ændring af protokollen, afhængigt af forskningsspørgsmålet, kan let medtages, f.eks. Med vores protokol er RIBO-seq-proceduren mere tilgængelig for forskere og kan dermed stimulere nye opdagelser og fremskynde udviklingen på området.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

ALS vil gerne anerkende den finansielle støtte fra EMBO Installation Grants IG 3914 og POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 gennemført inden for rammerne af det første TEAM-program under Instituttet for Polsk Videnskab, der medfinansieres af Den Europæiske Union under Den Europæiske Fond for Regionaludvikling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X TBE (powder) Invitrogen AM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, pure Acros Organics 125472500
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) New England Biolabs P0756S
Aluminium oxide calcinated pure p.a. Chempur 114560600
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C3881-500G
Chloramphenicol MP Biomedicals 190321
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4004
Dnase I recombinant, Rnase-free Roche 4716728001
EDTA disodium salt Fisher Scientific E/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic POCH Avantor Performance Materials Poland S.A BA6480111
Filtration apparatus VWR Collection 511-0265 all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask
Gel 40 (19:1) Rotiphorese 3030.1
Gel Loading Dye, Blue, 6X New England Biolabs E6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate Sigma-Aldrich G0635-25MG
labZAP A&A Biotechnology 040-500
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661-250G
MCE membrane fiter Alfatec Technology M47MCE45GWS pore size: 0.45um
MICROBExpress Bacterial mRNA Purification Invitrogen AM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina New England Biolabs E7300S
Nuclease-Free Water Ambion AM9937
Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest New England Biolabs E7323A
RNA Clean & Concentrator -25 Zymo Research R1018
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889-250G
Sodium carbonate Sigma-Aldrich 223530-500G
Sodium hydrogen carbonate pure p.a. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 810530115
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S11494
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer New England Biolabs B0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x) Invitrogen LC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9% AlfaAesar J65594
Triton X-100, 98% Acros Organics 327371000
Urea G.R. lach:ner 40096-AP0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  2. Takanami, M., Yan, Y., Jukes, T. H. Studies on the site of ribosomal binding of f2 bacteriophage RNA. Journal of Molecular Biology. 12 (3), 761-773 (1965).
  3. Steitz, J. A. Polypeptide Chain Initiation: Nucleotide Sequences of the Three Ribosomal Binding Sites in Bacteriophage R17 RNA. Nature. 224 (5223), 957-964 (1969).
  4. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. The EMBO journal. 7 (11), 3559-3569 (1988).
  5. Argüello, R. J., et al. SunRiSE - measuring translation elongation at single-cell resolution by means of flow cytometry. Journal of Cell Science. 131 (10), 214346 (2018).
  6. Michel, A. M., Baranov, P. V. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).
  7. Woolstenhulme, C. J., Guydosh, N. R., Green, R., Buskirk, A. R. High-precision analysis of translational pausing by ribosome profiling in bacteria lacking EFP. Cell reports. 11 (1), 13-21 (2015).
  8. McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. Methods (San Diego, Calif). 126, 112-129 (2017).
  9. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic acids research. 42 (17), 134 (2014).
  10. Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome Profiling of Mouse Embryonic Stem Cells Reveals the Complexity of Mammalian Proteomes. Cell. 147 (4), 789-802 (2011).
  11. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  12. Hsu, P. Y., et al. Super-resolution ribosome profiling reveals unannotated translation events in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (45), 7126-7135 (2016).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  15. Li, G. W., Oh, E., Weissman, J. S. The anti-Shine-Dalgarno sequence drives translational pausing and codon choice in bacteria. Nature. 484 (7395), 538-541 (2012).
  16. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in functional genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
  17. Mohammad, F., Woolstenhulme, C. J., Green, R., Buskirk, A. R. Clarifying the Translational Pausing Landscape in Bacteria by Ribosome Profiling. Cell reports. 14 (4), 686-694 (2016).
  18. Reid, D. W., Shenolikar, S., Nicchitta, C. V. Simple and inexpensive ribosome profiling analysis of mRNA translation. Methods (San Diego, Calif). 91, 69-74 (2015).
  19. Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
  20. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterialbiofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7, 41114 (2017).
  21. Oh, E. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  22. Chew, G. L. Ribosome profiling reveals resemblance between long non-coding RNAs and 5' leaders of coding RNAs. Development. 140 (13), Cambridge, England. 2828-2834 (2013).
  23. Dunn, J. G., Foo, C. K., Belletier, N. G., Gavis, E. R., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals pervasive and regulated stop codon readthrough in Drosophila melanogaster. eLife. 2, 01179 (2013).
  24. Liu, M. J., et al. Translational landscape of photomorphogenic Arabidopsis. The Plant cell. 25 (10), 3699-3710 (2013).
  25. Rooijers, K., Loayza-Puch, F., Nijtmans, L. G., Agami, R. Ribosome profiling reveals features of normal and disease-associated mitochondrial translation. Nature Communications. 4, 2886 (2013).
  26. Danielle, L., et al. Fidelity of translation initiation is required for coordinated respiratory complex assembly. Science Advances. 5 (12), 2118 (2019).
  27. Zoschke, R., Watkins, K. P., Barkan, A. A rapid ribosome profiling method elucidates chloroplast ribosome behavior in vivo. The Plant cell. 25 (6), 2265-2275 (2013).
  28. Chotewutmontri, P., Barkan, A. Dynamics of chloroplast translation during chloroplast differentiation in maize. PLoS genetics. 12 (7), 1006106 (2016).
  29. Lee, S., Liu, B., Huang, S. X., Shen, B., Qian, S. B. Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).
  30. Martinez, T. F., Chu, Q., Donaldson, C., Tan, D., Shokhirev, M. N., Saghatelian, A. Accurate annotation of human protein-coding small open reading frames. Nature chemical biology. 16 (4), 458-468 (2020).
  31. Simsek, D., et al. The Mammalian Ribo-interactome Reveals Ribosome Functional Diversity and Heterogeneity. Cell. 169 (6), 1051-1065 (2017).
  32. Fritsch, C., et al. Genome-wide search for novel human uORFs and N-terminal protein extensions using ribosomal footprinting. Genome research. 22 (11), 2208-2218 (2012).
  33. Lareau, L. F., Hite, D. H., Hogan, G. J., Brown, P. O. Distinct stages of the translation elongation cycle revealed by sequencing ribosome-protected mRNA fragments. eLife. 3, 01257 (2014).
  34. Meydan, S., et al. Retapamulin-Assisted Ribosome Profiling Reveals the Alternative Bacterial Proteome. Molecular Cell. 74 (3), 481-493 (2019).
  35. Wilson, D. N. The A-Z of bacterial translation inhibitors. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 393-433 (2009).
  36. Nakahigashi, K. Comprehensive identification of translation start sites by tetracycline-inhibited ribosome profiling. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 23 (3), 193-201 (2016).
  37. Weaver, J., Mohammad, F., Buskirk, A. R., Storz, G. Identifying Small Proteins by Ribosome Profiling with Stalled Initiation Complexes. mBio. 10 (2), 02819 (2019).
  38. Nakahigashi, K. Effect of codon adaptation on codon-level and gene-level translation efficiency in vivo. BMC genomics. 15 (1), 1115 (2014).
  39. Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
  40. Michel, A. M., et al. Observation of dually decoded regions of the human genome using ribosome profiling data. Genome research. 22 (11), 2219-2229 (2012).
  41. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
  42. Young, D. J., Guydosh, N. R., Zhang, F., Hinnebusch, A. G., Green, R. Rli1/ABCE1 Recycles Terminating Ribosomes and Controls Translation Reinitiation in 3'UTRs In Vivo. Cell. 162 (4), 872-884 (2015).
  43. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
  44. Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  45. Babraham Bioinformatics. Fast QC. , Babraham Institute. Cambridgeshire. Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2021).
  46. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic acids research. 45 (2), 6 (2017).
  47. Verbruggen, S., Menschaert, G. mQC: A post-mapping data exploration tool for ribosome profiling. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 181, 104806 (2019).
  48. Cui, H., Hu, H., Zeng, J., Chen, T. DeepShape: estimating isoform-level ribosome abundance and distribution with Ribo-seq data. BMC bioinformatics. 20, Suppl 24 678 (2019).
  49. Choi, J. RiboToolkit: an integrated platform for analysis and annotation of ribosome profiling data to decode RNA translation at codon resolution. , (2021).
  50. Choi, J. Dynamics of the context-specific translation arrest by chloramphenicol and linezolid. Nature chemical biology. 16 (3), 310-317 (2020).
  51. Tompson, J., O'Connor, M., Mills, J. A., Dahlberg, A. E. The protein synthesis inhibitors, oxazolidinones and chloramphenicol, cause extensive translational inaccuracy in vivo. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 273-279 (2002).
  52. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (11), 651-664 (2015).
  53. Glaub, A., Huptas, C., Neuhaus, K., Ardern, Z. Recommendations for bacterial ribosome profiling experiments based on bioinformatic evaluation of published data. Journal of Biological Chemistry. 295, 8999-9011 (2020).
  54. Sorour, M. H., Hani, H. A., Shaalan, H. F., El-Sayed, M. M. H. Experimental screening of some chelating agents for calcium and magnesium removal from saline solutions. Desalination and Water Treatment. 57 (48-49), 22799-22808 (2015).
  55. Mohammad, F., Green, R., Buskirk, A. R. A systematically-revised ribosome profiling method for bacteria reveals pauses at single-codon resolution. Elife. 8, 42591 (2019).
  56. O'Connor, P. B., Li, G. W., Weissman, J. S., Atkins, J. F., Baranov, P. V. rRNA:mRNA pairing alters the length and the symmetry of mRNA-protected fragments in ribosome profiling experiments. Bioinformatics. 29 (12), Oxford, England. 1488-1491 (2013).
  57. Protocol for RNA Clean & Concentrator -25. Zymo Research. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_r1017_r1018_rna_clean_concentrator-25.pdf (2021).
  58. Protocol for use with NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina (E7300, E7580, E7560, E7330). New England Biolabs. , Available from: https://www.international.neb.com/protocols/2018/03/27/protocol-for-use-with-nebnext-small-rna-library-prep-set-for-illumina-e7300-e7580-e7560-e7330 (2021).

Tags

Biokemi udgave 174
RIBO-seq i bakterier: en prøvesamling og biblioteksforberedelsesprotokol til NGS-sekventering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P.,… More

Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P., Kovalenko, M., Starosta, A. L. RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing. J. Vis. Exp. (174), e62544, doi:10.3791/62544 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter