Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

RIBO-seq i bakterier: en prøvesamling og bibliotekforberedelsesprotokoll for NGS-sekvensering

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62544
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2, 1,2
1Laboratory of Gene Expression, ECOTECH-Complex, Maria Curie-Sklodowska University, 2Department of Molecular Biology, Institute of Biological Sciences, Maria Curie-Sklodowska University, 3Faculty of Information Technology, Polish-Japanese Academy of Information Technology

Summary

Her beskriver vi stadier av prøvetaking og forberedelse for RIBO-seq i bakterier. Sekvensering av bibliotekene utarbeidet i henhold til disse retningslinjene resulterer i tilstrekkelige data for omfattende bioinformatisk analyse. Protokollen vi presenterer er enkel, bruker standard laboratorieutstyr og tar syv dager fra lysis til å skaffe biblioteker.

Abstract

Ribosomets profileringsteknikk (RIBO-seq) er for tiden det mest effektive verktøyet for å studere prosessen med proteinsyntese in vivo. Fordelen med denne metoden, sammenlignet med andre tilnærminger, er dens evne til å overvåke oversettelse ved å kartlegge nøyaktig plasseringen og antall ribosomer på en mRNA-transkripsjon.

I denne artikkelen beskriver vi de påfølgende stadiene av prøveinnsamling og forberedelse for RIBO-seq-metoden i bakterier, og fremhever detaljene som er relevante for planlegging og gjennomføring av eksperimentet.

Siden RIBO-seq er avhengig av intakte ribosomer og relaterte mRNAer, er nøkkeltrinnet rask hemming av oversettelse og tilstrekkelig oppløsning av celler. Dermed foreslår vi filtrering og flash-frysing i flytende nitrogen for cellehøsting med en valgfri forbehandling med kloramfenikol for å arrestere oversettelse i bakterier. For oppløsningen foreslår vi sliping av frosne celler med mørtel og pestle i nærvær av aluminiumoksid for å forstyrre celleveggen mekanisk. I denne protokollen er det ikke nødvendig med sukrosepute eller en sukrose gradient ultracentrifugation for monosom rensing. I stedet påføres mRNA-separasjon ved hjelp av polyakrylamidgelelektroforese (PAGE) etterfulgt av det ribosomale fotavtrykket (28-30 nt-bånd) og gir tilfredsstillende resultater. Dette forenkler i stor grad metoden, samt reduserer tids- og utstyrskravene for prosedyren. For bibliotekforberedelse anbefaler vi at du bruker det kommersielt tilgjengelige lille RNA-settet for Illumina-sekvensering fra New England Biolabs, etter produsentens retningslinjer med en viss grad av optimalisering.

De resulterende cDNA-bibliotekene presenterer passende mengde og kvalitet som kreves for neste generasjons sekvensering (NGS). Sekvensering av bibliotekene utarbeidet i henhold til de beskrevne protokollresultatene i 2 til 10 mln unikt kartlagte lesninger per prøve som gir tilstrekkelige data for omfattende bioinformatisk analyse. Protokollen vi presenterer er rask og relativt enkel og kan utføres med standard laboratorieutstyr.

Introduction

Ribosomprofileringsteknikken (RIBO-seq) ble utviklet i laboratoriet til Jonathan Weissman ved University of California, San Francisco1. Sammenlignet med andre metoder som brukes til å studere genuttrykk på translasjonsnivå, fokuserer RIBO-seq på hvert ribosome som binder seg til mRNA og gir informasjon om plasseringen og det relative antallet ribosomer på en transkripsjon. Det muliggjør overvåking av prosessen med proteinsyntese in vivo og kan gi enkel kodonoppløsning og nøyaktighet som tillater måling av ribosomets tetthet på begge, den enkelte mRNA og langs hele transkripsjonen i cellen. Ved grunnlaget for RIBO-seq-teknikken ligger det faktum at ribbeosomet under oversettelse binder mRNA-molekylet og dermed beskytter det begravde fragmentet av transkripsjonen fra en ribonuklease fordøyelse. Ved tilsetning av ribonuklease fordøyes den ubeskyttede mRNA og fragmentene vedlagt av ribosomer - vanligvis ~ 28-30 nt lange - forblir intakte. Disse fragmentene, kalt ribosomale fotavtrykk (RF), kan deretter isoleres, sekvenseres og kartlegges på transkripsjonen de stammer fra, noe som resulterer i deteksjon av ribosomenes nøyaktige posisjon. Faktisk har ribososom evnen til å beskytte mRNA fragmenter blitt brukt siden 1960-tallet for å studere ribosomal binding og oversettelse initieringssteder (TIS)2,3,4. Men med fremskrittet i dyp sekvenseringsteknologi har RIBO-seq blitt en gullstandard for oversettelsesovervåking5 som gjennom ribosomets engasjement kan gi en genom-bred informasjon om proteinsyntese6. Ribosomprofilering fylte det teknologiske gapet som eksisterte mellom kvantifisering av transkripsjonen og proteomet6.

For å gjennomføre ribosomprofilering må vi få cellelys av organismen som hadde vokst under de undersøkte forholdene. Å forstyrre disse forholdene under celleinnsamling og lysis kan gi upålitelige data. For å forhindre dette brukes ofte oversettelseshemmere, rask høsting og blitsfrysing i flytende nitrogen. Celler kan lyses ved kryogen sliping i en mekanisk homogenisator som en miksermølle7,8 eller en perle beater9, og ved triturasjon gjennom en pipette10 eller med en nål11. Lysisbufferen kan tilsetts like før eller kort tid etter pulverisering av cellene. I vår protokoll bruker vi flytende nitrogen til prekolmørtel og pestle, samt aluminiumoksid som en mildere tilnærming til forstyrrelse av bakteriell cellevegg, noe som forhindrer RNA-skjæring ofte oppstår når metoder som sonifisering påføres. Etter pulverisering legger vi til en iskald lysisbuffer i det avkjølte innholdet i mørtelet. Valg av en passende lysisbuffer er viktig for å oppnå den beste oppløsningen av ribosomale fotavtrykk. Siden ionstyrke påvirker både RF-størrelsen og leserammepresisjonen, anbefales det for tiden å bruke lysisbuffere med lav ionisk styrke og bufferkapasitet, selv om det ser ut til at buffersammensetningen ikke påvirker ribosomal belegg på mRNAs11,12. Viktige komponenter i lysisbufferen er magnesiumioner, hvis tilstedeværelse forhindrer dissosiasjon av ribosomale underenheter og hemmer spontane konformasjonsendringer i bakterielle ribosomer11,13. Kalsiumioner spiller også en betydelig rolle og er avgjørende for aktiviteten til mikrokokkkjerne (MNase) som brukes i bakteriell ribosomprofileringsmetode14. Tillegg av guanosin 5′-[β,γ-imido]triphosfat (GMP-PNP), en ikke-hydrolysert analog av GTP, sammen med kloramfenikol hemmer oversettelse under lysis15.

Når lysatet oppnås, avklares det ved sentrifugering og deles inn i to deler, hver for en RIBO-seq og en total mRNA-sekvensering med høy gjennomstrømning (RNA-seq) siden de utføres samtidig (figur 1). RNA-seq gir et referansepunkt som gjør det mulig å sammenligne data fra både RIBO-seq og RNA-seq under dataanalyse. Den undersøkte translatome er definert ved normalisering av ribosomale fotavtrykk til mRNA overflod16. Data fra RNA-seq kan også bidra til å identifisere kloning eller sekvensering av artefakter17.

Figure 1
Figur 1. Skjema for mRNA prøvepreparering for RIBO-seq og RNA-seq. For RIBO-seq bibliotek forberedelse fordøyes RNA med MNase (A), etterfulgt av størrelsesvalget av RF på ~ 28-30 nt lengde (B); for RNA-seq RNA er isolert (C), utarmet av rRNA (D), og den resulterende mRNA fragmenteres tilfeldig i fragmenter av varierende lengde (E). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

De første trinnene i prosedyren for prøvepreparering for RIBO-seq og RNA-seq varierer noe (figur 1). For ribosomal profilering må lysatet fordøyes av en bestemt endonuklease for å forringe mRNA-molekylene som ikke er beskyttet av ribosomene. I standardprotokoller gjenvinnes de oppnådde monosomene av en sukrosepute ultracentrifugation eller en sukrose gradient ultracentrifugation8,14. I denne artikkelen viser vi at dette trinnet ikke er nødvendig for å isolere RF som kreves for RIBO-seq i bakterier, på samme måte for eukaryote celler18, og at størrelsesvalg av riktig lengde mRNA-fragmenter fra polyakrylamidgelen er tilstrekkelig.

For RNA-seq oppnås mRNA ved uttømming av rRNA fra de totale RNA - rRNA-molekylene hybridiserer til de biotinylerte oligonukleotidsondene som binder seg til de streptavidinbelagte magnetiske perlene. RRNA-oligonukleotid-perlekompleksene fjernes deretter fra prøven med en magnet som resulterer i en rRNA utarmet prøve19,20. De rensede mRNA-molekylene fragmenteres deretter tilfeldig av alkalisk hydrolyse. De oppnådde fragmentene av mRNA samt ribosomale fotavtrykk konverteres til cDNA-biblioteker og fremstilles for dyp sekvensering (figur 2). Dette innebærer reparasjon av ender som trengs etter alkalisk hydrolyse (for mRNA) og enzymatisk fordøyelse (for RF): defosforylering av 3' ender etterfulgt av fosforylering av 5' ender. De neste trinnene er adaptere ligation og omvendt transkripsjon for å lage cDNA innsatser innrammet av sekvenser som kreves for neste generasjon sekvensering (NGS) ved hjelp av Illumina plattform. Den siste fasen av bibliotekforberedelse er en PCR-reaksjon der konstruksjonene forsterkes og merkes med prøvespesifikke strekkoder for å tillate multipleksing og sekvensering av ulike prøver på en kanal. Før sekvensering vurderes kvaliteten og mengden av bibliotekene av høysensitiv DNA on-chip elektroforese. cDNA-biblioteker med riktige parametere kan deretter grupperes og sekvenseres. Sekvensering kan utføres på forskjellige Illumina-plattformer, for eksempel MiSeq, NextSeq eller HighSeq, avhengig av antall biblioteker, nødvendig leselengde og sekvenseringsdybde. Etter sekvensering utføres den bioinformatiske analysen.

Figure 2
Figur 2. Klargjøring av biblioteket. Biblioteksforberedelse inkluderer endereparasjon, adaptere ligation, omvendt transkripsjon og forsterkning med barkoding. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ribosomet profilering er en universell metode som lett kan modifiseres og justeres i henhold til det vitenskapelige spørsmålet. Opprinnelig ble den brukt i gjær1, men kort tid etter at den ble brukt på bakterieceller21 samt eukaryote modellorganismer, inkludert mus10, sebrafisk22, fruktflue23 og Arabidopsis thaliana24. Den ble også brukt til å studere forskjellige ribosomtyper: cytoplasmatisk, mitokondrie25,26 og kloroplast27,28. I eukaryoter er RIBO-seq vanligvis tilpasset og raffinert for å undersøke spesifikke aspekter ved oversettelse, inkludert initiering10,11,29,30,31,32, forlengelse1,10,11,31,33, ribosom stalling33 og konformasjonsendring33. De fleste modifikasjonene innebærer bruk av forskjellige oversettelseshemmere. I bakterier har imidlertid analoge studier vært vanskelige å gjennomføre på grunn av hemmeres paucity med den nødvendige virkningsmekanismen34. Den mest brukte oversettelseshemmeren i bakterier er kloramfenikol (CAM) som binder seg til peptidyloverføringssenteret (PTC) og forhindrer riktig posisjonering av aminoacyl-tRNA på A-området. Som et resultat forhindrer CAM dannelsen av en peptidbinding som fører til å arrestere de langstrakte ribosomene35. Andre eksempler på oversettelseshemmere i bakterier er tetracyklin (TET)36, retapamulin (RET)34 og Onc11237 som har blitt brukt til å undersøke oversettelsesinitieringssteder. TET, som forhindrer tRNA-levering til ribosomet ved å overlappe direkte med antikodonstammeløkken til tRNA på A-stedet, ble opprinnelig brukt for å verifisere resultatene oppnådd fra CAM-behandling siden de begge er antibiotika som hemmer oversettelsesforlengelse38. TET ble funnet for å oppdage primær TIS, men kunne ikke avsløre intern TIS36. RET binder seg i PTC av bakteriell ribosom, og forhindrer dannelse av den første peptidbindingen ved å forstyrre en langstrakt aminoacyl-tRNA på A-området. Bruk av RET resulterer i ribosomer arrestasjon på både primære og interne TISs34. Onc112, et prolinrikt antimikrobielt peptid, binder seg i utgangstunnelen og blokkerer aminoacyl-tRNA-binding i ribosomal A-området. Som et resultat forhindrer Onc112 initieringskomplekser fra å komme inn i forlengelsesfasen37.

Hovedinformasjonen ribosomeprofilering gir er ribosomer tetthet og deres posisjon på mRNA. Det ble brukt til å undersøke differensialgenuttrykk på oversettelsesnivå under ulike vekstforhold1,6, måle translasjonell effektivitet1,38,39 og oppdage oversettelsesreguleringshendelser som ribosomal pause10. RIBO-seq gjør det også mulig å avdekke oversettelsen av kommenterte ncRNA, pseudogenes og unannotated små åpne leserammer (ORF) som fører til identifisering av nye og / eller svært korte proteinkodingsgener10,12,22,30,37. I slike tilfeller kan RIBO-seq finjustere og forbedre genommerknaden. Med sin høye følsomhet for identifisering av oversatte ORFer og dens kvantitative natur, kan ribosomprofilering også fungere som proxy for proteombestemmelsen eller i å hjelpe proteomikkstudier31,34,39. Ved å kartlegge TIS avslører ribosomprofilering N-terminalt utvidede og avkortede isoformer av kjente proteiner10,32. RIBO-seq ble også tilpasset for å studere samtidig translasjonell folding av proteiner14,21,24. Denne metoden gjør det mulig å måle forlengelseshastigheter1,10,39 eller dekodingshastigheter for individuelle codons6 og hjelper til med å utvikle kvantitative modeller av oversettelse17. Ribosomet profilering metoden er også i stand til å gi mekanistisk innsikt i ribosomet pause i bakterier7,15,17, frameshifting40, stop-codon readthrough21, terminering / resirkulering defekter41,42 og ribosomal konformasjon endringer33 i eukaryoter. RIBO-seq ble også tilpasset for å undersøke effekten av spesifikke transvirkende faktorer på oversettelse som miRNAs6 og RNA-bindende proteiner i eukaryoter16,43. Det er imidlertid viktig å erkjenne at den eksperimentelle utformingen og den oppnådde oppløsningen av RIBO-seq bestemmer mengden informasjon som kan trekkes ut fra de resulterende sekvenseringsdataene12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Eksempelsamling

  1. Forbered en bakteriekultur. Vi anbefaler et kulturvolum på 100 ml per prøve.
  2. Forbered utstyr og reagenser for prøvetaking: to scoopulas per prøve, sterile 0,45 μm blandede cellulose estere membran (MCE) filtre, 50 ml sterile rør, flytende nitrogen, 50 mg / ml kloramfenikol i 70% (vol / vol) etanol (valgfritt). Punkter lokket på 50 ml rør for å tillate flytende nitrogenfordampning og forhindre eksplosjon av lukkede rør. Dekontaminer scoopulas med laboratorievaskemiddel og 70% etanol.
  3. Forvarm filtreringsutstyret og en av scoopulas til veksttemperatur i bakteriekulturen.
    MERK: Vi anbefaler et glassfiltreringsapparat med trakt, en fritted base, en jordet kolbe og en 47 mm Ø fjærklemme.
  4. Før prøvehøsting, tilsett kloramfenikol i bakteriekulturen til den endelige konsentrasjonen på 100 μg / ml og inkuber 1 minutt (valgfritt).
  5. Hell flytende nitrogen i 50 ml sterilt rør og legg den andre scoopulaen inne i røret for å avkjøle.
    forsiktighet! Flytende nitrogen kan føre til at lukkede beholdere eksploderer på grunn av trykkendringen ved fordampning. For å forhindre dette er det nødvendig å lage noen hull i lokket på 50 ml rør for å tillate flytende nitrogenfordampning.
  6. Samle celler ved filtrering. Stopp filtreringen når mediet har passert gjennom membranen, men ikke la filteret tørke helt.
  7. Samle bakterielle pellets ved raskt å skrape cellene av filterskiven ved hjelp av en forhåndsvarmt scoopula. Plasser umiddelbart hele scoopulaen med de høstede cellene i 50 ml-røret fylt med flytende nitrogen. Den høstede pelletsen skal være helt dekket av flytende nitrogen.
  8. La pelletsen fryse grundig og løsne frosne celler ved hjelp av en tidligere avkjølt andre scoopula. Lukk det punkterte lokket og overfør røret til -80 °C. STOPPpunkt
    MERK: Desinfiser scoopulas etter hver prøvehøsting.

2. Celle lysis

  1. Forbered 0,1 M GMP-PNP i 10 mM Tris pH 8, DNase I og 1,5 ml reaksjonsrør for lysater og hold dem på is. Avkjøl sentrifugen til 4 °C.
  2. Klargjør lysisbuffer (20 mM TRIS pH 7,6, 10 mM MgAcet, 150 mM KAcet, 0,4% TRITON X-100, 6 mM β-mercaptoethanol, 5 mM CaCl2 og valgfri 1 mM kloramfenikol). Aliquot 500 μL av lysisbufferen per prøve i 1,5 ml reaksjonsrør og legg dem på is.
  3. Dekontaminer mørtel og pestle med et laboratorievaskemiddel og 70% etanol, og tørk dem. Kjølig mørtel og pestle ved å helle flytende nitrogen i mørtel.
  4. Overfør frossen pellet inn i den forkjølte mørtelen og slip den til et pulver. Med en slikkepott tilsetter du ca. 1 volum aluminiumoksid og fortsetter slipingen. Hold mørtel, pestle og celler kjølig ved å helle flytende nitrogen når det er nødvendig, ikke la innholdet i mørtelet tine.
  5. Rett før du bruker lysisbuffer, legg GMP-PNP og DNase I inn i lysisbuffer aliquot til den endelige konsentrasjonen på henholdsvis 2 mM og 100 U / ml. Overfør løsningen til mørtel med celler og aluminiumoksid og fortsett slipingen. La lysatet tine sakte mens du sliper og overfør blandingen til det forhåndskjølte 1,5 ml reaksjonsrøret og legg straks på is.
  6. Sentrifuge lyser ved 20 000 x g i 5 minutter ved 4 °C. Overfør supernatanter til nye, forhåndskjølte 1,5 ml reaksjonsrør og hold dem på is.
  7. Mål RNA-konsentrasjonen i hver prøve med en NanoDrop. Bruk 1:10 fortynning av prøver og 1:10 fortynning av lysisbuffer i nukleasefritt vann som blankt.
    MERK: Vær oppmerksom på at kloramfenikol viser betydelig absorpsjon ved 260 nm.
  8. Del hver lysat i to porsjoner: en for RIBO-seq (0,5 - 1 mg RNA) og den andre for RNA-seq (resten).
  9. Rengjør prøvene for RNA-seq ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig RNA-oppryddingssett i henhold til produsentens protokoll.
    MERK: Vi anbefaler at du bruker Zymo RNA Clean &Concentrate -25 kit (se Tabell over materialer). Vi anbefaler også å legge til 4,5 volumer etanol (sammenlignet med prøvevolum) i blandingen av prøve og bindingsbuffer for ribosomale fotavtrykk og fragmentert mRNA, for å øke renseeffektiviteten til korte RNA-fragmenter.
  10. Oppbevar prøvene beregnet for RNA-seq ved -80 °C. Prosedyren for RNA-seq vil fortsette fra trinn 5.

3. MNase fordøyelse av prøver for RIBO-seq

  1. Til 1 mg RNA tilsett 3,8 μL 187,5 U/μL MNase i 10 mM Tris pH 8 og fyll den opp med lysisbuffer til det totale volumet på 500 μL.
  2. Inkuber ved 25 °C, 300 o/min, i 45 minutter i en termomikser.
  3. Rengjør prøvene med et kommersielt tilgjengelig RNA-oppryddingssett (som i trinn 2.9).
  4. Oppbevar prøvene for RIBO-seq ved -80 °C (STOP-punkt) eller fortsett til størrelsesvalg.

4. Polyakrylamid gelelektroforese (PAGE) og størrelsesvalg av prøver for RIBO-seq

  1. Forbered en 15% polyakrylamid-TBE gel med 8 M urea og legg den i en tank med TBE-buffer. Førkjøring i minst 10 minutter med en konstant spenning på 200 V.
  2. Bland prøver med TBE-Urea prøvebuffer, tannprotese ved 95 °C i 1 minutt og legg dem umiddelbart på is.
  3. Vask ut urea ved å injisere TBE buffer i gelbrønner ved hjelp av en sprøyte. Last inn prøvene og la det være ett brønnområde mellom dem for å skille hver prøve og forhindre krysskontaminering. Bruk 29 nt oligonukleotid og en blanding av 26 nt og 32 nt oligonukleotider som markører. Kjør elektroforese med en konstant spenning på 180 V.
  4. Klargjør steril buffer for inkubering over natten (5 mM EDTA, 10 mM NaOAc pH 5).
  5. Etter elektroforese, flekk gelen i et SYBR Gullbad i ca 2-3 minutter og skyll gelen med nukleasefritt vann.
  6. Slukk fragmenter av gel mellom 26 og 32 nt med de sterile nålene eller barberbladene og legg gelfragmentene i separate 1,5 ml rør for hver prøve. Bytt nål eller barberblad mellom prøvene.
  7. Tilsett 200 μL av inkubasjonsbufferen over natten til hvert reaksjonsrør.
  8. Inkuber prøvene ved 10 °C, 1000 o/min over natten i en termomikser.
  9. Neste dag rengjør du prøvene som i trinn 2.9. Elute fotavtrykkene i 80 μL nukleasefritt vann.
  10. Oppbevar prøvene ved -80 °C. STOP-punktet. Prosedyren for RIBO-seq vil fortsette fra trinn 7.

5. Rensing av bakteriell mRNA ved rRNA-uttømming fra prøver for RNA-seq

  1. Fjern rRNA fra prøver med et bakterielt mRNA-rensesett (f.eks. invitrogen MICROBExpress). Følg produsentens protokoll.
  2. Rengjør prøvene som i trinn 2.9. Elute mRNA i 50 μL nukleasefritt vann.
  3. Oppbevar prøvene for RNA-seq ved -80 °C (STOP-punkt) eller fortsett til alkalisk fragmentering.

6. Alkalisk fragmentering av prøver for RNA-seq

  1. Forbered alkalisk hydrolysebuffer (blanding 220 μL 0,1 M NaHCO3,30 μL 0,1 M Na2CO3 og 1 μL 0,5 M EDTA). Bland 1 volum (50 μL) alkalisk buffer med 1 volum (50 μL) av prøven og inkuber ved 95 °C i 25 minutter.
  2. Tilsett 5 μL 3 M NaOAc pH 5,5 for å stoppe reaksjonen.
  3. Rengjør prøvene som i trinn 2.9 og unngå prøvene i 80 μL nukleasefritt vann.
  4. Mulig STOP-punkt: Oppbevar RNA-seq-prøver ved -80 °C. Vi anbefaler imidlertid å gå direkte til trinn 7 for å unngå unødvendig frysing og opptining.

7. Defosforylering og fosforylering av prøver for både RNA- og RIBO-seq

  1. Tilsett 10 μL 10x reaksjonsbuffer PNK og 5 μL T4 PNK i hver prøve. Inkuber ved 37 °C i 1,5 time for å defosforylere de 3' endene.
  2. Tilsett 3 μL 1 mM ATP og inkuber ved 37 °C i 1 time for å fosforylat de 5' endene.
  3. Rengjør prøvene som i trinn 2.9, elute i 30 μL nukleasefritt vann.
  4. Oppbevar prøvene ved -80 °C. STOP-punktet.

8. Bibliotek forberedelse ved hjelp av NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina

  1. Forbered 100-1000 ng inngang RNA (oppnådde mRNA fragmenter og ribosomal fotavtrykk) i 6 μL nukleasefritt vann og tilsett 1 μL 3' SR-adapter. Inkuber i henhold til produsentens protokoll.
  2. Tilsett 10 μL 3' ligation reaksjonsbuffer (2x) og 3 μL 3' ligation enzymblanding og inkuber ved 37 °C i 2,5 time, i stedet for 1 time ved 25 °C som produsentens protokoll spesifiserer.
  3. Hybridiser Reverse Transcription Primer i henhold til produsentens protokoll med et modifisert program: 5 minutter ved 75 °C, 30 minutter ved 37 °C og hold ved 4 °C.
  4. Ligate 5's SR adapter. Følg produsentens protokoll med en endring: Utfør inkubasjonen ved 37 °C i 2,5 time, i stedet for 1 time ved 25 °C.
  5. Utfør omvendt transkripsjon i henhold til produsentens protokoll.
  6. Mulig STOP-punkt: Inkuber prøvene som inneholder syntetiserte cDA-er ved 70 °C i 15 minutter for å inaktivere den omvendte transkripsjonen og oppbevare dem ved -80 °C. Vi anbefaler imidlertid å gå direkte til de neste trinnene for å unngå unødvendig frysing og opptining av prøvene.
  7. Oppbevar halvparten av hvert cDNA-bibliotek ved -80 °C som sikkerhetskopi.
  8. Utfør PCR-forsterkning i henhold til produsentens protokoll. Bruk halvparten av reaksjonsblandingen. Oppbevar de oppnådde bibliotekene ved -80 °C. STOP-punktet.

9. Størrelsesvalg av cDNA-biblioteker ved hjelp av PAGE

  1. Forbered 6% polyakrylamid-TBE gel og legg den i en tank med TBE buffer. Førkjøring i minst 10 minutter med en konstant spenning på 200 V.
  2. Bland prøvene med Gel Loading Dye, Blue (6X) og last dem på gelen. Bruk Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest som stige. I begynnelsen, kjør elektroforese med en konstant spenning på 120 V for å tillate DNA å komme inn i gelen og deretter endre spenningen til 180 V.
  3. Når elektroforesen er ferdig, flekk gelen i et SYBR Gullbad i ca 2-3 minutter og skyll gelen med nukleasefritt vann.
  4. Særskilte gelfragmenter som inneholder bibliotekene. For RNA-seq prøver avgifter mellom 135-180 nt og for RIBO-seq mellom 135-170 nt. Bruk steril nål eller barberblad og plasser de utskilte gelfragmentene i separate 1,5 ml reaksjonsrør. Husk å bytte nål eller barberblad mellom prøvene.
    MERK: Adapterne og strekkoden fra NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina har totalt 119 nt som bestemmer nedre eksisjonskutt.
  5. Tilsett 100 μL nukleasefritt vann til hvert utskilte gelfragment.
  6. Inkuber gelfragmentene ved 10 °C, 450 o/min over natten i en thermomixer.
  7. Rengjør og konsentrer cDNA-bibliotekene med et kommersielt DNA-oppryddingssett i henhold til produsentens protokoll.
    MERK: Vi anbefaler at du bruker Zymo DNA Clean &Concentrate -5-settet (se Materialfortegnelser).
  8. Oppbevar rensede cDNA-biblioteker ved -80 °C. STOP-punkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De eksemplariske resultatene som presenteres her, ble oppnådd i en studie som undersøkte oversettelsesregulering i sporadiske WT Bacillus subtilis-celler. Nattkulturer ble fortynnet til OD600 lik 0,1 i 100 ml rikt medium og inkubert ved 37 °C med kraftig risting til OD600 nådde 0,5-0,6. Det rike mediet ble deretter erstattet med minimalt medium for å indusere sporuleringsprosessen, og inkubasjonen ble videreført i opptil fire timer. Celler ble høstet hver time som begynte med T0 - sporuleringsinduksjon - noe som resulterte i fem tidspunkter. Ett minutt før høsting ble kulturene behandlet med kloramfenikol som beskrevet i protokollen ovenfor. Celler ble samlet inn ved filtrering i et forhåndsvarslet glassfiltreringssystem ved hjelp av 0,45 μm blandede cellulosesteremembranfiltre (MCE) og blitsfryst i flytende nitrogen.

Mengden ribonukleinsyre oppnådd i lysatet avhenger av vekstforhold, kulturvolum og tetthet. Etter vår protokoll gir 100 ml av bakteriekulturen (Bacillus subtilis) 1-4 mg RNA i gjennomsnitt. Eksempler på lysater hentet fra eksperimentet beskrevet ovenfor er vist i tabell 1.

RNA-konsentrasjon [ng/μL] RNA-mengde [mg] A260/A280 A260/A230
WT0 5845 3.21 1.57 0.83
WT1 6275 3.45 1.58 0.79
WT2 3525 1.94 1.38 0.56
WT3 3717 2.04 1.37 0.61
WT4 1653 0.91 1.11 0.43

Tabell 1. RNA-konsentrasjon og mengde i representative prøver av B. subtilis lysater. Tabellen inneholder prøver fra villtype (WT) B. subtilis som ble høstet før sporuleringsinduksjonen (0) og en time (1), to (2), tre (3) eller fire (4) timer etter sporuleringsinduksjon. Lysis ble utført med 550 μL lysisbuffer som inneholder kloramfenikol. Det kan bli lagt merke til at etter hvert som sporuleringen fortsetter, reduseres mengden oppnådd RNA.

Når mengden RNA er lavere enn 1 mg, brukes 0,25 mg RNA for RIBO-seq i stedet for 1-0,5 mg og mengden MNase justeres deretter. Den representative RNA-mengden og konsentrasjonen etter nuklease fordøyelsen er vist i tabell 2. Den gjennomsnittlige mengden RNA etter fordøyelse og rengjøring er 50 μg fra 0,5 mg RNA-inngang.

RNA-konsentrasjon [ng/μL] RNA-beløp [μg] A260/A280 A260/A230
WT0-R 1015 50.75 2.12 1.84
WT1-R 1157.4 57.87 2.10 2.19
WT2-R 847.2 42.36 2.10 2.00
WT3-R 983.6 49.18 2.09 2.16
WT4-R 206 10.30 2.13 1.00

Tabell 2. Mengden og konsentrasjonen av RNA etter nuklease fordøyelsen av de representative prøvene for RIBO-seq. Tabellen inneholder prøver fra villtype (WT) B. subtilis som ble høstet før sporuleringsinduksjon (0) og en time (1), to (2), tre (3) eller fire (4) timer etter sporuleringsinduksjon; bokstaven "R" refererer til prøver for RIBO-seq. Fordi RNA-konsentrasjonen av WT4-R-prøven var lav, ble 0,25 mg RNA fordøyd, mens 0,5 mg av RNA for de resterende prøvene ble brukt til ribosomal fotavtrykksgenerering. Mengden MNase for fordøyelsen var 178.125 U for 0,25 mg RNA i WT4-R, og 356,25 U for 0,5 mg RNA i andre prøver. Etter fordøyelsen ble prøvene rengjort med det kommersielle RNA-oppryddingssettet og ribonukleinsyrekonsentrasjonen ble målt med NanoDrop.

Etter MNase-fordøyelsen utføres størrelsesvalg ved hjelp av PAGE. Et eksempel på en 15% TBE-urea polyakrylamidgel med de fordøyde prøvene er vist i figur 3. Fragmenter av gel mellom 26 og 32 nt ble utskilt med et sterilt barberblad og inkubert over natten i inkubasjonsbufferen over natten. Neste dag ble ribosomale fotavtrykk rengjort med det kommersielle RNA-oppryddingssettet.

Figure 3
Figur 3. 15% TBE-urea polyakrylamidgel med representative prøver etter MNase fordøyelse. Figuren inkluderer prøver fra villtype (WT) B. subtilis som ble høstet før sporuleringsinduksjon (0) og en time (1), to (2), tre (3) eller fire (4) timer etter sporuleringsinduksjon; bokstaven "R" refererer til prøver for RIBO-seq. 15 μL av denaturerte prøver ble lastet inn i gelbrønnene i rekkefølge: WT2-R, WT3-R, WT4-R, WT0-R, WT1-R og det gjenværende volumet ble lagret ved -80 °C som sikkerhetskopi. 29 nt oligonukleotid og blanding av 26 nt og 32 nt oligonukleotider ble brukt som markører. Elektroforese ble utført som beskrevet ovenfor og gelen ble farget i et SYBR Gullbad. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Parallelt med nuklease fordøyelsen ble lysatene for RNA-seq rengjort med det kommersielle RNA-oppryddingssettet, og de oppnådde konsentrasjonene av RNA ble målt med NanoDrop. De representative resultatene presenteres i tabell 3. Etter rengjøring ble mengden ribonukleinsyre redusert til 40-500 μg.

RNA-konsentrasjon [ng/μL] RNA-beløp [μg] A260/A280 A260/A230
WT0-m 10274.1 513.70 2.14 2.35
WT1-m 10118.3 505.92 2.12 2.33
WT2-m 5599.7 279.98 2.15 2.29
WT3-m 6562.2 328.11 2.08 2.31
WT4-m 757 37.85 2.01 1.95

Tabell 3. RNA-mengde og konsentrasjon av prøver for RNA-seq etter RNA-rensing. Tabellen inneholder prøver fra villtype (WT) B. subtilis som ble høstet før sporuleringsinduksjon (0) og en time (1), to (2), tre (3) eller fire (4) timer etter sporuleringsinduksjon; bokstaven "m" refererer til prøver for RNA-seq (mRNA).

De oppnådde RNA-konsentrasjonene av prøvene for RNA-seq ble brukt til å definere RNA-inngang for rRNA-uttømming. 8 μg RNA fra hver RNA-seq prøve ble brukt med MICROBExpress bakteriell mRNA rensesett (se Materialliste) i henhold til produsentens protokoll og ble rengjort med det kommersielle RNA-oppryddingssettet etterpå. De representative resultatene av rRNA-uttømming er vist i tabell 4.

RNA-konsentrasjon [ng/μL] A260/A280 A260/A230 RNA-beløp [μg]
WT0-m 62.7 1.99 1.75 3.1
WT1-m 59.3 2.00 2.16 2.9
WT2-m 93.7 1.97 1.69 4.7
WT3-m 68.3 1.99 2.33 3.4
WT4-m 85.0 1.97 2.00 4.2

Tabell 4. Den representative RNA-mengden og konsentrasjonen etter rRNA-uttømming. Tabellen inneholder prøver fra villtype (WT) B. subtilis som ble høstet før sporuleringsinduksjon (0) og en time (1), to (2), tre (3) eller fire (4) timer etter sporuleringsinduksjon; bokstaven "m" refererer til prøver for RNA-seq. 8 μg RNA fra prøver for RNA-seq ble brukt til rRNA-uttømming og rengjort med et kommersielt RNA-oppryddingssett etterpå.

Deretter ble den oppnådde mRNA fragmentert av alkalisk hydrolyse og rengjort med et kommersielt sett som beskrevet i protokollen. De fragmenterte mRNA- og ribosomale fotavtrykkene ble defosforylert i 3' ender og fosforylert i 5' ender i henhold til protokollen ovenfor. Eksemplene ble deretter brukt til å konstruere cDNA-biblioteker for Illumina-sekvensering, som beskrevet i protokollen. Figur 4 viser et eksempel på en 6% polyakrylamidgel med de oppnådde bibliotekene. Gelfragmenter i området 135-180 nt for RNA-seq og 135-170 nt for RIBO-seq ble utskilt med sterile barberblader og inkubert over natten i nukleasefritt vann. Biblioteker ble rengjort med et kommersielt DNA-oppryddingssett og kvalitet og kvantitet ble vurdert av et høysensitivt DNA på chip elektroforese ved hjelp av Agilent 2100 Bioanalyzer.

Figure 4
Figur 4. 6% polyakrylamidgel av cDNA-biblioteker før og etter størrelsesvalg. Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest ble brukt som stige. 25 μL prøver ble lastet inn i gelen i følgende rekkefølge: tre RIBO-seq biblioteker og seks RNA-seq biblioteker. De resterende prøvevolumene ble lagret ved -80 °C som reserve. Figuren inneholder prøver fra villtype (WT) B. subtilis som ble høstet en time (1), to (2), tre (3) eller fire (4) timer etter sporulering induksjon; bokstaven "R" refererer til prøver for RIBO-seq og bokstaven "m" refererer til prøver for RNA-seq. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Eksemplene på virtuelle gelbilder og elektroferogrammer hentet fra Agilent 2100 Bioanalyzer er vist i figur 5. Bånd og topper som representerer RIBO-seq-bibliotekene er smalere og bedre definert sammenlignet med disse som representerer RNA-seq-biblioteker. Ifølge elektroforesen på brikken er bibliotekene omtrent 150 bp lange, noe som er en forventet bibliotekstørrelse. Adapterne og strekkoden som brukes i biblioteksforberedelsene er 119 nt lange og innsatsene er enten 29-30 nt lange (for RIBO-seq) eller i et område mellom 25 og 50 nt (for RNA-seq). De ekstra toppene nærmere 200 bp hentet fra RIBO-seq biblioteker kan indikere PCR-gjenstander som kan kastes under bioinformatisk analyse når dataene hentet fra sekvensering er trimmet og rRNA / tRNA filtreres. Den gjennomsnittlige mengden DNA er 32 ng som gir tilstrekkelig mengde materiale som kreves for neste generasjons sekvensering.

Figure 5
Figur 5. Eksemplene på elektroferogrammer og virtuelle gelbilder fra et høysensitivt DNA på chip elektroforese. Figuren inkluderer prøver fra villtype (WT) B. subtilis som ble høstet før sporuleringsinduksjon (0) og en time (1), to (2), tre (3) eller fire (4) timer etter sporuleringsinduksjon; bokstaven "R" refererer til RIBO-seq biblioteker og bokstaven "m" refererer til RNA-seq biblioteker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Etter kvalitetskontroll av elektroforesen på brikken ble biblioteker samlet for end 50 bp-sekvensering på Illuminas NextSeq500-plattform (10 biblioteker per kanal, med minst 350 mln lest per kanal). Sekvensering ga 30-57 millioner lesninger per prøve for RNA-seq biblioteker og 30-50 millioner leseoperasjoner per prøve for RIBO-seq biblioteker. Trimming av adaptere og dårlig kvalitet resulterte i 24-47 mln lesing per prøve for RNA-seq prøver og 25-50 mln lesninger per prøve for RIBO-seq prøver. Kartlegging, utført med STAR44, ga 2,4-9,6 millioner unikt kartlagte lesninger per prøve for RNA-seq-prøver (som utgjør 8-16,8% av det totale antall lesninger) og 2,3-10,4 millioner unikt kartlagte lyder (7,7-22,1%) for RIBO-seq-prøver. De innhentede dataene ble kvalitetskontroll sjekket med FastQC45. Eksempler på kvalitetsplott produsert av FastQC for trimmede sekvenser vises i figur 6. Sekvensene av lengden på interessen, som er <32 nt for RIBO-seq og <50 nt for RNA-seq, presenterte meget god kvalitet. Eksemplene på plott av GC-innhold og distribusjoner av sekvenslengder over alle trimmede sekvenser vises i figur 7. Den ekstra toppen på 72% i GC distribusjonsplott av RIBO-seq bibliotek kan potensielt indikere rRNA forurensning som kan fjernes under bioinformatisk analyse av rRNA filtrering46,47,48. Sekvenslengdedistribusjonen er svært smal for RIBO-seq-biblioteker, med en topp på 26-27 nt, mens lengdefordelingen for RNA-seq-biblioteker er bredere og varierer mellom 15 og 50 nt.

Figure 6
Figur 6. Eksemplene på boks-og-whisker-plott av kvalitetspoeng på tvers av alle baser for RIBO-seq- og RNA-seq-biblioteker etter trimming. Figuren inneholder prøver fra villtype (WT) B. subtilis som ble høstet før sporuleringsinduksjon (0) og fire (4) timer etter sporuleringsinduksjon; bokstaven "R" refererer til RIBO-seq prøver og bokstaven "m" refererer til RNA-seq prøver. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7. Eksemplene på plott av GC-innhold og sekvenslengdefordeling av alle sekvenser for RIBO-seq- og RNA-seq-biblioteker etter trimning. Figuren viser prøver fra villtype (WT) B. subtilis som ble høstet fire (4) timer etter sporuleringsinduksjon; bokstaven "R" refererer til prøve for RIBO-seq og bokstaven "m" refererer til prøve for RNA-seq. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For å verifisere om RIBO-seq-dataene gir informasjon om ekte ribosomale fotavtrykk i stedet for tilfeldige mRNA-fragmenter av den valgte lengden, sammenlignet vi sekvenseringsdata fra RIBO-seq og RNA-seq ved hjelp av RiboToolkit, en webserver for RIBO-seq dataanalyse49. Ribo-seq-data viser trilling periodicitet og en høy, smal topp som tilsvarer de initierende ribosomene og karakteristikken til RF som vist i figur 8A, som ikke observeres i RNA-seq-dataene (Figur 8B). Videre viste metageneplottet som viser profilene til gjennomsnittlig dekning av RF- og mRNA-fragmenter på kodesekvensene (CDSs), en høyere andel av avlesningene som er tilordnet CDS-ene i RIBO-seq-datasettet (figur 8C), som forventet.

Figure 8
Figur 8. Metagene periodicitetsplott og gjennomsnittlig dekning av RF- og mRNA-fragmenter på CDS. Metagene profiler ble oppnådd med RiboToolkit, en integrert webserver49. CDS-lengden ble normalisert til verdien 1, og hver CDS ble delt inn i 100 like bokser. Figuren viser prøver fra wild type (WT) B. subtilis som ble høstet en (1) time etter sporuleringsinduksjon; bokstaven "R" refererer til prøve for RIBO-seq og bokstaven "m" refererer til prøve for RNA-seq. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For å sammenligne om RIBO-seq-protokollen som presenteres her gir resultater som ligner på de som er oppnådd ved standardmetode for RF-gjenoppretting (sukrose gradient ultracentrifugation), vi parallelt sekvenseringsresultatene fra biblioteker utarbeidet etter de to metodene. Forsøkene som undersøkte oversettelsesregulering under sporulering i WT B. subtilis ble utført i henhold til den presenterte RIBO-seq-protokollen, samt å følge standardprotokollen som inkluderer monosomer utvinning av en sukrose gradient ultracentrifugation. Resultatene av ribosomets dekningsprofiler hentet fra de to eksperimentene er vist i figur 9. Visualiseringen av kartlagte RFer er svært lik mellom de to eksperimentene og ga lignende resultater ved bioinformatisk analyse.

Figure 9
Figur 9. Visualiseringen av innhentet RF kartlagt på genomet. Figuren inkluderer RF hentet fra wild type B. subtilis høstet fire timer etter sporuleringsinduksjon og utarbeidet i henhold til standardprotokollen (WT4-R-s, øvre panel) eller den presenterte protokollen (WT4-R, nedre panel). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den viktigste tekniske utfordringen med ribosomet profilering er behovet for å raskt hemme oversettelse for å fange et øyeblikksbilde av ribosomer på mRNAer på en bestemt fysiologisk tilstand av interesse. For å oppnå dette brukes ofte oversettelseshemmere, rask høsting og blitsfrysing i flytende nitrogen. Påføring av antibiotika er valgfritt siden de kan forårsake artefakter. Kloramfenikol er et vanlig brukt stoff for å arrestere forlengelse av ribosomer i bakteriell RIBO-seq. Det forhindrer imidlertid ikke initiering, noe som resulterer i en opphopning av ribosomer om seks codons nedstrøms for oversettelsesstartstedet14. Videre kan dens evne til å hemme peptidyltransferasereaksjonen være avhengig av arten av ribosomale P- og A-områdeunderlag. Antagelig arresterer CAM ribosomer mer effektivt med Gly, Ala, Ser, Cys eller Thr som nest siste aminosyre av det gryende peptidet17,38,50. Dette er verdt å ta hensyn til under eksperimentell design og bioinformatisk analyse, spesielt når du studerer ribosomal pause17. CAM har også vist seg å påvirke translasjonell nøyaktighet ved å fremme en stopp codon readthrough og frameshifting51. Likevel er CAM-hemming relativt rask og tilstrekkelig for typisk RIBO-seq forskning14 og induserer ikke feilinkorporering51. Noen av artefaktene forårsaket av antibiotika kan unngås ved å øke legemiddelmengden9. CAM-konsentrasjon som brukes i vår protokoll er den typiske mengden som brukes i RIBO-seq-eksperimenter7,14,21, men konsentrasjonen kan variere for forskjellige mikroorganismer og bør optimaliseres før prøvehøsting. På grunn av muligheten for forekomst av artefakter forårsaket av bruk av oversettelseshemmere, anbefales det å unngå inhibitorbehandlingen om ikke nødvendig for forskningsspørsmålet, og hvis rask høsting er mulig14. Rask cellesamling er avgjørende, spesielt hvis den utføres uten inhibitorbehandling, siden langvarig høsting kan føre til tap av polysomer og / eller endring i translatomet som svar på de skiftende miljøforholdene14. Dermed anbefaler vi å bruke filtrering som høstingsmetode, da den kan utføres under samme eller lignende forhold som kulturveksten, inkludert temperatur og / eller risting. Under filtreringsceller samlet på filteroverflaten skylles stadig med vekstmedium, noe som hindrer dem i å føle skift i celletetthet, oksygenering og nivå av aminosyrer og andre næringsstoffer14. Filtrering er mildere og kan være raskere enn sentrifugering, hvis kulturens tetthet er moderat, ellers kan et stort antall celler tette filterporene og bremse prosessen. Hvis det er sannsynlighet for langvarig filtrering, anbefaler vi en kloramfenikol forbehandling av kulturen, noe som resulterer i en oversettelsesstans og gjør det mulig å forlenge høstingstiden. Hvis filtrering blir vanskelig å fullføre på grunn av filterstoppingen, foreslår vi å stoppe filtreringen, fjerne overflødig kultur og blinke fryse brøkdel av kulturen samlet på filteret. Vi observerte at 50 ml tett bakteriekultur er tilstrekkelig til å utføre RIBO-seq. Den påfølgende blitsfrysingen av celler i flytende nitrogen er den mest universelle og effektive tilnærmingen til umiddelbart å stoppe oversettelse8,21,52.

Ribonuklease fordøyelse er et kritisk skritt som kreves for å oppnå god kvalitet RF. Å velge riktig enzym er viktig siden ribosomale underenheter består av RNA-molekyler som kan fordøyes, forstyrrer ribosomets integritet, forårsaker rRNA-forurensning og ødelegger RF44. Opprinnelig, RNase Jeg ble brukt til fordøyelsen av mRNA og RF generasjon i eukaryoter1. Siden dette enzymet virket inaktivt i bakterier, ble det erstattet med en mikrokokkkjerne (MNase) fra Staphylococcus aureus21. Det ble senere vist at RNAse jeg faktisk kan utføre fordøyelsen av bakterielle prøver, men MNase forblir ofte brukt til dette formålet53. Ulempen med MNase ligger i sekvensbias av sin katalytiske aktivitet, som er 30 ganger økt proksimal til A eller T, noe som resulterer i 80% av mRNA fragmenter som starter med A eller T ved 5′ slutten14. Dette har imidlertid blitt overvunnet av observasjonen om at det meste av variasjonen i lengde skjer ved 5′-enden av RF, og tildeling av ribosometetthet til 3′-end gir presis og nøyaktig informasjon om ribosomet posisjon7. MNase-aktiviteten påvirkes av enzymkonsentrasjonen, pH og fordøyelsestiden og bør bestemmes for hver nye MNase-batch. Økt kjerneaktivitet fører til økt rRNA-forurensning, mens redusert aktivitet gir mindre nøyaktig spalting av ribosomale fotavtrykk. Dette kan redusere det totale utbyttet av RF i den størrelsesselektive gelrensingsprosedyren og gi mindre nøyaktig informasjon om ribosomeposisjoner på mRNA14. Dermed bør den nødvendige mengden MNase bestemmes nøye. For våre eksperimenter bruker vi 712,5 U mikrokokkkjerne per 1 mg RNA, mens konsentrasjonen som rapporteres i litteraturen varierer mellom 50 U38, 450 U34, 1000 U14 og 1500 U15,21,36 per 1 mg RNA. Som nevnt ovenfor krever MNase tilstedeværelse av kalsiumioner for sin aktivitet. I standardprotokoller EGTA, et chelateringsmiddel for divalente ioner som har en høyere affinitet for kalsium sammenlignet med magnesium54, brukes til å stoppe fordøyelsen ved å binde kalsium og inaktivere MNase. Men i vår protokoll stoppes fordøyelsesreaksjonen ved å bruke RNA-rengjøringssett direkte etter inkubasjon med kjernen.

I standardprotokoller er neste trinn ribosomer utvinning av en sukrose pute ultracentrifugation eller en sukrose gradient ultracentrifugation8,14. En sukrose gradient sentrifugering muliggjør selektiv separasjon av monosomene fra underenheter og polysomer, men det krever spesifikt utstyr som en gradientblander og en ultracentrifuge. Gjennomstrømningen av denne metoden er også begrenset til 500-700 μL av lysatet. På den annen side, sukrose pute ultracentrifugation pellets de fleste ribosomale partikler, muliggjør behandling av over dusin milliliter lysat og er mindre krevende når det gjelder instrumentering nødvendig. Imidlertid er begge tilnærmingene lange da de tar minimum 4 til 6,5 timer14 og krever en ultracentrifuge. I vår protokoll er dette trinnet utelatt når vi går direkte til størrelsesvalg i 15% TBE-urea polyakrylamidgel. Elektroforesen utføres under denatureringsforhold for å utfolde RNA sine sekundære strukturer og forhindre intramolekylære interaksjoner. Vi bruker 26 nt, 29 nt og 32 nt oligonukleotider som markører for å utskille et smalt utvalg av ribosomale fotavtrykk. Vi antar at konsentrasjonen av den faktiske RF betydelig overstiger potensiell forurensning med falsk RF betraktet som tilfeldig, ubeskyttet av ribosomet mRNA eller rRNA fragmenter av lengde i det området. Resultatene oppnådd ved hjelp av vår protokoll viste faktisk beriket brøkdel av RF i det valgte størrelsesområdet. Kvalitetssjekken med Agilent 2100 Bioanalyzer viser RIBO-seq-biblioteker som en enkelt, veldefinerte bånd og topper, i motsetning til RNA-seq-biblioteker som visualiseres som betydelig bredere smør og topper (Figur 5). Innhentede Ribo-seq-data viser også trilling periodicitet (Figur 8A), som ikke observeres i RNA-seq-dataene (Figur 8B). Videre viser visualiseringene av den oppnådde RF som er kartlagt på genomet svært like uttrykksmønstre uavhengig av fotavtrykkisolasjonsmetoden som ble ytterligere bekreftet i våre bioinformatiske analyser (Figur 9). Likevel er vi klar over at falsk RF kan kartlegge genomet som kan forstyrre det oppnådde signalet. Det faktum at falsk RF genereres tilfeldig, innebærer imidlertid at de ikke skal akkumuleres til ett sted på genomet, og derfor bør ikke resultere i gjenstander og falskt resultat. Det må også bemerkes at det ikke er konsensus i bakteriestudier om størrelsen på RFer som skal isoleres53,55 og at valg av bare en underfraksjon av lengdeområde kan føre til feiltolkninger av resultatene17. Det foreslås at et bredt spekter av lengder som er karakteristiske for bakterielle fotavtrykk er en konsekvens av prokaryotisk ribosomadferd i stedet for MNase fordøyelse55. For eksempel kan komplementær interaksjon mellom 3′ slutten av 16S rRNA i liten ribosomal subenhet og et Shine-Dalgarno-motiv i mRNA resultere i lengre RF56. Med tanke på et bredt spekter av lengder av bakterielle fotavtrykk, Mohammad et al. anbefaler å utføre størrelsesvalg mellom 15 og 40 nt17,55. Dette bør føre til isolering av potensielt et helt spekter av RFer og sikre en omfattende representasjon av ribosomer i ulike stadier av oversettelsessyklusen. På grunn av den pågående diskusjonen bør eksisjonsområdet vurderes nøye, og det er viktig å huske at feil valg kan utelukke noen underbrudd av RF og føre til skjevhet i den påfølgende analysen.

På grunn av størrelsesvalget som utføres direkte etter nuklease fordøyelsen og med å utelate monosom isolasjon ved ultracentrifugation, er vår protokoll rask, relativt enkel og kan utføres med et standard laboratorieutstyr. Ved hjelp av dedikerte sett for rengjøring av RNA og DNA sikrer rensing av mRNA og bibliotekforberedelse standardisering og repeterbarhet. Appling mer volum etanol under RNA rengjøring øker renseeffektiviteten til <200 nt RNA fragmenter57. Modifikasjoner på bibliotekforberedelsene - som forlenger inkubasjonstiden og øker temperaturen under adaptere ligasjon - brukes til å redusere ligasjonseffektiviteten for metylert RNA, for eksempel rRNA, og for å redusere rRNA-forurensning58. Vår protokoll har blitt brukt til å undersøke oversettelsesregulering under ulike vekstforhold (publikasjoner under forberedelse), men kan brukes til å studere andre aspekter ved oversettelse som TIS-detektering eller for å forbedre genommerknader og bistå proteomiske studier. En ytterligere modifikasjon av protokollen, avhengig av forskningsspørsmålet, kan lett inkluderes, for eksempel krysskobling av ribosomet med protein av interesse eller affinitetsrensing av ribosomer av interesse, noe som resulterer i berikede brøkdeler av ribosomer. Med vår protokoll er RIBO-seq-prosedyren mer tilgjengelig for forskere og kan dermed stimulere til nye funn og akselerere utviklingen på feltet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

ALS ønsker å anerkjenne den økonomiske støtten til EMBO Installation Grants IG 3914 og POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 utført i First TEAM-programmet til Foundation for Polish Science finansiert av EU under European Regional Development Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X TBE (powder) Invitrogen AM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, pure Acros Organics 125472500
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) New England Biolabs P0756S
Aluminium oxide calcinated pure p.a. Chempur 114560600
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C3881-500G
Chloramphenicol MP Biomedicals 190321
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4004
Dnase I recombinant, Rnase-free Roche 4716728001
EDTA disodium salt Fisher Scientific E/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic POCH Avantor Performance Materials Poland S.A BA6480111
Filtration apparatus VWR Collection 511-0265 all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask
Gel 40 (19:1) Rotiphorese 3030.1
Gel Loading Dye, Blue, 6X New England Biolabs E6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate Sigma-Aldrich G0635-25MG
labZAP A&A Biotechnology 040-500
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661-250G
MCE membrane fiter Alfatec Technology M47MCE45GWS pore size: 0.45um
MICROBExpress Bacterial mRNA Purification Invitrogen AM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina New England Biolabs E7300S
Nuclease-Free Water Ambion AM9937
Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest New England Biolabs E7323A
RNA Clean & Concentrator -25 Zymo Research R1018
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889-250G
Sodium carbonate Sigma-Aldrich 223530-500G
Sodium hydrogen carbonate pure p.a. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 810530115
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S11494
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer New England Biolabs B0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x) Invitrogen LC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9% AlfaAesar J65594
Triton X-100, 98% Acros Organics 327371000
Urea G.R. lach:ner 40096-AP0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  2. Takanami, M., Yan, Y., Jukes, T. H. Studies on the site of ribosomal binding of f2 bacteriophage RNA. Journal of Molecular Biology. 12 (3), 761-773 (1965).
  3. Steitz, J. A. Polypeptide Chain Initiation: Nucleotide Sequences of the Three Ribosomal Binding Sites in Bacteriophage R17 RNA. Nature. 224 (5223), 957-964 (1969).
  4. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. The EMBO journal. 7 (11), 3559-3569 (1988).
  5. Argüello, R. J., et al. SunRiSE - measuring translation elongation at single-cell resolution by means of flow cytometry. Journal of Cell Science. 131 (10), 214346 (2018).
  6. Michel, A. M., Baranov, P. V. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).
  7. Woolstenhulme, C. J., Guydosh, N. R., Green, R., Buskirk, A. R. High-precision analysis of translational pausing by ribosome profiling in bacteria lacking EFP. Cell reports. 11 (1), 13-21 (2015).
  8. McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. Methods (San Diego, Calif). 126, 112-129 (2017).
  9. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic acids research. 42 (17), 134 (2014).
  10. Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome Profiling of Mouse Embryonic Stem Cells Reveals the Complexity of Mammalian Proteomes. Cell. 147 (4), 789-802 (2011).
  11. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  12. Hsu, P. Y., et al. Super-resolution ribosome profiling reveals unannotated translation events in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (45), 7126-7135 (2016).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  15. Li, G. W., Oh, E., Weissman, J. S. The anti-Shine-Dalgarno sequence drives translational pausing and codon choice in bacteria. Nature. 484 (7395), 538-541 (2012).
  16. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in functional genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
  17. Mohammad, F., Woolstenhulme, C. J., Green, R., Buskirk, A. R. Clarifying the Translational Pausing Landscape in Bacteria by Ribosome Profiling. Cell reports. 14 (4), 686-694 (2016).
  18. Reid, D. W., Shenolikar, S., Nicchitta, C. V. Simple and inexpensive ribosome profiling analysis of mRNA translation. Methods (San Diego, Calif). 91, 69-74 (2015).
  19. Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
  20. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterialbiofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7, 41114 (2017).
  21. Oh, E. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  22. Chew, G. L. Ribosome profiling reveals resemblance between long non-coding RNAs and 5' leaders of coding RNAs. Development. 140 (13), Cambridge, England. 2828-2834 (2013).
  23. Dunn, J. G., Foo, C. K., Belletier, N. G., Gavis, E. R., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals pervasive and regulated stop codon readthrough in Drosophila melanogaster. eLife. 2, 01179 (2013).
  24. Liu, M. J., et al. Translational landscape of photomorphogenic Arabidopsis. The Plant cell. 25 (10), 3699-3710 (2013).
  25. Rooijers, K., Loayza-Puch, F., Nijtmans, L. G., Agami, R. Ribosome profiling reveals features of normal and disease-associated mitochondrial translation. Nature Communications. 4, 2886 (2013).
  26. Danielle, L., et al. Fidelity of translation initiation is required for coordinated respiratory complex assembly. Science Advances. 5 (12), 2118 (2019).
  27. Zoschke, R., Watkins, K. P., Barkan, A. A rapid ribosome profiling method elucidates chloroplast ribosome behavior in vivo. The Plant cell. 25 (6), 2265-2275 (2013).
  28. Chotewutmontri, P., Barkan, A. Dynamics of chloroplast translation during chloroplast differentiation in maize. PLoS genetics. 12 (7), 1006106 (2016).
  29. Lee, S., Liu, B., Huang, S. X., Shen, B., Qian, S. B. Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).
  30. Martinez, T. F., Chu, Q., Donaldson, C., Tan, D., Shokhirev, M. N., Saghatelian, A. Accurate annotation of human protein-coding small open reading frames. Nature chemical biology. 16 (4), 458-468 (2020).
  31. Simsek, D., et al. The Mammalian Ribo-interactome Reveals Ribosome Functional Diversity and Heterogeneity. Cell. 169 (6), 1051-1065 (2017).
  32. Fritsch, C., et al. Genome-wide search for novel human uORFs and N-terminal protein extensions using ribosomal footprinting. Genome research. 22 (11), 2208-2218 (2012).
  33. Lareau, L. F., Hite, D. H., Hogan, G. J., Brown, P. O. Distinct stages of the translation elongation cycle revealed by sequencing ribosome-protected mRNA fragments. eLife. 3, 01257 (2014).
  34. Meydan, S., et al. Retapamulin-Assisted Ribosome Profiling Reveals the Alternative Bacterial Proteome. Molecular Cell. 74 (3), 481-493 (2019).
  35. Wilson, D. N. The A-Z of bacterial translation inhibitors. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 393-433 (2009).
  36. Nakahigashi, K. Comprehensive identification of translation start sites by tetracycline-inhibited ribosome profiling. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 23 (3), 193-201 (2016).
  37. Weaver, J., Mohammad, F., Buskirk, A. R., Storz, G. Identifying Small Proteins by Ribosome Profiling with Stalled Initiation Complexes. mBio. 10 (2), 02819 (2019).
  38. Nakahigashi, K. Effect of codon adaptation on codon-level and gene-level translation efficiency in vivo. BMC genomics. 15 (1), 1115 (2014).
  39. Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
  40. Michel, A. M., et al. Observation of dually decoded regions of the human genome using ribosome profiling data. Genome research. 22 (11), 2219-2229 (2012).
  41. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
  42. Young, D. J., Guydosh, N. R., Zhang, F., Hinnebusch, A. G., Green, R. Rli1/ABCE1 Recycles Terminating Ribosomes and Controls Translation Reinitiation in 3'UTRs In Vivo. Cell. 162 (4), 872-884 (2015).
  43. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
  44. Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  45. Babraham Bioinformatics. Fast QC. , Babraham Institute. Cambridgeshire. Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2021).
  46. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic acids research. 45 (2), 6 (2017).
  47. Verbruggen, S., Menschaert, G. mQC: A post-mapping data exploration tool for ribosome profiling. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 181, 104806 (2019).
  48. Cui, H., Hu, H., Zeng, J., Chen, T. DeepShape: estimating isoform-level ribosome abundance and distribution with Ribo-seq data. BMC bioinformatics. 20, Suppl 24 678 (2019).
  49. Choi, J. RiboToolkit: an integrated platform for analysis and annotation of ribosome profiling data to decode RNA translation at codon resolution. , (2021).
  50. Choi, J. Dynamics of the context-specific translation arrest by chloramphenicol and linezolid. Nature chemical biology. 16 (3), 310-317 (2020).
  51. Tompson, J., O'Connor, M., Mills, J. A., Dahlberg, A. E. The protein synthesis inhibitors, oxazolidinones and chloramphenicol, cause extensive translational inaccuracy in vivo. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 273-279 (2002).
  52. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (11), 651-664 (2015).
  53. Glaub, A., Huptas, C., Neuhaus, K., Ardern, Z. Recommendations for bacterial ribosome profiling experiments based on bioinformatic evaluation of published data. Journal of Biological Chemistry. 295, 8999-9011 (2020).
  54. Sorour, M. H., Hani, H. A., Shaalan, H. F., El-Sayed, M. M. H. Experimental screening of some chelating agents for calcium and magnesium removal from saline solutions. Desalination and Water Treatment. 57 (48-49), 22799-22808 (2015).
  55. Mohammad, F., Green, R., Buskirk, A. R. A systematically-revised ribosome profiling method for bacteria reveals pauses at single-codon resolution. Elife. 8, 42591 (2019).
  56. O'Connor, P. B., Li, G. W., Weissman, J. S., Atkins, J. F., Baranov, P. V. rRNA:mRNA pairing alters the length and the symmetry of mRNA-protected fragments in ribosome profiling experiments. Bioinformatics. 29 (12), Oxford, England. 1488-1491 (2013).
  57. Protocol for RNA Clean & Concentrator -25. Zymo Research. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_r1017_r1018_rna_clean_concentrator-25.pdf (2021).
  58. Protocol for use with NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina (E7300, E7580, E7560, E7330). New England Biolabs. , Available from: https://www.international.neb.com/protocols/2018/03/27/protocol-for-use-with-nebnext-small-rna-library-prep-set-for-illumina-e7300-e7580-e7560-e7330 (2021).

Tags

Biokjemi utgave 174
RIBO-seq i bakterier: en prøvesamling og bibliotekforberedelsesprotokoll for NGS-sekvensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P.,… More

Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P., Kovalenko, M., Starosta, A. L. RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing. J. Vis. Exp. (174), e62544, doi:10.3791/62544 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter