Summary
순수한 배양으로부터 보조인 F420 을 추출하는 방법은 순수한 배양 및 환경 샘플에서 F420 꼬리 길이의 액체 크로마토그래피 분리 및 분석에 최적화되었다.
Abstract
공동 인자 F420 많은 세균 및 고고학 택시의 기본 및 이차 대사에 수화물 캐리어로 중심 역할을한다. 공동 요소는 열역학적으로 어려운 반응을 용이하게 하는 메탄발생에 있는 그것의 역할로 가장 잘 알려져 있습니다. 폴리글루타메이트 꼬리는 서로 다른 유기체 들 사이의 길이가 다르기 때문에 길이 프로파일 분석은 다양한 서식지에서 다른 그룹과 경로를 구별하고 특성화하는 강력한 도구가 될 수 있습니다. 여기서, 프로토콜은 문화적 또는 분자 생물학적 접근법에 관계없이 고성능 액체 크로마토그래피 분석과 결합된 고체 상 추출을 적용하여 공동 인자 F420 검출의 추출 및 최적화를 설명한다. 이 방법은 토양, 혐기성 슬러지 및 순수 배양에서 미생물 공동체로부터 공동 인자 F420 의 발현에 대한 추가 정보를 얻기 위해 적용되었으며, 스파이크 실험에 의해 평가되었다. 이에 의해, 연구는 혐기성 소화기 슬러지 및 토양과 같은 환경 샘플뿐만 아니라 제어 메탄오제 순수 배양에서 수소 로피와 아세포 세포 세포 메탄원에 대한 다른 F420 꼬리 길이 프로파일을 생성하는 데 성공했다.
Introduction
F420은 광범위하지만 종종 무시된 공동 인자이며, 이는 Archaea와 Bacteria1,2의 1 차 및 이차 대사 과정에서 의무적인 두 전자 수화물 운반체역할을 합니다. F420은 5-deazaflavin이며 구조적으로 플라빈스와 유사하며, 이에 따라 화학 적 및 생물학적 특성은 NAD + 또는 NADP +와 더 비슷합니다. 이소알록사진 링의 위치 5에서 탄소를 가진 질소의 대체로 인해, 강력한 환원제이므로 -340 mV1,3의 낮은 표준 레독스 전위를 나타낸다. F420은 5-deazaflavin 링과 2-인산 L-락테이트 링커(F420-0)로 구성됩니다. n+1 글루타민산단모머를 함유한 올리고글루타메이트 꼬리를 분자(F420-n+1)4에 부착할 수 있다.
오랜 시간 동안, 공동 요소 F420은 전적으로 고고학과 액티노박테리아와 관련이 있다. 이것은 대체로 전복되었습니다. 최근 분석에 따르면 F420은 필라 프로테오박테리아, 클로로플렉시 및 잠재적으로 토양, 호수 및 인간 용기1,5와 같은 수많은 서식지에 거주하는 다양한 혐기성 및 호기성 유기체 사이에 분포되어 있음을 밝혔다. 2019년, Braga et al.6은, 프로테오박테리움 파라부르피테리아 리조시니카가 2인성 꼬리 대신 3인산화를 함유한 독특한 F420 유도체를 생산하는 것으로 나타났으며, 이는 다양한 서식지에서 널리 퍼질 수 있다. 도메인 Archaea 내에서, F420은 메탄오제닉7, 메탄트로피치8,9, 황산염 감소 주문10을 포함한 여러 혈통에서 발견되었으며, 타우마르마치오타11에서 생산될 예정이다. F420은 수중 영양및 메틸로트로피아제 메탄발생에 필수적인 레독스 코엔자로 가장 잘 알려져 있습니다. 감소된 형태의 F420(F420H2)은 메틸레네트라하이드로메타노페린(메틸렌-H4MPT, 메르) 및 메테닐-H4MPT12,13의 감소를 위한 전자 기증자로서 기능한다. 또한 세포크롬12,14를 함유하는 메탄오겐의 H2 독립적인 전자 수송 경로에서 전자 운반체로 사용할 수 있다. 더욱이, F420의 산화형태는 420nm에서 특이성 청록색 형광을 가지며, 이는 메탄오겐의 검출을 용이하게 한다(도 1). 그것의 낮은 redox 잠재력으로 인해, F420 용이하게 (i) 그렇지 않으면 반발성 또는 독성 유기 화합물의 넓은 스펙트럼의 외인성 감소, (ii) 연쇄상 구균체(phylum Actinobacteria)에서 테트라사이클린 및 린코사미드 항생제 또는 식물독신의 합성( phylum Actinobacteria), 및 (iii) 내균균의 산화 또는 질산염 스트레스 또는 기타 불리한 조건(phylum Actinobacteria)에 대한 저항성(phylum Actinobacteria)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. 따라서 F420의존성 옥시도레덕타스는 산업 및 제약 목적뿐만 아니라 오염된 환경의 생물 학적 개선을 위한 유망한 바이오 촉매입니다1,23. 이러한 최근 연구 결과에도 불구 하 고, 보조 자 F420의 정확한 역할은 여전히 약간 Actinobacteria 또는 다른 세균성 phyla에서 알려져 있다.
F420 생합성2,6,24에 대한 적어도 3개의 경로가 있습니다. 처음에 생합성 경로는 5-deazaflavin 생합성 및 2-인포라산 대사 분기로 나뉩니다. F420 분자의 반응성 부분은 기질 티로신과 5-아미노-6-ribitylamino-2,4 (1H, 3H)-피리미디네디온을 사용하여 FO-synthase를 통해 합성된다. 그 결과 리보플라빈 레벨 크로모포어 FO가 생성됩니다. 현재 허용되는 젖산 대사 분기 내에서 L-젖산은 L-젖산 키나아제(CofB)에 의해 2-인산-L-젖산으로 인산됩니다. 2-인-L-락테이트는 L-l-l-락틸-2-디포스포-5'-구아노신을 2-인산L-락테이트 구닐트랜스퍼라제(CofC)로 구아케한다. 다음 단계에서 L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine은 F420-02를 형성하기 위해 2-인산 L-락테이트 트랜스퍼라아제(CofD)에 의해 FO에 연결됩니다. 마지막으로, 효소 F420-0:ɣ-글루타밀 리구아제(CofE)는 조미료 단량체를 F420-0으로 리펜싱하여 다양한 숫자23,25에서 최종 공동 요소6을 형성합니다. 다른 유기체는 부착 된 글루타민산 염 잔류물의 수에 다른 패턴을 보여, 더 짧은 꼬리는 진균균에서보다 메탄오겐에 대한 발견2,25,26. 일반적으로, 메탄오겐은 2에서 3까지 꼬리 길이를 보여주고, 아세포 세포 메타노겐에서 최대 5개까지, 메타노사르키나 스프., 마이코박테리움 스프에서 발견되는 꼬리 길이는 5~7개의 글루타메이트 잔류물2,25,26,27사이입니다. 그러나, 최근 연구 결과는 긴 사슬 F420이 짧은 사슬 F420보다는 더 높은 친화력을 가진 F420 의존성 oxidoreductases에 결합한다는 것을 보여주었습니다; 더욱이, 바운드 롱체인 F420은 기판 선호도를 증가시킵니다만, 각 효소의 회전율은 감소한다23.
보조 자인 F420의 검출은 종종 형광에 기초한다. 따라서 올리고 글루타민트 파생은 반전 단계(RP)-HPLC27,28을 사용하여 분리되었다. 최근에는 테트라부틸람모늄 수산화를 음전하 글루타민산꼬리에 대한 이온 페어링 시약으로 사용하여 RP-HLPC에 대한 분리를 성공적으로 향상시켰습니다5. 여기서, 우리는 순수한 배양뿐만 아니라 다른 환경 샘플(즉, 토양 및 소화기 슬러지)에서 시료, 후속 용해, 추출, 정제, 분리 및 정량화를 위한 방법을 제시한다.
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Protocol
참고: 보조 자인 F420 의 추출 및 분석은 형광 검출을 통한 이온 페어링 RP-HPLC(IP-RP-HPLC)를 통한 샘플 리시스, 고체 상 추출(SPE)을 통한 공동 재정화, 공동 요인 검출을 포함하는 3단계 공정이다. 시작하기 전에 표 1에 명시된 바와 같이 재료와 시약을 준비합니다.
1. 샘플 리시스
- 적절한 튜브(예: 50mL 원문 튜브)에 최대 5g의 샘플을 추가합니다.
- 샘플에 용해 버퍼(2배 재고 용액, 표 1)의 5mL를 추가합니다.
- 증류수로 10mL의 최종 부피를 가져와 최종 농도0.5g·mL-1에 도달하십시오.
- 20 초 동안 희석 된 샘플을 소용돌이.
- 121 °C에서 30 분 동안 오토 클레이브.
- 삼림 토양과 같은 건조 한 샘플의 경우, 희석 된 샘플을 autoclaving 후 증류수와 20 mL의 최종 부피를 가져.
주의: 오토클레이브 중 온도 상승으로 인해 튜브가 파열될 수 있습니다.
2. 고체위상 추출(SPE)을 통한 공동요소 F 420 의 사전 정제
참고: SPE의 모든 단계는 실온에서 수행됩니다.
- 샘플을 실온으로 식힙니다.
- 11,000 x g에서 5 분 동안 자동 식 시료를 원심 분리 합니다.
- 약한 음이온 혼합 모드 폴리머릭 소벤트 100 mg으로 채워진 5mL SPE 컬럼을 준비합니다.
- 메탄올3mL로 이온 교환기(조건 용액, 표 1)를 조건부로 조건부.
- 증류수 3mL(평형 용액, 표 1)으로 음이온 교환기를 평형화합니다.
- 원심분리된 리세이트에서 SPE 열에 최대 9.0mL의 화물을 로드합니다.
- 25m 암모늄 아세테이트(SPE 워시 용액 1, 표 1)의 5mL로 불순물을 씻어내다.
- 메탄올 5mL(SPE 워시 용액 2, 표 1)로 불순물을 씻어내라.
- 1.0mL의 용출 버퍼(표 1)에서 공동 요소 F420을 엘테.
참고: 신선한 용출 버퍼를 준비합니다. 용출 버퍼의 적용 된 진공 및 높은 증기 압력으로 인해 용출 볼륨은 샘플마다 다를 수 있습니다. 모든 샘플에서 동일한 최종 부피를 확보하기 위해 용출 전후의 수집 용기의 무게를 측정하고 효과적인 용출 량을 계산하는 것이 좋습니다. 용출 버퍼를 추가하여 차이를 균형 조정합니다.
3. 보조 자F420의 검출
- 오븐을 40°C로 설정하고 형광 검출기를 420nm 소멸 파장 및 470 nm 방출 파장에 설정합니다. 이동단계 A와 B(표 1)를 사용하여 그라데이션 모드를 통한 분리 달성: 0-3분: 26% B; 3-24 분: 26%-50% B; 24-25 분 : 50 % B; 25-27 분 : 50 %-26 % B; 27-35 분 : 0.75 mL의 유량으로 26 % B, 분 -1.
참고: 적어도 3개의 열 볼륨으로 컬럼을 플러시하여 컬럼을 주입하기 전에 컬럼 조건의 평형을 보장합니다.- 0.22 μm의 모공 크기가 있는 PTFE 필터를 사용하여 SPE에서 HPLC 바이알로 용출된 샘플을 필터링합니다.
참고: 0.22 μm크기의 PTFE 필터를 권장합니다. - EPLC 시스템에 용출된 시료의 50 μL을 주입하여 보조 자인 F420 조성 및 농도를 분석합니다.
참고: 이 프로토콜에 정량적 표준이 사용되지 않는 경우 샘플과 변형을 피크 영역별로 비교해야 합니다.
- 0.22 μm의 모공 크기가 있는 PTFE 필터를 사용하여 SPE에서 HPLC 바이알로 용출된 샘플을 필터링합니다.
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Representative Results
메탄노사피나 열애와 메탄오쿨레우스 열애의 순수한 배양, 열성성 메탄생성성 고고학모두 이전에 설명된 바와 같이 적합한 배지에서 재배되었다29,30. 메탄노사피나 열애의 경우 메탄올이 에너지원으로 사용되었지만, 메탄모쿨레우스 열애는 H2/CO2에서 재배되었다. 성장은 현미경 평가에 의해 검사되었으며, 활동은 이전에 설명된 바와 같이 가스 크로마토그래피에 의한 메탄(CH4)의 측정을 통해 조사되었다31. 순수한 배양은 제시된 프로토콜에 따라 보조 인자 F420의 추출에 사용되었다. 또한, 중구 바이오가스 원자로 슬러지(폐수 처리장, 지얼, 오스트리아)의 샘플을 포함한 환경 샘플을 포함한 환경 샘플은 슬러지 파라미터에 대한 자세한 내용은 32를 참조하십시오, 농업적으로 사용되는 초원(인스브루크, 오스트리아), 산림 토양(Lans, 오스트리아)은 2020년 가을에 공동의 추출 및 분석을 위해 채취하였다.
순수한 배양의 성장은 현미경 검사법(도 1)에 의해 확인되었으며, 14일 동안 가스 크로마토그래피를 통해 분석된 CH4 (데이터가 표시되지 않음). 순수한 배양에서 추출한 공동 요소 F420 추출의 효율은 0.5-1.0mm 세라믹 비트, 초음파 처리 및 압력 온도 붕괴(121°C 및 1.2 바 압력(autoclaving)를 사용하여 비트-박동과 같은 다양한 분해 전략을 적용하여 테스트되었습니다. 프로토콜 섹션에 설명된 바와 같이 버퍼를 적용하는 압력 온도 처리를 사용하여 최대 추출 효율이 명백해졌으며, 따라서 모든 후속 실험에 더 적용하였다(도 2). 추출 효율 테스트는 잘 성장하는 메탄오쿨레우스 열성 배양의 상이한 부피를 표준으로 추가하여 수행되었다. 더욱이, 다른 샘플과 변이체의 비교는 크로마토그램에서 피크 영역을 기반으로했다.
그 후, 세포 추출물은 고체 상 추출(SPE) 절차를 거쳤다. 이를 위해 다른 이온 교환기를 테스트했습니다. 약한 음이온 혼합 모드 폴리머릭 소광이 용출 후 가장 높은 양의 보조자 F420 을 산출한 것으로 나타났습니다. 또한, 상이한 용출 완충제 및 세척 용액을 테스트하고 용출 완충제로서 메탄올에 있는 NH3 의 세척 완충제 및 혼합물로서 25m 암모늄 아세테이트에 대한 최상의 결과를 보여주었다. 용출 단계에서 메탄올은 진공 온도 처리를 통해 물과 용출 후 교환 될 수있다.
공동 요소 F420 의 HPLC 분석은 NX C18 컬럼을 통해 제시된 연구 기간 동안 달성된 시스템 구성에 가장 적합한 결과를 가진 다른 C18 컬럼으로 테스트되었습니다. 다양한 글루타메이트 꼬리 길이를 가진 F420 의 공지된 분포를 포함하는 표준이 참조 목적으로 사용되었다. 이 표준은 친절하게 호주 국립 대학에서 교수 콜린 잭슨에 의해 제공되었다. 글루타메이트 꼬리 길이의 분석은 보조인 F420 의 전반적인 농도와 메탄원성 순수 배양 및 환경 샘플의 F420 꼬리 길이의 분포에 있는 차이를 드러냈습니다(그림 3).
| 완충기 | 구성 |
| 리시스 버퍼(2배 재고 솔루션) | 200 mM 칼륨 이수소 인산염 (KH2PO4) 50 mM 에틸렌디아민테트라아세산 (EDTA) 1% (w/v) 폴리소르바테 80 (트웬 80) 5M 나트륨 수산화용액으로 pH 7.0으로 조정 |
| SPE 컨디셔닝 솔루션 | 메탄올 (HPLC 등급) |
| SPE 평형 솔루션 | 증류수 0.2 μm 여과 |
| SPE 워시 솔루션 1 | 25 mM 암모늄 아세테이트 |
| SPE 워시 솔루션 2 | 메탄올 (HPLC 등급) |
| SPE 용출 버퍼 | 메탄올에서 2%(v/v) 암모니아 20%-25% 수성 암모니아 용액을 희석시켜 메탄올 |
| HPLC 모바일 단계 A | 10 mM 테트라부틸람모늄 수산화 (TBAH) 20 mM 디암모늄 인산염 (NH4)2HPO4) 85% 인산으로 pH 7.0으로 조정 |
| HPLC 모바일 단계 B | 아세토닐릴 (HPLC 등급) |
표 1: 고체 위상 추출(SPE) 및 HPLC 분석을 위한 버퍼 및 모바일 위상 조성.
그림 1: 형광 메탄오겐성 순수 배양. (A) 위상 대비 현미경 을 통해 메탄Osarcina 열필라의 시각화 및 (B) 형광 현미경 검사법은 보조 인자 F420이 UV 빛으로 흥분할 때 (395-440 nm에서 흥분및 475-495 nm에서 방출). 스케일 바: 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 표준 추가. SPE 후 회수된 공동 요소 F420 의 피크 영역은 M. 열성균 배양의 다른 부피로 급증한 매트릭스 1.0g에서 SPE 후. 매트릭스는 0 μL, 250 μL, 500 μL, 750 μL 및 1000 μL 의 문화로 개정되었으며 비트 박동, 초음파 처리 및 압력 온도 붕괴 (autoclaving)와 같은 다양한 붕괴 전략을 거쳤습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 글루타메이트 꼬리 길이 분포. 순수한 배양 및 환경 샘플의 공동 요소 F420 꼬리 길이 분포. 위에서 아래로: 농업으로 사용되는 초원 (토양), 숲 (토양), 중구 생물 가스 반응기, M. 열성 애호가 의 순수한 문화, M . thermophila 의 순수한 문화. 상대흡광도는 도시된 크로마토그램 내에서 가장 높은 피크에 대한 정상화에 의해 계산되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
메탄원성 순수 배양으로부터의 공동인자 F420의 평가를 위해, 관련 미생물의 성장 및 활성(형광 현미경 검사법)을 시각화하기 위해 현미경 평가를 수행할 수 있다(도 1). 자연 환경에서 파생되는 시료의 경우, F420을 감지하거나 정량화하기 위해 현미경을 사용하는 것은 다른 형광 미생물, 유기 및 무기 입자와의 간섭으로 인해 제한됩니다. 이러한 맥락에서, 이전에 설명된 바와 같이 HPLC를 이용한 F420 및 후속 형광 분석의 추출은 보조인 F420의 전반적인 농도뿐만 아니라 다과상 꼬리 길이 분포에 대한 정보를 제공할 수 있다.
보조자 F420의 추출을 위해, 압력 온도 처리는 매우 효과적인 것으로 나타났다 (도 2) 이전 연구 결과에 따라5,27,33. 이러한 방법을 통해 EDTA 및 다형성염을 포함한 인산염 완충리 시스템을 적용하고, 높은 농도의 보조자 F420을 높은 농도의 응력 F420은 고농도의 인자를 포함하는 메탄생성 순수 배양으로부터 얻어졌다. 또한 (그리고 다른 테스트 된 세포 중단 방법과 비교하여), 압력 온도 처리는 쉽게 적용 가능하고 물질 절약.
SPE는 샘플 내에서 공동 인자 F420 폴리글루타메이트 꼬리 길이 분포의 측정을 목표로 다운스트림 HPLC 분석을 가능하게 하기 위해 수행되었다. 다양한 이온 교환기 중, 약한 음이온 혼합 모드 폴리머릭 소벤트는 최상의 성능을 보였으며, 원치 않는 부산물을 세척한 후 추출 매트릭스에서 후속 제거뿐만 아니라 세척 목적으로 동급자 F420 의 효과적인 결합을 가능하게 한다. 이를 위해 기본적인 메탄올이 가장 잘 입증되었습니다.
제시된 방법을 통해, 다양한 순수 배양 및 환경 샘플은 공동 인자 F420 에 관하여 재현적으로 분석될 수 있었다(도 3). 원치 않는 부산물의 높은 비율을 포함하는 토양 또는 슬러지와 같은 샘플조차도 제시된 절차에 의해 분석될 수 있었다. 따라서, HPLC를 통한 다운스트림 분석은 F420 의 총 농도와 F420 유도체의 폴리글루타메이트 꼬리의 길이 분포를 분석하기 위해 성공적으로 구현되었다. 토양 및 기타 샘플에서 높은 수준의 F420 을 검출하면 유전체 및 메타뇨학 분석에 기반한 호기성 토양 박테리아에서 공동 인자가 널리 퍼질 것을 제안한 Ney et el.5를 지원합니다.
요약하자면, 이것은 순수한 문화뿐만 아니라 토양이나 슬러지와 같은 환경 샘플에서 공동 요소 F420 을 추출하고 분석하는 것을 목표로하는 첫 번째 프로토콜입니다. 환경 샘플에서 F420 을 추출하는 데 가장 중요한 단계는 후속 HPLC 분석을 위해 용액의 사전 정리에 필요한 SPE입니다. 제시된 프로토콜은 향후 프로젝트가 다양한 환경 과 바이오 프로세스에서 F420 의 역할을 밝히는 데 도움이 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 감사하게 정제 된 공동 요소 F420와 지원에 대한 교수 콜린 잭슨 감사합니다. 이 연구는 티롤리안 과학 기금 (TWF)과 유니버시테트 인스 브루크 (Publikationsfonds)에 의해 지원되었다. 우리는 GPS, 홍콩, SB, GG 및 HB의 지원을 크게 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | |||
| Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector | Shimadzu | HPLC system | |
| Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes | |||
| HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mm | Phenomenex | HPLC column | |
| PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis | |||
| Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbent | Phenomenex | weak anion mixed-mode polymeric sorbent | |
| Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes | SPE equipment | ||
| Vortex mixer |
References
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