Estrazione del cofattore F420 per l'analisi della lunghezza della coda di poliglutammato da colture pure metanogeniche e campioni ambientali

Summary

Un metodo per l'estrazione del cofattore _F420 da colture pure è stato ottimizzato per la separazione cromatografica liquida e l'analisi della lunghezza della coda _F420 in campioni di coltura pura e ambientali.

Abstract

Il cofattore _F420 svolge un ruolo centrale come vettore di idruro nel metabolismo primario e secondario di molti taxa batterici e archeali. Il cofattore è meglio conosciuto per il suo ruolo nella metanogenesi, dove facilita reazioni termodinamicamente difficili. Poiché la coda di poliglutammato varia in lunghezza tra diversi organismi, le analisi del profilo di lunghezza potrebbero essere un potente strumento per distinguere e caratterizzare diversi gruppi e percorsi in vari habitat. Qui, il protocollo descrive l'estrazione e l'ottimizzazione del rilevamento del cofattore _F420 applicando l'estrazione in fase solida combinata con l'analisi cromatografica liquida ad alte prestazioni indipendente dagli approcci biologici culturali o molecolari. Il metodo è stato applicato per ottenere ulteriori informazioni sull'espressione del cofattore _F420 da comunità microbiche in terreni, fanghi anaerobici e colture pure ed è stato valutato mediante esperimenti di spiking. In tal modo, lo studio è riuscito a generare diversi profili di lunghezza della coda _F420 per metanogeni idrogenotrofici e acetoclastici in colture pure metanogeniche controllate, nonché da campioni ambientali come fanghi e terreni del digestore anaerobico.

Introduction

_F420 è un cofattore diffuso ma spesso trascurato, che funziona come un vettore obbligato di idruro a due elettroni nei processi metabolici primari e secondari sia di Archaea che di ^Bacteria1,2. _F420 è una 5-deazaflavina e strutturalmente simile alle flavine, per cui le sue proprietà chimiche e biologiche sono più paragonabili a quelle di NAD⁺ o NADP⁺. A causa della sostituzione dell'azoto con il carbonio in posizione 5 dell'anello isoallossiazinico, è un forte riducente, esibendo così un basso potenziale redox standard di -340 ^mV1,....

Protocol

NOTA: L'estrazione e l'analisi del cofattore _F420 è un processo in tre fasi che include la lisi del campione, la pre-purificazione del cofattore tramite estrazione in fase solida (SPE) e il rilevamento del cofattore tramite RP-HPLC accoppiato a ioni (IP-RP-HPLC) con rilevamento a fluorescenza. Prima di iniziare, preparare i materiali e i reagenti come indicato nella Tabella 1.

1. Lisi del campione

1. Aggiungere fino a 5 g di campione in provette appropriate (ad esempio, tubi conici da 50 ml).
2. Aggiungere 5 mL del tampone di lisi (2x soluzione madre, Tabella 1) ai campioni.
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Results

Le colture pure di Methanosarcina thermophila e Methanoculleus thermophilus, entrambe archee metanogeniche termofile, sono state coltivate in mezzi idonei come descritto in ^{precedenza29,30}. Per Methanosarcina thermophila, il metanolo è stato utilizzato come fonte di energia, mentre Methanoculleus thermophilus è stato coltivato su _H2 / _CO2. La crescita è stata controllata mediante valutazione micro.......

Discussion

Per la valutazione del cofattore _F420 da colture pure metanogeniche, è possibile eseguire una valutazione microscopica per visualizzare la crescita e l'attività (microscopia a fluorescenza) dei microrganismi coinvolti (Figura 1). Per i campioni derivanti da ambienti naturali, l'uso della microscopia per rilevare o quantificare _F420 è limitato a causa di interferenze con altri microrganismi fluorescenti, particelle organiche e inorganiche. In questo contesto, l'estrazion.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclave
Sistema HPLC biocompatibile dotato di modulo di gradiente, forno e rivelatore di fluorescenza	HPLC	Shimadzu
Centrifuga e rotore per 50 mL" Falco" tubi (11.000 rcf) e tubi
Colonna HPLC: Gemini NX C18, 5 μ m, 150 x 3 mm	Phenomenex		HPLC
(dimensione dei pori 0,22 &; micro; m) per rimuovere il particolato prima dell'analisi
Resina per SPE: Strata-X-AW 33 μ m come adsorbente polimerico a modalità mista anione debole	Phenomenex		sorbente polimerico a modalità mista ad anione debole
Collettore a vuoto per SPE e provette			Attrezzatura SPE Miscelatore
			a vortice