Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Bakterilerde RIBO-seq: NGS Dizilimi için Örnek Toplama ve Kütüphane Hazırlama Protokolü

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62544
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2, 1,2
1Laboratory of Gene Expression, ECOTECH-Complex, Maria Curie-Sklodowska University, 2Department of Molecular Biology, Institute of Biological Sciences, Maria Curie-Sklodowska University, 3Faculty of Information Technology, Polish-Japanese Academy of Information Technology

Summary

Burada bakterilerde RIBO-seq için numune toplama ve hazırlama aşamalarını açıklıyoruz. Bu yönergelere göre hazırlanan kütüphanelerin sıraya dizilimi, kapsamlı biyoinformatik analiz için yeterli veri ile sonuçlanır. Sunduğumuz protokol basittir, standart laboratuvar ekipmanlarını kullanır ve lizizden kütüphanelerin eldeine kadar yedi gün sürer.

Abstract

Ribozom profilleme tekniği (RIBO-seq) şu anda protein sentezi sürecini incelemek için en etkili araçtır in vivo. Bu yöntemin avantajı, diğer yaklaşımlara kıyasla, bir mRNA transkriptinde ribozomların konumunu ve sayısını tam olarak haritalayarak çeviriyi izleme yeteneğidir.

Bu yazıda, bakterilerde RIBO-seq yöntemi için numune toplama ve hazırlamanın ardışık aşamalarını açıklar, deneyin planlanması ve yürütülmesi ile ilgili ayrıntıları vurgularız.

RIBO-seq bozulmamış ribozomlara ve ilgili mRNA'lara dayandığından, anahtar adım çevirinin hızlı inhibisyonu ve hücrelerin yeterli parçalanmasıdır. Bu nedenle, bakterilerde çeviriyi tutuklamak için kloramfenikol ile isteğe bağlı bir ön işlemle hücre hasadı için sıvı nitrojende filtrasyon ve flaş dondurma öneriyoruz. Parçalanma için, hücre duvarını mekanik olarak bozmak için alüminyum oksit varlığında donmuş hücrelerin harç ve pestle ile öğütülmeyi öneriyoruz. Bu protokolde, monozomlu saflaştırma için sakkaroz yastığı veya sakkaroz gradyan ultrasantrifüj gereklidir. Bunun yerine poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) kullanılarak mRNA ayrımı ve ardından ribozomal ayak izi eksizyonu (28-30 nt bandı) uygulanır ve tatmin edici sonuçlar sağlar. Bu, yöntemi büyük ölçüde basitleştirir ve prosedür için zaman ve ekipman gereksinimlerini azaltır. Kütüphane hazırlığı için, New England Biolabs'tan Illumina dizilimi için piyasada bulunan küçük RNA kitini kullanmanızı öneririz, üreticinin yönergelerini bir dereceye kadar optimizasyonla takip edin.

Elde edilen cDNA kitaplıkları, yeni nesil sıralama (NGS) için gereken uygun miktar ve kaliteyi sunar. Açıklanan protokole göre hazırlanan kütüphanelerin sıraya dizilimi, kapsamlı biyoinformatik analiz için yeterli veri sağlayan örnek başına 2 ila 10 mln benzersiz haritalı okuma ile sonuçlanır. Sunduğumuz protokol hızlı ve nispeten kolaydır ve standart laboratuvar ekipmanları ile gerçekleştirilebilir.

Introduction

Ribozom profilleme tekniği (RIBO-seq), Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco1'dekiJonathan Weissman'ın laboratuvarında geliştirilmiştir. Ribo-seq, gen ekspresyonunu çeviri düzeyinde incelemek için kullanılan diğer yöntemlere kıyasla, mRNA'ya her ribozom bağlamasına odaklanır ve konumu ve transkriptteki ribozomların göreceli sayısı hakkında bilgi sağlar. Protein sentezi sürecinin in vivo olarak izlenmesini sağlar ve hem bireysel mRNA'da hem de hücredeki tüm transkriptom boyunca ribozom yoğunluğunun ölçülmesine izin veren tek kodon çözünürlüğü ve doğruluğu sağlayabilir. RIBO-seq tekniğinin temelinde, çeviri sırasında ribozomların mRNA molekülünü bağlaması ve böylece transkriptin gömülü parçasını bir ribonükleaz sindiriminden koruması yatmaktadır. Ribonokleaz ek olarak, korunmasız mRNA sindirilir ve ribozomlar tarafından çevrelenmiş parçalar - tipik olarak ~ 28-30 nt uzunluğunda - bozulmadan kalır. Ribozomal ayak izleri (RF) olarak adlandırılan bu parçalar daha sonra izole edilebilir, sıralanabilir ve ribozomların tam konumunun tespit edilmesiyle ortaya çıktıkları transkript üzerine eşlenebilir. Aslında, ribozom yeteneği mRNA parçalarını korumak için ribozom yeteneği 1960'lardan beri ribozomal bağlama ve çeviri başlatma alanlarını (Tİs) incelemek içinkullanılmaktadır 2,3,4. Bununla birlikte, derin sıralama teknolojisindeki ilerleme ile RIBO-seq, ribozom katılımı yoluyla protein sentezi 6 hakkında genom çapında bilgi sağlayabilen çeviri izleme5 için altın bir standarthalinegelmiştir. Ribozom profilleme, transkriptom ve proteom6'nınölçülmesi arasında var olan teknolojik boşluğu doldurdu.

Ribozom profilleme yapmak için, araştırılan koşullar altında büyüyen organizmanın hücre lizatını elde etmeliyiz. Hücre toplama ve lizis sırasında bu koşulların bozulması güvenilmez veriler sağlayabilir. Bunu önlemek için, çeviri inhibitörleri, hızlı hasat ve sıvı azot içinde flaş dondurma yaygın olarak kullanılır. Hücreler, mikser değirmeni7,8 veya boncuk çırpıcı9gibi mekanik bir homojenizatörde kriyojenik taşlama ve pipet10 veya iğne ile tritürasyon ile11ile yutabilir. Lizis tamponu, hücrelerin pulverizasyondan hemen önce veya kısa bir süre sonra eklenebilir. Protokolümüzde, harç ve pestle'yi ön soğutmak için sıvı nitrojenin yanı sıra, sonifikasyon gibi yöntemler uygulandığında sıklıkla karşılaşılan RNA makasını önleyen bakteri hücre duvarının bozulmasına daha nazik bir yaklaşım olarak alüminyum oksit kullanıyoruz. Pulverizasyondan sonra harcın soğutulmuş içeriğine buz gibi bir lizis tamponu ekliyoruz. Uygun bir lizis tamponunun seçilmesi ribozomal ayak izlerinin en iyi çözünürlüğünü elde etmek için önemlidir. İyonik mukavemet hem RF boyutunu hem de okuma çerçevesi hassasiyetini etkilediğinden, tampon bileşiminin mRNA'lar11,12'deribozomal doluluğu etkilemediği görünse bile, düşük iyonik mukavemet ve tampon kapasitesine sahip lizis tamponlarının kullanılması önerilir. Lizis tamponunun önemli bileşenleri, varlığı ribozomal alt ünüllerin ayrışmasını önleyen ve bakteriyel ribozomlardaki spontan konformasyonel değişiklikleri inhibe eden magnezyum iyonlarıdır11,13. Kalsiyum iyonları da önemli bir rol oynar ve bakteriyel ribozom profilleme yönteminde kullanılan mikrokoksal çekirdeğin (MNaze) aktivitesi için gereklidir14. Guanosine ilavesi 5′-[β,γ-imido]trifosfat (GMP-PNP), GTP'nin hidrolize edilemez bir analogu, kloramfenikol ile birlikte liziz sırasında çeviriyi engeller15.

Lysate elde edildiğinde, santrifüjleme ile netleştirilir ve her biri bir RIBO-seq ve aynı anda gerçekleştirildikleri için yüksek verimli toplam mRNA dizilimi (RNA-seq) için iki bölüme ayrılır (Şekil 1). RNA-seq, veri analizi sırasında hem RIBO-seq hem de RNA-seq'ten gelen verilerin karşılaştırılmasına olanak sağlayan bir referans noktası sağlar. Araştırılan translatom, ribozomal ayak izlerinin mRNA bolluğuna normalleştirilmesi ile tanımlanır16. RNA-seq'ten gelen veriler,17kopyalama veya sıralama yapıtlarını tanımlamaya da yardımcı olabilir.

Figure 1
Şekil 1. RIBO-seq ve RNA-seq için mRNA örnek hazırlama şemaları. RIBO-seq kitaplığı hazırlanması için RNA, MNase (A) ile sindirilir ve ardından ~28-30 nt uzunluğunda (B) RF boyut seçimi; RNA-seq RNA yalıtılır (C), rRNA (D) tükenmiş ve elde edilen mRNA rastgele değişen uzunluklarda (E) parçalara bölünmüş. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

RIBO-seq ve RNA-seq için numune hazırlama prosedürünün ilk adımları biraz farklıdır (Şekil 1). Ribozomal profilleme için, ribozomlar tarafından korunmayan mRNA moleküllerini bozmak için lizatın belirli bir endonokleaz tarafından sindirilmesi gerekir. Standart protokollerde, elde edilen monozomlar bir sakkaroz yastığı ultrasantrifüjasyonu veya sakkaroz gradyan ultracentrifugation8,14ile kurtarılır. Bu yazıda, bu adımın bakterilerde RIBO-seq için gerekli RF'yi izole etmek için gerekli olmadığını, aynı şekilde ökaryotik hücreler için18, ve poliakrilamid jelden uygun uzunlukta mRNA parçalarının boyut seçiminin yeterli olduğunu gösteriyoruz.

RNA-seq için mRNA, rRNA'nın toplam RNA'dan tükenmesi ile elde edilir - rRNA molekülleri, streptavidin kaplı manyetik boncuklara bağlanan biyotinillenmiş oligonükleotid problarına melezleşir. RRNA-oligonükleotid-boncuk kompleksleri daha sonra bir mıknatıs ile numuneden çıkarılır ve rRNA tükenmiş bir örnek19,20ile sonuçlanır. Saflaştırılmış mRNA molekülleri daha sonra alkali hidroliz ile rastgele parçalanır. Elde edilen mRNA parçalarının yanı sıra ribozomal ayak izleri cDNA kütüphanelerine dönüştürülür ve derin sıralama için hazırlanır (Şekil 2). Bu, alkali hidroliz (mRNA için) ve enzimatik sindirimden (RF için) sonra ihtiyaç duyulan uç onarımını içerir: 3' uçların defosforilasyonu ve ardından 5' uçların fosforilasyonu. Sonraki adımlar adaptör ligasyonu ve Illumina platformunu kullanarak yeni nesil sıralama (NGS) için gereken sıralarla çerçevelenmiş cDNA eklemeleri oluşturmak için ters transkripsiyondur. Kütüphane hazırlığının son aşaması, yapıların bir kanalda çeşitli örneklerin çoklayıcı ve sıralı olmasına izin vermek için örnek özel barkodlarla yükseltildiği ve etiket edildiği bir PCR reaksiyondur. Sıralamadan önce, kütüphanelerin kalitesi ve miktarı çip üzerindeki yüksek hassasiyetli DNA elektroforez ile değerlendirilir. Uygun parametrelere sahip cDNA kitaplıkları daha sonra havuza alınıp sıralanabilir. Sıralama, kitaplık sayısına, gerekli okuma uzunluğuna ve sıralama derinliğine bağlı olarak MiSeq, NextSeq veya HighSeq gibi farklı Illumina platformlarında gerçekleştirilebilir. Sıralamadan sonra biyoinformatik analiz yapılır.

Figure 2
Şekil 2. Kütüphane hazırlığı. Kütüphane hazırlığı, uç onarımını, adaptör ligasyonunu, ters transkripsiyonu ve barkodlama ile amplifikasyonu içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ribozom profilleme, bilimsel soruya göre kolayca değiştirilebilen ve ayarlanabilen evrensel bir yöntemdir. Başlangıçta maya1'dekullanıldı, ancak bakteri hücrelerine uygulandıktan kısa bir süre sonra21 ve fare10, zebra balığı22,meyve sineği 23 ve Arabidopsis thaliana24dahil olmak üzere ökaryotik model organizmalara uygulandı. Ayrıca farklı ribozom türlerini incelemek için de kullanılmıştır: sitoplazmik, mitokondriyal25,26 ve kloroplast27,28. Ökaryotlarda RIBO-seq, başlatma 10 , 11 , 29 , 30 ,31,32,uzama1,10 , 11,31,33,ribozom oyalama 33 ve uygunlukdeğişikliği33 dahil olmak üzere çevirinin belirli yönlerini araştırmak için yaygın olarak uyarlanmış ve rafine edilmiştir. Değişikliklerin çoğu farklı çeviri inhibitörlerinin kullanımını içerir. Bununla birlikte, bakterilerde, gerekli etki mekanizmasına sahip inhibitörlerin azlığı nedeniyle benzer çalışmaların yapılması zor olmuştur34. Bakterilerde en sık kullanılan çeviri inhibitörü, peptidyl transferaz merkezine (PTC) bağlanan ve A bölgesinde aminoasil-tRNA'nın doğru konumlandırılmasını önleyen kloramfenikoldür (CAM). Sonuç olarak, CAM, uzun ribozomların tutuklanmasına yol açan bir peptit bağı oluşumunu önler35. Bakterilerdeki diğer çeviri inhibitörleri tetrasiklin (TET)36, retapamulin (RET)34 ve Onc11237'dir. A-sitedeki tRNA'nın antikon kök döngüsü ile doğrudan örtüşerek ribozom için tRNA doğumunu önleyen TET, başlangıçta CAM tedavisinden elde edilen sonuçları doğrulamak için uygulanmıştır, çünkü her ikisi de çeviri uzamasını engelleyen antibiyotiklerdir38. TET'nin birincil Tİs'i tespit etmesi bulundu, ancak dahili Tİs36'yıortaya koyamadı. RET, bakteriyel ribozom PTC'sinde bağlanır ve A bölgesinde bir uzay aminoasil-tRNA ile müdahale ederek ilk peptit bağının oluşumunu önler. RET uygulamak, hem birincil hem de dahili TISs34'teribozomların tutuklanmasıyla sonuçlanır. Prolin bakımından zengin bir antimikrobiyal peptit olan Onc112, çıkış tüneline bağlanır ve ribozomal A bölgesinde aminoasil-tRNA bağlamasını engeller. Sonuç olarak, Onc112 başlatma komplekslerinin uzama aşaması37'yegirmesini önler.

Ribozom profillemenin sağladığı ana bilgi ribozom yoğunluğu ve mRNA üzerindeki konumlarıdır. Çeşitli büyüme koşullarında çeviri düzeyinde diferansiyel gen ekspresyonunun araştırılması 1,6 , çeviri verimliliğininölçülması 1,38,39 ve ribozomal duraklama10gibi çeviri düzenleme olaylarını tespit etmek için başarıyla uygulanmıştır. RIBO-seq ayrıca, yeni ve / veya çok kısa protein kodlama genlerinin tanımlanmasına yol açan açıklamalı ncRNA, psödojenler ve açıklamalanmamış küçük açık okuma çerçevelerinin (ORF) çevirisini ortaya çıkarmaya izin verir10,12,22,30,37. Bu gibi durumlarda RIBO-seq genom ek açıklamalarını ince ayar yapabilir ve iyileştirebilir. Çevrilmiş ORF'lerin tanımlanmasına ve nicel doğasına yönelik yüksek hassasiyeti ile ribozom profilleme, proteom tayini için veya proteomik çalışmalara yardımcı olmak için bir vekil görevi de edebilir31,34,39. Ribozom profilleme, Tİs'i haritalayarak bilinen proteinlerin N-terminal genişletilmiş ve kesilmiş izoformlarını ortaya koymaktadır10,32. RIBO-seq ayrıca14 , 21,24proteinlerinin ortak çevirisel katlamasını incelemek için uyarlanmıştır. Buyöntem,1 ,10,39 uzama hızlarının veya bireysel kodonların kod çözme hızlarının ölçülmesine olanak tanır 6 veçevirinin nicel modellerinin geliştirilmesine yardımcı olur17. Ribozom profilleme yöntemi ayrıca7, 15,17,frameshifting 40,stop-codon readthrough 21 , sonlandırma/geri dönüşüm kusurları 41,42ve ribozomal konformasyon değişiklikleri33 ökaryotlarda ribozom duraklaması hakkında mekanistik içgörüler sağlayabilir. RIBO-seq ayrıca 16,43ökaryotlarda miRNAs6 ve RNA bağlayıcı proteinler gibi spesifik trans-etkili faktörlerin çeviri üzerindeki etkisini incelemek için uyarlanmıştır. Bununla birlikte, deneysel tasarımın ve RIBO-seq'in elde edilen çözünürlüğünün, elde edilen sıralama verilerinden çıkarabilecek bilgi miktarını belirlediğini kabul etmek önemlidir12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Örnek toplama

  1. Bakteri kültürü hazırlayın. Örnek başına 100 mL'lik bir kültür hacmi öneriyoruz.
  2. Numune toplama için ekipman ve reaktifler hazırlayın: numune başına iki kepçe, steril 0,45 μm karışık selüloz esterleri membran (MCE) filtreleri, 50 mL steril tüpler, sıvı azot, %70 (vol/vol) etanolde 50 mg/mL kloramfenikol (isteğe bağlı). Sıvı azot buharlaşmasına izin vermek ve kapalı tüplerin patlamasını önlemek için 50 mL tüplerin kapağını delin. Scoopulas'ı laboratuvar deterjanı ve% 70 etanol ile arındır.
  3. Filtreleme ekipmanı ve kepçelerden birini bakteri kültürünün büyüme sıcaklığına önceden ısıtır.
    NOT: Huni, fritrasyon tabanı, zemin eklem şişesi ve 47 mm Ø yaylı kelepçeli tamamen cam filtrasyon aparatı öneriyoruz.
  4. Numune toplamadan önce, bakteri kültürüne 100 μg/ mL'lik son konsantrasyona kloramfenikol ekleyin ve 1 dakika kuluçkaya yatırın (isteğe bağlı).
  5. 50 mL steril tüpe sıvı azot dökün ve soğuması için ikinci kepçeyi tüpün içine yerleştirin.
    Dikkat! Sıvı nitrojen, buharlaşma üzerine basınç değişimi nedeniyle kapalı kapların patlamasına neden olabilir. Bunu önlemek için, sıvı azot buharlaşmasına izin vermek için 50 mL tüplerin kapağında birkaç delik oluşturmak gerekir.
  6. Filtrasyon ile hücreleri toplayın. Ortam zardan geçtiğinde filtrelemeyi durdurun, ancak filtrenin tamamen kurumasına izin vermeyin.
  7. Önceden ısınmış bir kepçe kullanarak filtre diskinin hücrelerini hızla kazıyarak bakteriyel peletleri toplayın. Hasat edilen hücrelerle birlikte tüm kepçeyi hemen sıvı nitrojenle dolu 50 mL'lik tüpe yerleştirin. Hasat edilen pelet tamamen sıvı nitrojenle kaplanmalıdır.
  8. Peletin iyice donmasına izin verin ve daha önce soğutulmuş ikinci bir kepçe kullanarak donmuş hücreleri yerinden sökün. Delinmiş kapağı kapatın ve tüpü -80°C'ye aktarın.
    NOT: Her numune hasadından sonra kepçeleri dezenfekte edin.

2. Hücre lizisi

  1. Lysates için 10 mM Tris pH 8, DNase I ve 1,5 mL reaksiyon tüplerinde 0,1 M GMP-PNP hazırlayın ve buzda tutun. Santrifüjü 4 °C'ye soğutun.
  2. Lizis tamponu hazırlayın (20 mM TRIS pH 7.6, 10 mM MgAcet, 150 mM KAcet, %0.4 TRITON X-100, 6 mM β-mercaptoethanol, 5 mM CaCl2 ve isteğe bağlı 1 mM kloramfenikol). Numune başına lizis tamponunun Aliquot 500 μL'si 1,5 mL reaksiyon tüplerine yerleştirin ve buza yerleştirin.
  3. Harcı ve pestleyi bir laboratuvar deterjanı ve% 70 etanol ile arındır ve kurutun. Harcın içine sıvı azot dökerek serin harç ve pestle.
  4. Donmuş peleti önceden soğutulmuş harcın içine aktarın ve bir toz haline getirin. Bir spatula ile yaklaşık 1 hacim alüminyum oksit ekleyin ve taşlamaya devam edin. Gerektiğinde sıvı azot dökerek harcı, pestleyi ve hücreleri serin tutun, harcın içeriğinin çözülmesine izin vermeyin.
  5. Lizis tamponu kullanmadan hemen önce, GMP-PNP ve DNase I'i lizis tampon aliquot'un içine sırasıyla 2 mM ve 100 U/mL'lik son konsantrasyona ekleyin. Çözeltiyi hücreler ve alüminyum oksit ile harcın içine aktarın ve taşlamaya devam edin. Öğütürken lysate'nin yavaşça çözülmesini bekleyin ve karışımı önceden soğutulmuş 1,5 mL reaksiyon tüpüne aktarın ve hemen buza yerleştirin.
  6. Santrifüj 4 °C'de 5 dakika boyunca 20 000 x g'da lilalar. Süpernatantları yeni, önceden soğutulmuş 1,5 mL reaksiyon tüplerine aktarın ve buzda tutun.
  7. Her numunedeki RNA konsantrasyonu bir NanoDrop ile ölçün. Örneklerin 1:10 seyreltilmesini ve nükleaz içermeyen suda 1:10 lizis tamponunun seyreltilmesini boş olarak kullanın.
    NOT: Kloramfenikolün 260 nm'de önemli emilim gösterdiğini unutmayın.
  8. Her bir lisatı iki bölüme ayırın: biri RIBO-seq (0,5 - 1 mg RNA) ve ikincisi RNA-seq (geri kalanı) için.
  9. RNA-seq için numuneleri, üreticinin protokolüne göre piyasada bulunan bir RNA temizleme kiti kullanarak temizleyin.
    NOT: Zymo RNA Clean & Concentrate -25 kitini kullanmanızı öneririz (bkz. Malzeme Tablosu). Ayrıca, kısa RNA parçalarının saflaştırma verimliliğini artırmak için ribozomal ayak izleri ve parçalanmış mRNA için numune ve Bağlama Tamponu karışımına 4,5 hacim etanol (numune hacmine kıyasla) eklemenizi öneririz.
  10. RNA-seq için tasarlanan numuneleri -80 °C'de saklayın. RNA-seq yordamı 5.

3. RIBO-seq için örneklerin MNase sindirimi

  1. 1 mg RNA'ya 10 mM Tris pH 8'de 3,8 μL 187,5 U/μL MNase ekleyin ve toplam 500 μL hacmine lizis tamponu ile üst üste yerleştirin.
  2. 25 °C, 300 RPM'de bir termokserde 45 dakika kuluçkaya yaslayın.
  3. Numuneleri piyasada bulunan bir RNA temizleme kiti ile temizleyin (adım 2.9'da olduğu gibi).
  4. RIBO-seq örneklerini -80 °C'de (DUR noktası) saklayın veya boyut seçimine geçin.

4. Poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) ve RIBO-seq için örneklerin boyut seçimi

  1. 8 M üre ile % 15 poliakrilamid-TBE jeli hazırlayın ve TBE tamponlu bir tanka yerleştirin. 200 V sabit voltajda en az 10 dakika ön koşu yapın.
  2. Numuneleri TBE-Üre Numune Tamponu ile karıştırın, 95 °C'de 1 dakika denatüre edin ve hemen buza yerleştirin.
  3. Bir şırınna kullanarak jel kuyularına TBE tamponu enjekte ederek üreyi yıkayın. Her numuneyi ayırmak ve çapraz kontaminasyonu önlemek için numuneleri aralarında bir kuyu boşluğu bırakarak yükleyin. İşaretleyici olarak 29 nt oligonükleotid ve 26 nt ve 32 nt oligonükleotid karışımı kullanın. Elektroforezi 180 V sabit voltajda çalıştırın.
  4. Gecelik inkübasyon için steril tampon hazırlayın (5 mM EDTA, 10 mM NaOAc pH 5).
  5. Elektroforezden sonra, jeli bir SYBR Altın banyosunda yaklaşık 2-3 dakika lekeleyin ve jeli nükleaz içermeyen suyla durulayın.
  6. Steril iğneler veya jiletlerle 26 ila 32 nt arasında jel parçaları çıkar ve jel parçalarını her numune için ayrı 1,5 mL tüplere yerleştirin. Numuneler arasındaki iğneyi veya jile bıçağı değiştirin.
  7. Her reaksiyon tüpüne 200 μL gecelik inkübasyon tamponu ekleyin.
  8. Numuneleri bir termomikserde bir gecede 10 °C, 1000 RPM'de kuluçkaya yatırın.
  9. Ertesi gün, örnekleri adım 2.9'daki gibi temizleyin. Ayak izlerini 80 μL çekirdeksiz suda boşaltın.
  10. Numuneleri -80 °C'de saklayın. RIBO-seq prosedürü 7.

5. RNA-seq için örneklerden rRNA tükenmesi ile bakteriyel mRNA'nın saflaştırılması

  1. RRNA'yı bakteriyel mRNA arıtma kiti (örneğin, Invitrogen MICROBExpress) ile numunelerden çıkarın. Üreticinin protokolünü izleyin.
  2. Örnekleri adım 2.9'daki gibi temizleyin. mRNA'yı 50 μL çekirdeksiz suda boşaltın.
  3. RNA-seq için numuneleri -80 °C'de (DUR noktası) saklayın veya alkalin parçalanmasına devam edin.

6. RNA-seq için örneklerin alkali parçalanması

  1. Alkali hidroliz tamponu hazırlayın (0,1 M NaHCO3'ün220 μL'si, 0,1 M Na2CO3'ün 30 μL'si ve 0,5 M EDTA'nın 1 μL'si karıştırın). 1 hacim (50 μL) alkalin tamponu numunenin 1 hacmi (50 μL) ile karıştırın ve 95 °C'de 25 dakika kuluçkaya yatırın.
  2. Reaksiyonun durdurulması için 5 μL 3 M NaOAc pH 5.5 ekleyin.
  3. Numuneleri adım 2.9'daki gibi temizleyin ve numuneleri 80 μL çekirdeksiz suya boşaltın.
  4. Olası DURMA noktası: RNA-seq örneklerini -80 °C'de saklayın. Ancak, gereksiz donma ve çözülmeyi önlemek için doğrudan 7.

7. Hem RNA hem de RIBO-seq için numunelerin defosforilasyonu ve fosforilasyonu

  1. Her numuneye 10 μL 10x reaksiyon tamponu PNK ve 5 μL T4 PNK ekleyin. 3' uçları defosforilasyon yapmak için 37 °C'de 1,5 saat kuluçkaya yatırın.
  2. 3 μL 1 mM ATP ekleyin ve 5' uçlarını fosforilize etmek için 1 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
  3. Numuneleri adım 2.9'daki gibi temizleyin, 30 μL çekirdeksiz suda elüte edin.
  4. Numuneleri -80 °C'de saklayın.

8. Illumina için NEBNext Multiplex Küçük RNA Kütüphanesi Hazırlık Seti kullanılarak kütüphane hazırlığı

  1. 6 μL çekirdeksiz suda 100-1000 ng giriş RNA'sı (elde edilen mRNA parçaları ve ribozomal ayak izleri) hazırlayın ve 1 μL 3' SR Adaptör ekleyin. Üreticinin protokolüne göre kuluçkaya yatır.
  2. 10 μL 3' Ligasyon Reaksiyon Tamponu (2X) ve 3 μL 3' Ligasyon Enzim Karışımı ekleyin ve üreticinin protokolünün belirttiği gibi 25 °C'de 1 saat yerine 2,5 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  3. Ters Transkripsiyon Astarını değiştirilmiş bir programla üreticinin protokolüne göre melezleyin: 75 °C'de 5 dakika, 37 °C'de 30 dakika ve 4 °C'de tutun.
  4. 5' SR Adaptör'üni lige edin. Üreticinin protokolünü tek bir değişiklikle izleyin: kuluçkayı 25 °C'de 1 saat yerine 2,5 saat boyunca 37 °C'de gerçekleştirin.
  5. Üreticinin protokolüne göre Ters Transkripsiyon gerçekleştirin.
  6. Olası DURMA noktası: Sentezlenmiş cDNA'ları içeren numuneleri 70 °C'de 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırarak ters transkriptazı devre dışı bırakın ve -80 °C'de saklayın. Ancak, numunelerin gereksiz yere dondurulmasını ve çözülmesini önlemek için doğrudan sonraki adımlara geçmenizi öneririz.
  7. Her cDNA kütüphanesinin yarısını yedek olarak -80 °C'de saklayın.
  8. Üreticinin protokolüne göre PCR amplifikasyonu gerçekleştirin. Reaksiyon karışımının yarısını kullanın. Elde edilen kütüphaneleri -80 °C'de saklayın.

9. PAGE kullanarak cDNA kitaplıklarının boyut seçimi

  1. %6 poliakrilamid-TBE jeli hazırlayın ve TBE tamponlu bir tanka yerleştirin. 200 V sabit voltajda en az 10 dakika ön koşu yapın.
  2. Numuneleri Jel Yükleme Boyası, Mavi (6X) ile karıştırın ve jel üzerine yükleyin. Merdiven olarak Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest kullanın. Başlangıçta, DNA'nın jel içine girmesine izin vermek için 120 V sabit voltajda elektroforezi çalıştırın ve ardından voltajı 180 V'a değiştirin.
  3. Elektroforez bittiğinde, jeli bir SYBR Gold banyosunda yaklaşık 2-3 dakika lekeleyin ve jeli nükleaz içermeyen suyla durulayın.
  4. Kütüphaneleri içeren tüketim jeli parçaları. RNA-seq örnekleri için 135-180 nt, RIBO-seq için ise 135-170 nt arasında tüketim. Steril iğne veya jilet kullanın ve eksiz jel parçalarını ayrı 1,5 mL reaksiyon tüplerine yerleştirin. Numuneler arasında iğneyi veya jile bıçağı değiştirmeyi unutmayın.
    NOT: ILLUMINA için NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set'in adaptörleri ve barkodu, alt eksizyon kesmesini belirleyen toplamda 119 nt'ye sahiptir.
  5. Her eksiz jel parçasına 100 μL çekirdeksiz su ekleyin.
  6. Jel parçalarını bir termomikserde bir gecede 10 °C, 450 RPM'de kuluçkaya yatırın.
  7. CDNA kütüphanelerini üreticinin protokolüne göre ticari dna temizleme kiti ile temizleyin ve konsantre edin.
    NOT: Zymo DNA Clean & Concentrate -5 kitini kullanmanızı öneririz (bkz. Malzeme Tablosu).
  8. Saflaştırılmış cDNA kitaplıklarını -80 °C'de saklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada sunulan örnek sonuçlar, WT Bacillus subtilis hücrelerinin sporulating çeviri düzenlemesini inceleyen bir çalışmada elde edilmiştir. Gecekültürleri, 100 mL zengin ortamda 0,1'e eşit OD 600'e seyreltildi ve OD600 0,5-0,6'ya ulaşana kadar kuvvetli sarsıntı ile 37 °C'de kuluçkaya yatırıldı. Zengin ortam daha sonra sporülasyon sürecini teşvik etmek için minimum ortamla değiştirildi ve kuluçka dört saate kadar devam etti. Hücreler her saat T0 ile başlayarak hasat edildi - sporülasyon indüksiyonu - beş zaman noktası ile sonuçlandı. Hasatdan bir dakika önce, kültürler yukarıdaki protokolde açıklandığı gibi kloramfenikol ile muamele edildi. Hücreler, 0,45 μm karışık selüloz esterleri membran (MCE) filtreleri kullanılarak ve sıvı nitrojende flaş dondurularak önceden ısıtılan bir cam filtrasyon sisteminde filtrasyon ile toplanmıştır.

Lysate elde edilen ribonik asit miktarı büyüme koşullarına, kültür hacmine ve yoğunluğa bağlıdır. Protokolümüzün ardından, bakteri kültürünün 100 mL'si (Bacillus altyazısı) ortalama 1-4 mg RNA verir. Yukarıda açıklanan deneyden elde edilen lysates örnekleri Tablo 1'de gösterilmiştir.

RNA konsantrasyonu [ng/μL] RNA miktarı [mg] A260/A280 A260/A230
WT0 5845 3.21 1.57 0.83
WT1 6275 3.45 1.58 0.79
WT2 3525 1.94 1.38 0.56
WT3 3717 2.04 1.37 0.61
WT4 1653 0.91 1.11 0.43

Tablo 1. B. subtilis lysates'in temsili örneklerinde RNA konsantrasyonu ve miktarı. Tablo, sporülasyon indüksiyonundan (0) önce hasat edilen vahşi tip (WT) B. subtilisten ve sporülasyon indüksiyonundan bir saat (1), iki (2), üç (3) veya dört (4) saat sonra alınan örnekleri içerir. Lizis, kloramfenikol içeren 550 μL lizis tamponu ile gerçekleştirildi. Sporülasyon ilerledikçe elde edilen RNA miktarının azaldığı fark edilebilir.

RNA miktarı 1 mg'dan düşük olduğunda, RIBO-seq için 1-0.5 mg yerine 0.25 mg RNA kullanılır ve daha sonra sırasıyla MNase miktarı ayarlanır. Nükleaz sindirimi sonrası temsili RNA miktarı ve konsantrasyonu Tablo 2'degösterilmiştir. Sindirim ve temizlikten sonra ortalama RNA miktarı 0,5 mg RNA girişine göre 50 μg'dir.

RNA konsantrasyonu [ng/μL] RNA miktarı [μg] A260/A280 A260/A230
WT0-R 1015 50.75 2.12 1.84
WT1-R 1157.4 57.87 2.10 2.19
WT2-R 847.2 42.36 2.10 2.00
WT3-R 983.6 49.18 2.09 2.16
WT4-R 206 10.30 2.13 1.00

Tablo 2. RIBO-seq için temsili örneklerin nükleaz sindirimi sonrası RNA miktarı ve konsantrasyonu. Tablo, sporülasyon indüksiyonundan (0) önce hasat edilen vahşi tip (WT) B. altyazısından ve sporülasyon indüksiyonundan sonra bir saat (1), iki (2), üç (3) veya dört (4) saat örnekleri içerir; "R" harfi RIBO-seq için örnekleri ifade eder. WT4-R örneğinin RNA konsantrasyonu düşük olduğu için 0.25 mg RNA sindirilirken, kalan numuneler için 0.5 mg RNA ribozomal ayak izi üretimi için kullanıldı. Sindirim için MNase miktarı WT4-R'de 0.25 mg RNA için 178.125 U ve diğer örneklerde 0.5 mg RNA için 356.25 U idi. Sindirimden sonra numuneler ticari RNA temizleme kiti ile temizlendi ve NanoDrop ile ribonik asit konsantrasyonu ölçüldü.

MNase sindirimi sonrasında PAGE yardımıyla boyut seçimi yapılır. Sindirilen örneklerle birlikte %15 TBE-üre poliakrilamid jel örneği Şekil 3'tegösterilmiştir. 26 ila 32 nt arasındaki jel parçaları steril bir jiletle çıkarıldı ve gece boyunca kuluçka tamponunda inkübe edildi. Ertesi gün, ribozomal ayak izleri ticari RNA temizleme kiti ile temizlendi.

Figure 3
Şekil 3. MNase sindirimi sonrası temsili örneklerle %15 TBE-üre poliakrilamid jel. Şekil, sporülasyon indüksiyonundan (0) önce hasat edilen vahşi tip (WT) B. altyazılarından ve sporülasyon indüksiyonundan sonra bir saat (1), iki (2), üç (3) veya dört (4) saat örnekleri içerir; "R" harfi RIBO-seq için örnekleri ifade eder. Jel kuyularına sırayla 15 μL denatüre numune yüklendi: WT2-R, WT3-R, WT4-R, WT0-R, WT1-R ve kalan hacim yedek olarak -80 °C'de depolandı. İşaretleyici olarak 29 nt oligonükleotid ve 26 nt ve 32 nt oligonükleotid karışımı kullanılmıştır. Elektroforezi yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirildi ve jel bir SYBR Gold banyosunda lekelendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Nükleaz sindirimine paralel olarak, RNA-seq için lisatlar ticari RNA temizleme kiti ile temizlendi ve elde edilen RNA konsantrasyonları NanoDrop ile ölçüldü. Temsili sonuçlar Tablo 3'te sunulmuştur. Temizlik sonrası ribonik asit miktarı 40-500 μg'ye düştü.

RNA konsantrasyonu [ng/μL] RNA miktarı [μg] A260/A280 A260/A230
WT0-m 10274.1 513.70 2.14 2.35
WT1-m 10118.3 505.92 2.12 2.33
WT2-m 5599.7 279.98 2.15 2.29
WT3-m 6562.2 328.11 2.08 2.31
WT4-m 757 37.85 2.01 1.95

Tablo 3. RNA saflaştırma sonrası RNA-seq için numunelerin RNA miktarı ve konsantrasyonu. Tablo, sporülasyon indüksiyonundan (0) önce hasat edilen vahşi tip (WT) B. altyazısından ve sporülasyon indüksiyonundan sonra bir saat (1), iki (2), üç (3) veya dört (4) saat örnekleri içerir; "m" harfi RNA-seq (mRNA) örneklerini ifade eder.

RNA-seq için numunelerin elde edilen RNA konsantrasyonları, rRNA tükenmesi için RNA girişini tanımlamak için kullanılmıştır. Her RNA-seq örneğinden 8 μg RNA, üreticinin protokolüne göre MICROBExpress bakteriyel mRNA arıtma kiti (bkz. Malzeme Tablosu)ile kullanıldı ve daha sonra ticari RNA temizleme kiti ile temizlendi. rRNA tükenmesinin temsili sonuçları Tablo 4'te gösterilmiştir.

RNA konsantrasyonu [ng/μL] A260/A280 A260/A230 RNA miktarı [μg]
WT0-m 62.7 1.99 1.75 3.1
WT1-m 59.3 2.00 2.16 2.9
WT2-m 93.7 1.97 1.69 4.7
WT3-m 68.3 1.99 2.33 3.4
WT4-m 85.0 1.97 2.00 4.2

Tablo 4. RRNA tükenmesi sonrası temsili RNA miktarı ve konsantrasyonu. Tablo, sporülasyon indüksiyonundan (0) önce hasat edilen vahşi tip (WT) B. altyazısından ve sporülasyon indüksiyonundan sonra bir saat (1), iki (2), üç (3) veya dört (4) saat örnekleri içerir; "m" harfi RNA-seq için örnekleri ifade eder. RNA-seq için numunelerden elde edilen 8 μg RNA, rRNA tükenmesi için kullanıldı ve daha sonra ticari bir RNA temizleme kiti ile temizlendi.

Daha sonra, elde edilen mRNA alkali hidroliz ile parçalandı ve protokolde açıklandığı gibi ticari bir kit ile temizlendi. Parçalanmış mRNA ve ribozomal ayak izleri yukarıdaki protokole göre 3' uçlarında defosforilasyon ve 5' uçlarında fosforilasyon yapılmıştır. Örnekler daha sonra protokolde açıklandığı gibi Illumina dizilimi için cDNA kitaplıkları oluşturmak için kullanıldı. Şekil 4,elde edilen kütüphanelerle %6'lık bir poliakrilamid jel örneği göstermektedir. RNA-seq için 135-180 nt ve RIBO-seq için 135-170 nt aralığındaki jel parçaları steril jiletlerle çıkarıldı ve çekirdeksiz suda bir gecede inkübe edildi. Kütüphaneler ticari DNA temizleme kiti ile temizlendi ve agilent 2100 Biyoanalyzer kullanılarak çip üzerinde yüksek hassasiyetli DNA elektroforezi ile kalite ve miktar değerlendirildi.

Figure 4
Şekil 4. Boyut seçiminden önce ve sonra cDNA kütüphanelerinin %6 poliakrilamid jeli. Merdiven olarak Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest kullanıldı. Jel içine aşağıdaki sırayla 25 μL numune yüklendi: üç RIBO-seq kütüphanesi ve altı RNA-seq kütüphanesi. Kalan numune hacimleri yedek olarak -80 °C'de depolandı. Şekil, sporülasyon indüksiyonundan bir saat (1), iki (2), üç (3) veya dört (4) saat sonra hasat edilen vahşi tip (WT) B. altyazılarından örnekleri içerir; "R" harfi RIBO-seq için örnekleri, "m" harfi ise RNA-seq örneklerini ifade eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Agilent 2100 Biyoanalyzer'den elde edilen sanal jel görüntüleri ve elektroferogram örnekleri Şekil 5'te gösterilmiştir. RIBO-seq kitaplıklarını temsil eden bantlar ve tepeler, RNA-seq kitaplıklarını temsil eden bu kitaplıklara kıyasla daha dar ve daha iyi tanımlanmıştır. Çip üzerindeki elektroforezlere göre, kütüphaneler beklenen bir kütüphane boyutu olan yaklaşık 150 bp uzunluğundadır. Kitaplık hazırlamada kullanılan bağdaştırıcılar ve barkod 119 nt uzunluğundadır ve kesici uçlar 29-30 nt uzunluğundadır (RIBO-seq için) veya 25 ila 50 nt (RNA-seq için) arasında bir aralıktadır. RIBO-seq kütüphanelerinden elde edilen 200 bp'ye daha yakın ek tepeler, sıralamadan elde edilen veriler kırpıldığında ve rRNA/ tRNA filtrelendiğinde biyoinformatik analiz sırasında atılabilen PCR eserlerini gösterebilir. Ortalama DNA miktarı 32 ng dir ve yeni nesil sıralama için yeterli miktarda malzeme sağlar.

Figure 5
Şekil 5. Çip üzerinde yüksek hassasiyetli DNA elektroforezinden elektroferogramlar ve sanal jel görüntüleri örnekleri. Şekil, sporülasyon indüksiyonundan (0) önce hasat edilen vahşi tip (WT) B. altyazılarından ve sporülasyon indüksiyonundan sonra bir saat (1), iki (2), üç (3) veya dört (4) saat örnekleri içerir; "R" harfi RIBO-seq kitaplıklarını, "m" harfi ise RNA-seq kitaplıklarını ifade eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Çip üzerindeki elektroforez tarafından kalite kontrolünden sonra, kütüphaneler Illumina'nın NextSeq500 platformunda tek uçlu 50 bp dizileme için birikti (kanal başına en az 350 mln okuma ile kanal başına 10 kütüphane). Sıralama, RNA-seq kütüphaneleri için örnek başına 30-57 milyon okuma ve RIBO-seq kütüphaneleri için örnek başına 30-50 milyon okuma sağladı. Adaptörlerin ve düşük kalite dizilerinin kırpılması, RNA-seq örnekleri için örnek başına 24-47 mln okuma ve RIBO-seq örnekleri için örnek başına 25-50 mln okuma ile sonuçlandı. STAR44ile gerçekleştirilen haritalama, RNA-seq örnekleri için örnek başına 2,4-9,6 milyon benzersiz eşlemeli okuma (toplam okuma sayısının%8-16,8'ini oluşturur) ve 2,3-10,4 milyon benzersiz eşlenen okuma (%7,7-22,1) elde etti. RIBO-seq örnekleri için. Elde edilen veriler FastQC45ile kalite kontrolü kontrol edildi. FastQC tarafından kırpılan diziler için üretilen kalite çizimlerine örnekler Şekil 6'da gösterilmiştir. RIBO-seq için <32 nt ve RNA-seq için <50 nt olan ilgi süresinin dizileri çok iyi kalite sundu. GC içeriğinin çizimleri ve tüm kırpılmış diziler üzerindeki sıra uzunluklarının dağılımları örnekleri Şekil 7'de gösterilmiştir. RIBO-seq kütüphanesinin GC dağıtım grafiğinde% 72'lik ek zirve, rRNA filtrasyon46 , 47,48ile biyoinformatik analiz sırasında giderilebilen rRNA kontaminasyonunu gösterebilir. Sıra uzunlukları dağılımı RIBO-seq kitaplıkları için çok dardır, RNA-seq kitaplıkları için uzunluk dağılımı daha geniştir ve 15 ile 50 nt arasında değişir.

Figure 6
Şekil 6. Kırpmadan sonra RIBO-seq ve RNA-seq kitaplıkları için tüm temellerde kalite puanlarının kutu ve bıyık çizimlerine örnekler. Şekil, sporülasyon indüksiyonundan (0) önce hasat edilen vahşi tip (WT) B. subtilisten ve sporülasyon indüksiyonundan dört (4) saat sonra alınan örnekleri içerir; "R" harfi RIBO-seq örneklerini, "m" harfi ise RNA-seq örneklerini ifade eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7. GC içeriğinin çizimleri ve kırpmadan sonra RIBO-seq ve RNA-seq kitaplıkları için tüm dizilerin sıra uzunluğu dağılımı örnekleri. Şekil, sporülasyon indüksiyonundan dört (4) saat sonra hasat edilen vahşi tip (WT) B. subtilisten örnekleri göstermektedir; "R" harfi RIBO-seq için örneğe, "m" harfi ise RNA-seq örneğine başvurur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

RIBO-seq verilerinin seçilen uzunluğun rastgele mRNA parçaları yerine gerçek ribozomal ayak izleri hakkında bilgi sağlayıp sağlamadığını doğrulamak için RIBO-seq veri analizi49için bir web sunucusu olan RiboToolkit'i kullanarak RIBO-seq ve RNA-seq'ten gelen sıralama verilerini karşılaştırdık. Ribo-seq verileri, RNA-seq verilerinde gözlenmeyen Şekil 8A'dagösterildiği gibi, RF'nin başlangıç ribozomlarına ve karakteristiğine karşılık gelen üçüz periyodikliği ve uzun, dar bir tepe gösterir (Şekil 8B). Ayrıca, kodlama dizilerindeki (CDS) RF ve mRNA parçalarının ortalama kapsama profillerini gösteren metagene grafiği, beklendiği gibi RIBO-seq veri kümesindekiCDS'lereeşlenen okumaların daha yüksek bir oranını ortaya koydu.

Figure 8
Şekil 8. Metagene periyodiklik çizikleri ve CDS'lerdeki RF ve mRNA parçalarının ortalama kapsamı. Metagene profilleri ribotoolkit, entegre bir web sunucusu49ile elde edildi. CDS uzunluğu 1 değerine normalleştirildi ve her CDS 100 eşit depo gözüne bölündü. Şekil, sporülasyon sonrası indüksiyondan bir (1) saat sonra hasat edilen vahşi tip (WT) B. subtilisten örnekleri göstermektedir; "R" harfi RIBO-seq için örneğe, "m" harfi ise RNA-seq örneğine başvurur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Burada sunulan RIBO-seq protokolünün standart RF kurtarma yöntemiyle (sakkaroz gradyan ultrasantrifüjleme) elde edilen sonuçlara benzer sonuçlar verip vermediğini karşılaştırmak için, iki yöntemi izleyerek hazırlanan kütüphanelerden gelen sıralama sonuçlarını paralel hale getirdik. WT B. subtilis'te sporülasyon sırasında çeviri düzenlemesini araştıran deneyler, sunulan RIBO-seq protokolüne göre ve sakkaroz gradyan ultrasantrifüjasyonu ile monozom kurtarmayı içeren standart protokole göre gerçekleştirildi. İki deneyden elde edilen ribozom kapsama profillerinin sonuçları Şekil 9'da gösterilmiştir. Eşlenen RF'lerin görselleştirilmesi iki deney arasında çok benzerdir ve biyoinformatik analizde benzer sonuçlar verdi.

Figure 9
Şekil 9. Elde edilen RF'nin görselleştirilmesi genom üzerinde eşlendi. Şekil, sporülasyon indüksiyonundan dört saat sonra hasat edilen ve standart protokole (WT4-R-s, üst panel) veya sunulan protokole (WT4-R, alt panel) göre hazırlanan B. subtilis tipinden elde edilen RF'yi içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ribozom profillemenin temel teknik zorluğu, belirli bir fizyolojik ilgi durumunda mRNA'larda ribozomların bir anlık görüntüsünü yakalamak için çeviriyi hızla engelleme ihtiyacıdır. Bunu başarmak için, çeviri inhibitörleri, sıvı nitrojende hızlı hasat ve flaş dondurma yaygın olarak kullanılır. Antibiyotik uygulamak isteğe bağlıdır, çünkü eserlere neden olabilirler. Kloramfenikol, bakteriyel RIBO-seq'te uzun ribozomları tutuklamak için yaygın olarak kullanılan bir ilaçtır. Bununla birlikte, başlatmayı engellemez, çeviri başlatma sitesinin aşağı akışında yaklaşık altı kodon hakkında ribozom birikimine neden olur14. Ayrıca, peptidyltransferaz reaksiyonunu inhibe etme yeteneği ribozomal P ve A bölgesi substratlarının doğasına bağlı olabilir. Muhtemelen, CAM ribozomları Gly, Ala, Ser, Cys veya Thr ile birlikte17,38,50 nascent peptidinin sondan bir önceki amino asidi olarak daha etkili bir şekildetutuklar. Bu, deneysel tasarım ve biyoinformatik analiz sırasında, özellikle ribozomal duraklama17'yiincelerken dikkate alınmaya değer. CAM'ın ayrıca bir stop codon okumasını teşvik ederek veçerçeve 51'ideğiştirerek çeviri doğruluğunu etkilediği gösterilmiştir. Yine de, CAM inhibisyonu tipik RIBO-seq araştırması14 için nispeten hızlı ve yeterlidir ve yanlış şirketleşmeyi teşvik etmez51. Antibiyotiklerin neden olduğu bazı eserler ilaç miktarı artırılarak önlenebilir9. Protokolümüzde uygulanan CAM konsantrasyonu RIBO-seq deneylerinde kullanılan tipik miktardır7,14,21, ancak konsantrasyon farklı mikroorganizmalar için değişebilir ve numune hasatı öncesinde optimize edilmelidir. Çeviri inhibitörlerinin uygulanmasından kaynaklanan eserlerin ortaya çıkma olasılığı nedeniyle, araştırma sorusu için gerekli değilse ve hızlı hasat mümkünse inhibitör tedavisinden kaçınılması önerilir14. Hızlı hücrelerin toplanması, özellikle inhibitör tedavisi olmadan yapılırsa çok önemlidir, çünkü uzun süreli hasat, değişen çevre koşullarına bir yanıt olarak polizom kaybına ve / veya teretomda değişikliğe neden olabilir14. Bu nedenle, filtrasyonun bir hasat yöntemi olarak kullanılmasını öneririz, çünkü sıcaklık ve / veya sarsıntı dahil olmak üzere kültür büyümesi ile aynı veya benzer koşullar altında gerçekleştirilebilir. Filtre yüzeyinde toplanan filtrasyon sırasında hücreler sürekli olarak büyüme ortamı ile yıkanır, hücre yoğunluklarında, oksijenlenmede ve amino asitlerin ve diğer besin maddelerinin seviyesinde kaymaları algılamalarını engeller14. Filtrasyon daha yumuşaktır ve kültürün yoğunluğu orta ise santrifüjlemeden daha hızlı olabilir, aksi takdirde çok sayıda hücre filtre gözeneklerini tıkayabilir ve işlemi yavaşlatabilir. Uzun süreli filtrasyon olasılığı varsa, kültürün bir çeviri tutuklaması ile sonuçlanan ve hasat süresini uzatmaya izin veren bir kloramfenikol ön tedavisini öneririz. Filtre tıkanması nedeniyle filtrasyonun tamamlanması zorlaşırsa, filtrasyonun durdurulmasını, fazla kültürün kaldırılmasını ve filtrede toplanan kültürün flaş dondurma kısmının dondurulmasını öneririz. RIBO-seq yapmak için 50 mL yoğun bakteri kültürünün yeterli olduğunu gözlemledik. Sıvı nitrojendeki hücrelerin daha sonra flaş dondurması, çeviriyi hemen durdurmak için en evrensel ve etkili yaklaşımdır8,21,52.

Ribonükleaz sindirimi kaliteli RF elde etmek için gereken kritik bir adımdır. Ribozomal alt ünülitler sindirilebilen, ribozom bütünlüğünü bozan, rRNA kontaminasyonuna neden olan ve RF44'üyok eden RNA moleküllerinden oluştuğu için doğru enzimin seçilmesi önemlidir. Başlangıçta, RNase I ökaryotlarda mRNA ve RF neslinin sindirimi için kullanıldı1. Bu enzim bakterilerde inaktif göründüğünden, Staphylococcus aureus21'denbir mikrokoksal çekirdek (MNase) ile değiştirildi. Daha sonra RNASE I'in aslında bakteri örneklerinin sindirimini gerçekleştirebildiği gösterildi, ancak MNase bu amaç için yaygın olarak kullanılmaya devam ediyor53. MNase'nin dezavantajı, A veya T'ye 30 kat artan proksimal olan katalitik aktivitesinin sıra önyargısında yatmaktadır, bu da 5′ uçta A veya T ile başlayan mRNA parçalarının% 80'ine neden olan14. Bununla birlikte, bu, uzunluktaki varyasyonun çoğunun RF'nin 5′-ucunda meydana geldiği gözlemi ile aşılmıştır ve ribozom yoğunluğunun 3′-ucuna atanması ribozom pozisyonu hakkında kesin ve doğru bilgi verir7. MNase aktivitesi enzim konsantrasyonu, pH ve sindirim süresi tarafından etkilenir ve her yeni MNase grubu için belirlenmelidir. Artan nükleaz aktivitesi rRNA kontaminasyonunun artmasına neden olurken, aktivitenin azalması ribozomal ayak izlerinin daha az doğru bölünmesine neden olur. Bu, boyut seçici jel saflaştırma prosedüründe RF'nin genel verimini azaltabilir ve mRNA14'tekiribozom pozisyonları hakkında daha az doğru bilgi sağlayabilir. Bu nedenle, gerekli miktarda MNase dikkatlice belirlenmelidir. Deneylerimiz için 1 mg RNA başına 712,5 U mikrokoksal çekirdek uygularken, literatürde bildirilen konsantrasyon 50 U38, 450 U34, 1000 U14 ve 1500 U15 , 21,36 her 1 mg RNA arasında değişmektedir. Yukarıda belirtildiği gibi, MNase aktivitesi için kalsiyum iyonlarının varlığını gerektirir. Standart protokollerde EGTA, magnezyum54'ekıyasla kalsiyuma daha yüksek bir benzeşime sahip olan divalent iyonları için bir şelatlama maddesi, kalsiyumu bağlayarak ve MNase'yi inaktive ederek sindirimi durdurmak için kullanılır. Bununla birlikte, protokolümüzde çekirdekle inkübasyondan hemen sonra RNA temizleme kiti kullanılarak sindirim reaksiyoni durdurulur.

Standart protokollerde, bir sonraki adım, bir sakkaroz yastığı ultrasantrifüjasyonu veya sakkaroz gradyan ultracentrifugation8,14ile ribozomların geri kazanımıdır. Sakkaroz gradyan santrifüjleme, monozomların alt biralardan ve politekozlardan seçici olarak ayrılmasını sağlar, ancak gradyan karıştırıcı ve ultracentrifuge gibi belirli ekipmanlar gerektirir. Ayrıca, bu yöntemin verimi 500-700 μL lysate ile sınırlıdır. Öte yandan, sakkaroz yastık ultrasantrifüjleme çoğu ribozomal parçacık pelet, bir düzine mililitreden fazla lizat işlenmesini sağlar ve ihtiyaç duyulan enstrümantasyon açısından daha az talepkardır. Ancak, her iki yaklaşım da en az 4 ila 6,5 saat14 gerektirdiği ve ultra merkezi bir şey gerektirdiği için uzundur. Protokolümüzde bu adım, %15 TBE-üre poliakrilamid jelde doğrudan boyut seçimine devam ederken atlanır. Elektroforez, RNA'nın ikincil yapılarını ortaya çıkarmak ve intramoleküler etkileşimleri önlemek için denatüre koşullar altında gerçekleştirilir. Dar bir ribozomal ayak izini yok etmek için işaretleyici olarak 26 nt, 29 nt ve 32 nt oligonükleotid kullanıyoruz. Gerçek RF'nin konsantrasyonunun, rastgele olarak kabul edilen yanlış RF ile potansiyel kontaminasyonu önemli ölçüde aştığını varsayıyoruz, bu aralıktaki ribozom mRNA veya rRNA parçaları tarafından korunmasız. Protokolümüz kullanılarak elde edilen sonuçlar, seçilen boyut aralığında RF'nin zenginleştirilmiş bir kısmını gösterdi. Agilent 2100 Bioanalyzer ile yapılan kalite kontrolü, RIBO-seq kütüphanelerini önemli ölçüde daha geniş lekeler ve zirveler olarak görselleştirilen RNA-seq kütüphanelerinin aksine tek, iyi tanımlanmış bantlar ve zirveler olarak gösterir (Şekil 5). Ayrıca, elde edilen Ribo-seq verileri, RNA-seq verilerinde(Şekil 8B)gözlenmeyen üçlü periyodiklik (Şekil 8A) sergiler. Ayrıca, elde edilen RF'nin genom üzerinde eşlenen görselleştirmeleri, biyoinformatik analizlerimizde daha da doğrulanan ayak izi izolasyon yönteminden bağımsız olarak çok benzer ifade kalıpları göstermektedir (Şekil 9). Yine de, yanlış RF'nin elde edilen sinyali bozabilecek genomla eşleyebileceğinin farkındayız. Bununla birlikte, yanlış RF'nin rastgele üretilmiş olması, genom üzerinde tek bir yerde birikmemesi ve dolayısıyla eserlerle ve yanlış sonuçla sonuçlanmaması gerektiği anlamına gelir. Ayrıca,53 , 55izole edilmesi gereken RF'lerin boyutu ile ilgili bakteriyel çalışmalarda fikir birliği olmadığıve sadece uzunluk aralığının bir alt ihlalinin seçilmesinin sonuçların yanlış yorumlanmasına yol açabileceği belirtilmelidir17. Bakteriyel ayak izleri için çok çeşitli uzunlukların MNaz sindirimi55yerine prokaryotik ribozom davranışının bir sonucu olduğu ileri sürülmektedir. Örneğin, küçük ribozomal alt birleşimde 3′ 16S rRNA sonu ile mRNA'da Shine-Dalgarno motifi arasındaki tamamlayıcı etkileşim daha uzun RF56ile sonuçlanabilir. Çok çeşitli bakteriyel ayak izleri göz önüne alındığında, Mohammad ve ark. 15 ile 40 nt 17,55arasında boyut seçimi gerçekleştirmenizi öneririz. Bu, potansiyel olarak tüm RF'lerin izolasyona yol açmalı ve çeviri döngüsünün çeşitli aşamalarında ribozomların kapsamlı bir temsilini sağlamalıdır. Devam eden tartışma nedeniyle, eksizyon aralığı dikkatlice düşünülmelidir ve yanlış seçimin RF'nin bazı alt ihlallerini dışlayabileceğini ve sonraki analizde önyargıya yol açabileceğini hatırlamak önemlidir.

Nükleaz sindirimden hemen sonra ve ultrasantrifüjleme ile monozom izolasyonu atlayarak gerçekleştirilen boyut seçimi nedeniyle, protokolümüz hızlı, nispeten kolaydır ve standart bir laboratuvar ekipmanı ile gerçekleştirilebilir. RNA ve DNA'nın temizlenmesi için özel kitler kullanmak, mRNA'nın saflaştırılması ve kütüphane hazırlığı standardizasyon ve tekrarlanabilirlik sağlar. RNA temizliği sırasında daha fazla miktarda etanol etanol, <200 nt RNA parçalarının saflaştırma verimliliğini artırır57. Kütüphane hazırlanmasında yapılan değişiklikler - inkübasyon süresini uzatmak ve adaptör ligasyonu sırasında sıcaklığı artırmak - rRNA gibi metillenmiş RNA için ligasyon verimliliğini azaltmak ve rRNA kontaminasyonunu azaltmak için uygulanır58. Protokolümüz, çeviri düzenlemesini çeşitli büyüme koşullarında (hazırlık aşamasındaki yayınlar) araştırmak için kullanılmıştır, ancak Tİs tespiti gibi çevirinin diğer yönlerini incelemek veya genom ek açıklamalarını iyileştirmek ve proteomik çalışmalara yardımcı olmak için uygulanabilir. Araştırma sorusuna bağlı olarak protokolde ek bir değişiklik kolayca dahil edilebilir, örneğin ribozomların ilgi proteini ile çapraz bağlanması veya ribozomların zenginleştirilmiş fraksiyonları ile sonuçlanan ilgi ribozomlarının benzeşim saflaştırılması. Protokolümüzle RIBO-seq prosedürü bilim adamları için daha erişilebilirdir ve bu nedenle yeni keşifleri teşvik edebilir ve alandaki gelişmeleri hızlandırabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

ALS, EMBO Kurulum Hibeleri IG 3914 ve POIR'in finansal desteğini kabul etmek istiyor. 04.04.00-00-3E9C/17-00 Avrupa Birliği tarafından Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu kapsamında ortaklaşa finanse edilen Polonya Bilim Vakfı'nın Birinci TAKIM programı dahilinde gerçekleştirildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X TBE (powder) Invitrogen AM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, pure Acros Organics 125472500
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) New England Biolabs P0756S
Aluminium oxide calcinated pure p.a. Chempur 114560600
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C3881-500G
Chloramphenicol MP Biomedicals 190321
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4004
Dnase I recombinant, Rnase-free Roche 4716728001
EDTA disodium salt Fisher Scientific E/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic POCH Avantor Performance Materials Poland S.A BA6480111
Filtration apparatus VWR Collection 511-0265 all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask
Gel 40 (19:1) Rotiphorese 3030.1
Gel Loading Dye, Blue, 6X New England Biolabs E6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate Sigma-Aldrich G0635-25MG
labZAP A&A Biotechnology 040-500
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661-250G
MCE membrane fiter Alfatec Technology M47MCE45GWS pore size: 0.45um
MICROBExpress Bacterial mRNA Purification Invitrogen AM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina New England Biolabs E7300S
Nuclease-Free Water Ambion AM9937
Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest New England Biolabs E7323A
RNA Clean & Concentrator -25 Zymo Research R1018
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889-250G
Sodium carbonate Sigma-Aldrich 223530-500G
Sodium hydrogen carbonate pure p.a. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 810530115
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S11494
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer New England Biolabs B0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x) Invitrogen LC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9% AlfaAesar J65594
Triton X-100, 98% Acros Organics 327371000
Urea G.R. lach:ner 40096-AP0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  2. Takanami, M., Yan, Y., Jukes, T. H. Studies on the site of ribosomal binding of f2 bacteriophage RNA. Journal of Molecular Biology. 12 (3), 761-773 (1965).
  3. Steitz, J. A. Polypeptide Chain Initiation: Nucleotide Sequences of the Three Ribosomal Binding Sites in Bacteriophage R17 RNA. Nature. 224 (5223), 957-964 (1969).
  4. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. The EMBO journal. 7 (11), 3559-3569 (1988).
  5. Argüello, R. J., et al. SunRiSE - measuring translation elongation at single-cell resolution by means of flow cytometry. Journal of Cell Science. 131 (10), 214346 (2018).
  6. Michel, A. M., Baranov, P. V. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).
  7. Woolstenhulme, C. J., Guydosh, N. R., Green, R., Buskirk, A. R. High-precision analysis of translational pausing by ribosome profiling in bacteria lacking EFP. Cell reports. 11 (1), 13-21 (2015).
  8. McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. Methods (San Diego, Calif). 126, 112-129 (2017).
  9. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic acids research. 42 (17), 134 (2014).
  10. Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome Profiling of Mouse Embryonic Stem Cells Reveals the Complexity of Mammalian Proteomes. Cell. 147 (4), 789-802 (2011).
  11. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  12. Hsu, P. Y., et al. Super-resolution ribosome profiling reveals unannotated translation events in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (45), 7126-7135 (2016).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  15. Li, G. W., Oh, E., Weissman, J. S. The anti-Shine-Dalgarno sequence drives translational pausing and codon choice in bacteria. Nature. 484 (7395), 538-541 (2012).
  16. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in functional genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
  17. Mohammad, F., Woolstenhulme, C. J., Green, R., Buskirk, A. R. Clarifying the Translational Pausing Landscape in Bacteria by Ribosome Profiling. Cell reports. 14 (4), 686-694 (2016).
  18. Reid, D. W., Shenolikar, S., Nicchitta, C. V. Simple and inexpensive ribosome profiling analysis of mRNA translation. Methods (San Diego, Calif). 91, 69-74 (2015).
  19. Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
  20. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterialbiofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7, 41114 (2017).
  21. Oh, E. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  22. Chew, G. L. Ribosome profiling reveals resemblance between long non-coding RNAs and 5' leaders of coding RNAs. Development. 140 (13), Cambridge, England. 2828-2834 (2013).
  23. Dunn, J. G., Foo, C. K., Belletier, N. G., Gavis, E. R., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals pervasive and regulated stop codon readthrough in Drosophila melanogaster. eLife. 2, 01179 (2013).
  24. Liu, M. J., et al. Translational landscape of photomorphogenic Arabidopsis. The Plant cell. 25 (10), 3699-3710 (2013).
  25. Rooijers, K., Loayza-Puch, F., Nijtmans, L. G., Agami, R. Ribosome profiling reveals features of normal and disease-associated mitochondrial translation. Nature Communications. 4, 2886 (2013).
  26. Danielle, L., et al. Fidelity of translation initiation is required for coordinated respiratory complex assembly. Science Advances. 5 (12), 2118 (2019).
  27. Zoschke, R., Watkins, K. P., Barkan, A. A rapid ribosome profiling method elucidates chloroplast ribosome behavior in vivo. The Plant cell. 25 (6), 2265-2275 (2013).
  28. Chotewutmontri, P., Barkan, A. Dynamics of chloroplast translation during chloroplast differentiation in maize. PLoS genetics. 12 (7), 1006106 (2016).
  29. Lee, S., Liu, B., Huang, S. X., Shen, B., Qian, S. B. Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).
  30. Martinez, T. F., Chu, Q., Donaldson, C., Tan, D., Shokhirev, M. N., Saghatelian, A. Accurate annotation of human protein-coding small open reading frames. Nature chemical biology. 16 (4), 458-468 (2020).
  31. Simsek, D., et al. The Mammalian Ribo-interactome Reveals Ribosome Functional Diversity and Heterogeneity. Cell. 169 (6), 1051-1065 (2017).
  32. Fritsch, C., et al. Genome-wide search for novel human uORFs and N-terminal protein extensions using ribosomal footprinting. Genome research. 22 (11), 2208-2218 (2012).
  33. Lareau, L. F., Hite, D. H., Hogan, G. J., Brown, P. O. Distinct stages of the translation elongation cycle revealed by sequencing ribosome-protected mRNA fragments. eLife. 3, 01257 (2014).
  34. Meydan, S., et al. Retapamulin-Assisted Ribosome Profiling Reveals the Alternative Bacterial Proteome. Molecular Cell. 74 (3), 481-493 (2019).
  35. Wilson, D. N. The A-Z of bacterial translation inhibitors. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 393-433 (2009).
  36. Nakahigashi, K. Comprehensive identification of translation start sites by tetracycline-inhibited ribosome profiling. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 23 (3), 193-201 (2016).
  37. Weaver, J., Mohammad, F., Buskirk, A. R., Storz, G. Identifying Small Proteins by Ribosome Profiling with Stalled Initiation Complexes. mBio. 10 (2), 02819 (2019).
  38. Nakahigashi, K. Effect of codon adaptation on codon-level and gene-level translation efficiency in vivo. BMC genomics. 15 (1), 1115 (2014).
  39. Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
  40. Michel, A. M., et al. Observation of dually decoded regions of the human genome using ribosome profiling data. Genome research. 22 (11), 2219-2229 (2012).
  41. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
  42. Young, D. J., Guydosh, N. R., Zhang, F., Hinnebusch, A. G., Green, R. Rli1/ABCE1 Recycles Terminating Ribosomes and Controls Translation Reinitiation in 3'UTRs In Vivo. Cell. 162 (4), 872-884 (2015).
  43. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
  44. Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  45. Babraham Bioinformatics. Fast QC. , Babraham Institute. Cambridgeshire. Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2021).
  46. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic acids research. 45 (2), 6 (2017).
  47. Verbruggen, S., Menschaert, G. mQC: A post-mapping data exploration tool for ribosome profiling. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 181, 104806 (2019).
  48. Cui, H., Hu, H., Zeng, J., Chen, T. DeepShape: estimating isoform-level ribosome abundance and distribution with Ribo-seq data. BMC bioinformatics. 20, Suppl 24 678 (2019).
  49. Choi, J. RiboToolkit: an integrated platform for analysis and annotation of ribosome profiling data to decode RNA translation at codon resolution. , (2021).
  50. Choi, J. Dynamics of the context-specific translation arrest by chloramphenicol and linezolid. Nature chemical biology. 16 (3), 310-317 (2020).
  51. Tompson, J., O'Connor, M., Mills, J. A., Dahlberg, A. E. The protein synthesis inhibitors, oxazolidinones and chloramphenicol, cause extensive translational inaccuracy in vivo. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 273-279 (2002).
  52. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (11), 651-664 (2015).
  53. Glaub, A., Huptas, C., Neuhaus, K., Ardern, Z. Recommendations for bacterial ribosome profiling experiments based on bioinformatic evaluation of published data. Journal of Biological Chemistry. 295, 8999-9011 (2020).
  54. Sorour, M. H., Hani, H. A., Shaalan, H. F., El-Sayed, M. M. H. Experimental screening of some chelating agents for calcium and magnesium removal from saline solutions. Desalination and Water Treatment. 57 (48-49), 22799-22808 (2015).
  55. Mohammad, F., Green, R., Buskirk, A. R. A systematically-revised ribosome profiling method for bacteria reveals pauses at single-codon resolution. Elife. 8, 42591 (2019).
  56. O'Connor, P. B., Li, G. W., Weissman, J. S., Atkins, J. F., Baranov, P. V. rRNA:mRNA pairing alters the length and the symmetry of mRNA-protected fragments in ribosome profiling experiments. Bioinformatics. 29 (12), Oxford, England. 1488-1491 (2013).
  57. Protocol for RNA Clean & Concentrator -25. Zymo Research. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_r1017_r1018_rna_clean_concentrator-25.pdf (2021).
  58. Protocol for use with NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina (E7300, E7580, E7560, E7330). New England Biolabs. , Available from: https://www.international.neb.com/protocols/2018/03/27/protocol-for-use-with-nebnext-small-rna-library-prep-set-for-illumina-e7300-e7580-e7560-e7330 (2021).

Tags

Biyokimya Sayı 174
Bakterilerde RIBO-seq: NGS Dizilimi için Örnek Toplama ve Kütüphane Hazırlama Protokolü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P.,… More

Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P., Kovalenko, M., Starosta, A. L. RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing. J. Vis. Exp. (174), e62544, doi:10.3791/62544 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter