Summary
शुद्ध संस्कृतियों से cofactor F420 के निष्कर्षण के लिए एक विधि तरल क्रोमैटोग्राफिक अलगाव और शुद्ध संस्कृति और पर्यावरण यी नमूनों में F420 पूंछ लंबाई के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया गया था।
Abstract
Cofactor F420 कई जीवाणु और archaeal taxa के प्राथमिक और माध्यमिक चयापचय में एक हाइड्राइड वाहक के रूप में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है। कोफ़ैक्टर को मेथेनोजेनेसिस में अपनी भूमिका के लिए जाना जाता है, जहां यह थर्मोडायनामिक रूप से कठिन प्रतिक्रियाओं की सुविधा प्रदान करता है। चूंकि पॉलीग्लूटामेट पूंछ विभिन्न जीवों के बीच लंबाई में भिन्न होती है, लंबाई प्रोफ़ाइल विश्लेषण विभिन्न आवासों में विभिन्न समूहों और मार्गों को अलग करने और विशेषता के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है। यहां, प्रोटोकॉल सांस्कृतिक या आणविक जैविक दृष्टिकोणों से स्वतंत्र उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी विश्लेषण के साथ संयुक्त ठोस-चरण निष्कर्षण को लागू करके कोफ़ैक्टर F420 का पता लगाने के निष्कर्षण और अनुकूलन का वर्णन करता है। इस विधि को मिट्टी, अवायवीय कीचड़ और शुद्ध संस्कृतियों में माइक्रोबियल समुदायों से कोफ़ैक्टर F420 की अभिव्यक्ति पर अतिरिक्त जानकारी प्राप्त करने के लिए लागू किया गया था और स्पाइकिंग प्रयोगों द्वारा मूल्यांकन किया गया था। इस प्रकार, अध्ययन नियंत्रित मेथेनोजेनिक शुद्ध संस्कृतियों में हाइड्रोजनोट्रोफिक और एसिटोक्लास्टिक मेथेनोजेन के साथ-साथ एनारोबिक डाइजेस्टर कीचड़ और मिट्टी जैसे पर्यावरणीय नमूनों से हाइड्रोजनोट्रोफिक और एसिटोक्लास्टिक मेथेनोजेन के लिए विभिन्न एफ 420 पूंछ-लंबाई प्रोफाइल उत्पन्न करने में सफल रहा।
Introduction
F420 एक व्यापक लेकिन अक्सर उपेक्षित cofactor है, जो Archaea और Bacteria1,2 दोनों की प्राथमिक और माध्यमिक चयापचय प्रक्रियाओं में एक बाध्य दो-इलेक्ट्रॉन हाइड्राइड वाहक के रूप में कार्य करता है। F420 एक 5-deazaflavin है और संरचनात्मक रूप से flavins के समान है, जिससे इसके रासायनिक और जैविक गुण NAD + या NADP + के उन लोगों के साथ अधिक तुलनीय हैं। isoalloxazine अंगूठी की स्थिति 5 पर कार्बन के साथ नाइट्रोजन के प्रतिस्थापन के कारण, यह एक मजबूत रिडक्टेंट है, इस प्रकार -340 mV1,3 की कम मानक रेडॉक्स क्षमता का प्रदर्शन करता है। F420 में एक 5-deazaflavin अंगूठी और एक 2-फॉस्फो-एल-लैक्टेट लिंकर (F420-0) शामिल है। एन + 1 ग्लूटामेट मोनोमर्स युक्त एक ओलिगोग्लूटामेट पूंछ को अणु (F420-n + 1)4 से जोड़ा जा सकता है।
एक लंबे समय के लिए, cofactor F420 पूरी तरह से Archaea और Actinobacteria के साथ जुड़ा हुआ है। इसे काफी हद तक पलट दिया गया है। हाल के विश्लेषणों से पता चला है कि F420 को फाइला प्रोटिओबैक्टीरिया, क्लोरोफ्लेक्सी के विविध अवायवीय और एरोबिक जीवों के बीच वितरित किया जाता है, और संभावित रूप से फर्मिक्यूट्स मिट्टी, झीलों और मानव आंत 1,5 जैसे असंख्य आवासों में रहते हैं। 2019 में, Braga et al.6, से पता चला है कि proteobacterium Paraburkholderia rhizoxinica एक अद्वितीय F420 व्युत्पन्न का उत्पादन करता है, जिसमें 2-फॉस्फोलेक्टेट पूंछ के बजाय 3-फॉस्फोग्लिसरेट होता है, जो विभिन्न आवासों में व्यापक हो सकता है। डोमेन Archaea के भीतर, F420 कई वंशों में पाया गया है, जिसमें मेथेनोजेनिक 7, मेथानोट्रोफिक 8, 9, और सल्फेट-कम करने वाले ऑर्डर 10 शामिल हैं, और इसे थाउमरचायोटा 11 में उत्पादित किया जाना चाहिए। F420 को हाइड्रोजनोट्रॉफिक और मेथिलोट्रोफिक मेथेनोजेनेसिस में एक आवश्यक रेडॉक्स कोएंजाइम के रूप में जाना जाता है। F420 (F420H2) का कम रूप मेथिलीनटेट्राहाइड्रोमेथेनोप्टेरिन (मेथिलीन-H4MPT, Mer) और मेथेनिल-H4MPT12,13 की कमी के लिए एक इलेक्ट्रॉन दाता के रूप में कार्य करता है। इसका उपयोग साइटोक्रोम 12,14 युक्त मेथेनोजेन के एच 2-स्वतंत्र इलेक्ट्रॉन परिवहन मार्गों में एक इलेक्ट्रॉन वाहक के रूप में भी किया जा सकता है। इसके अलावा, F420 के ऑक्सीकरण रूप में 420 एनएम पर उत्तेजना पर एक विशेषता नीले-हरे रंग की प्रतिदीप्ति होती है, जो माइक्रोस्कोपिक रूप से मेथेनोजेन का पता लगाने की सुविधा प्रदान करती है (चित्रा 1)। इसकी कम रेडॉक्स क्षमता के कारण, F420 सुविधा प्रदान करता है (i) अन्यथा अड़ियल या विषाक्त कार्बनिक यौगिकों के एक व्यापक स्पेक्ट्रम की बहिर्जात कमी, (ii) टेट्रासाइक्लिन और लिनकोसामाइड एंटीबायोटिक दवाओं या स्ट्रेप्टोमाइसेट्स (फाइलम एक्टिनोबैक्टीरिया) में फाइटोटॉक्सिन का संश्लेषण, और (iii) ऑक्सीडेटिव या नाइट्रोसेटिव तनाव या माइकोबैक्टीरिया में अन्य प्रतिकूल स्थितियों के लिए प्रतिरोध (फाइलम एक्टिनोबैक्टीरिया)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. नतीजतन, F420-निर्भर oxidoreductases औद्योगिक और दवा उद्देश्यों के साथ-साथ दूषित वातावरण के बायोरेमेडिएशन के लिए बायोकैटालिस्ट का वादा कर रहे हैं1,23। इन हाल के निष्कर्षों के बावजूद, cofactor F420 की सटीक भूमिकाअभी भी एक्टिनोबैक्टीरिया या अन्य जीवाणु फाइला में मामूली रूप से ज्ञात है।
F420 जैवसंश्लेषण 2,6,24 के लिए कम से कम तीन रास्ते हैं। शुरुआत में, जैवसंश्लेषण मार्ग को 5-deazaflavin जैवसंश्लेषण और 2-फॉस्फोलेक्टेट चयापचय शाखा में विभाजित किया जाता है। F420 अणु के प्रतिक्रियाशील भाग को FO-synthase के माध्यम से संश्लेषित किया जाता है, जो सब्सट्रेट्स टायरोसिन और 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedione का उपयोग करता है। परिणाम राइबोफ्लेविन स्तर क्रोमोफोर एफओ है। वर्तमान में स्वीकृत लैक्टेट चयापचय शाखा के भीतर, एल-लैक्टेट को एल-लैक्टेट किनेज (कोएफबी) द्वारा 2-फॉस्फो-फॉस्फो-एल-लैक्टेट के लिए फॉस्फोराइलेटेड किया जाता है; 2-फॉस्फो-एल-लैक्टेट, बदले में, 2-फॉस्फो-एल-लैक्टेट गुआनिलट्रांसफरेज़ (सीओएफसी) द्वारा एल-लैक्टिल-2-डिफॉस्फो-5'-गुआनोसिन के लिए गुआनिलेटेड है। अगले चरण में, L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine को FO से 2-फॉस्फो-L-lactate transferase (CofD) द्वारा F420-02 बनाने के लिए जोड़ा गया है। अंत में, एंजाइम F420-0: π-glutamyl ligase (CofE) ग्लूटामेट मोनोमर्स को F420-0 पर लिगेट करता है, जो अलग-अलग संख्याओं में अंतिम cofactor6 बनाता है23,25। विभिन्न जीव संलग्न ग्लूटामेट अवशेषों की संख्या में अलग-अलग पैटर्न दिखाते हैं, जिसमें माइकोबैक्टीरिया 2,25,26 की तुलना में मेथेनोजेन के लिए छोटी पूंछ पाई जाती है। आम तौर पर, मेथेनोजेन दो से तीन तक पूंछ की लंबाई दिखाते हैं, जिसमें एसिटोक्लास्टिक मेथेनोजेन, मेथानोसारसिना एसपी में पांच तक होते हैं, जबकि माइकोबैक्टीरियम एसपी में पाई जाने वाली पूंछ की लंबाई पांच से सात ग्लूटामेट अवशेष2,25,26,27 तक होती है। हालांकि, हाल के निष्कर्षों से पता चला है कि लंबी श्रृंखला F420 शॉर्ट-चेन F420 की तुलना में उच्च आत्मीयता के साथ F420-निर्भर ऑक्सीडोरेडक्टेस को बांधती है; इसके अलावा, बाध्य लंबी श्रृंखला F420 सब्सट्रेट आत्मीयता बढ़ जाती है लेकिन संबंधित एंजाइमों की टर्नओवर दर कम हो जाती है23.
Cofactor F420 का पता लगाना अक्सर इसकी प्रतिदीप्ति पर आधारित होता है। इस प्रकार, इसके ओलिगो ग्लूटामेट डेरिवेट्स को उलट-चरण (आरपी) -एचपीएलसी 27,28 का उपयोग करके अलग किया गया था। हाल ही में, नेय एट अल ने आरपी-एचएलपीसी पर अलगाव को बढ़ाने के लिए नकारात्मक रूप से चार्ज ग्लूटामेट पूंछ के लिए आयन-युग्मन अभिकर्मक के रूप में टेट्राब्यूटिलामोनियम हाइड्रॉक्साइड का उपयोग सफलतापूर्वक किया। यहां, हम नमूनों की तैयारी के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं, बाद में लाइसिस, निष्कर्षण, शुद्धिकरण, अलगाव, और कोफ़ैक्टर F420 का परिमाणीकरण न केवल शुद्ध संस्कृतियों से बल्कि विभिन्न पर्यावरणीय नमूनों (यानी, मिट्टी और डाइजेस्टर कीचड़) से भी।
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Protocol
नोट: निष्कर्षण और cofactor F420 का विश्लेषण नमूना lysis, ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) के माध्यम से cofactor पूर्व शुद्धिकरण सहित एक तीन कदम की प्रक्रिया है, और प्रतिदीप्ति का पता लगाने के साथ आयन-युग्मित-RP-HPLC (आईपी-आरपी-HPLC) के माध्यम से cofactor का पता लगाने. शुरू करने से पहले, सामग्री और अभिकर्मकों को तैयार करें जैसा कि तालिका 1 में बताया गया है।
1. नमूना लाइसिस
- उपयुक्त ट्यूबों (उदाहरण के लिए, 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब) के लिए नमूना के 5 ग्राम तक जोड़ें।
- नमूनों के लिए lysis बफर (2x स्टॉक समाधान, तालिका 1) के 5 mL जोड़ें।
- 0.5 g·mL-1 की अंतिम सांद्रता तक पहुंचने के लिए आसुत जल के साथ 10 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में लाएं।
- भंवर 20 s के लिए पतला नमूने.
- 121 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए आटोक्लेव।
- वन मिट्टी जैसे सूखे नमूनों के लिए, ऑटोक्लेविंग के बाद आसुत पानी के साथ 20 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में लाएं और पतला नमूना भंवर करें।
चेतावनी: ऑटोक्लेविंग के दौरान तापमान में वृद्धि ट्यूबों को फटने का कारण बन सकती है।
2. ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) के माध्यम से cofactor एफ 420 के पूर्व शुद्धिकरण
नोट: एसपीई के सभी चरण कमरे के तापमान पर आयोजित किए जाते हैं
- कमरे के तापमान के लिए नमूनों को ठंडा करें।
- 11,000 x g पर 5 मिनट के लिए autoclaved नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें।
- कमजोर अनियन मिश्रित मोड बहुलक सॉर्बेंट के 100 मिलीग्राम से भरे 5 एमएल एसपीई कॉलम तैयार करें।
- मेथनॉल के 3 एमएल के साथ अनियन एक्सचेंजर की स्थिति (स्थिति समाधान, तालिका 1)।
- आसुत पानी के 3 मिलीलीटर के साथ अनियन एक्सचेंजर को संतुलित करें (संतुलन समाधान, तालिका 1)।
- एसपीई कॉलम पर सेंट्रीफ्यूज्ड लिसेट से supernatant के 9.0 mL तक लोड करें।
- 25 mM अमोनियम एसीटेट के 5 mL के साथ अशुद्धियों को धोएं (SPE वॉश समाधान 1, तालिका 1)।
- मेथनॉल के 5 मिलीलीटर के साथ अशुद्धियों को धोएं (एसपीई वॉश समाधान 2, तालिका 1)।
- 1.0 मिलीलीटर क्षालन बफर (तालिका 1) में cofactor F420 elute.
नोट: ताजा क्षालन बफर तैयार करें। लागू वैक्यूम और क्षालन बफर के उच्च वाष्प दबाव के कारण, क्षालन वॉल्यूम नमूने से नमूने में भिन्न हो सकते हैं। सभी नमूनों में एक ही अंतिम मात्रा को सुरक्षित करने के लिए, क्षालन से पहले और बाद में संग्रह जहाजों का वजन करने और प्रभावी क्षालन मात्रा की गणना करने की सिफारिश की जाती है। क्षालन बफर के अतिरिक्त द्वारा अंतर संतुलन.
3. cofactor F420 का पता लगाना
- ओवन को 40 डिग्री सेल्सियस और प्रतिदीप्ति डिटेक्टर को 420 एनएम विलुप्त होने-तरंग दैर्ध्य और 470 एनएम उत्सर्जन-तरंग दैर्ध्य पर सेट करें। मोबाइल चरणों ए और बी (तालिका 1) का उपयोग करके ग्रेडिएंट मोड के माध्यम से अलगाव प्राप्त करें: 0-3 मिनट: 26% बी; 3-24 मिनट: 26%-50% बी; 24-25 मिनट: 50% बी; 25-27 मिनट: 50%-26% बी; 27-35 मिनट: 0.75 mL ·min-1 की प्रवाह दर पर 26% B।
नोट:: 74% मोबाइल चरण A और 26% मोबाइल चरण B (तालिका 1) के 3 स्तंभ वॉल्यूम के साथ स्तंभ flushing द्वारा कम से कम स्तंभ flushing द्वारा नमूने इंजेक्ट करने से पहले स्तंभ शर्तों के संतुलन की गारंटी।- 0.22 μm के एक ताकना आकार के साथ एक PTFE फ़िल्टर का उपयोग कर HPLC शीशियों में एसपीई से eluted नमूनों फ़िल्टर।
नोट: 0.22 μm के एक ताकना आकार के साथ PTFE फ़िल्टर की सिफारिश की जाती है। - Cofactor F420 संरचना और एकाग्रता का विश्लेषण करने के लिए HPLC प्रणाली पर eluted नमूने के 50 μL इंजेक्ट करें।
नोट: चूंकि इस प्रोटोकॉल में कोई मात्रात्मक मानक का उपयोग नहीं किया जाता है, इसलिए नमूनों और वेरिएंट की तुलना पीक क्षेत्र द्वारा की जानी चाहिए।
- 0.22 μm के एक ताकना आकार के साथ एक PTFE फ़िल्टर का उपयोग कर HPLC शीशियों में एसपीई से eluted नमूनों फ़िल्टर।
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Representative Results
Methanosarcina thermophila और Methanoculleus thermophilus की शुद्ध संस्कृतियों, दोनों thermophilic methanogenic Archaea, उपयुक्त मीडिया में उगाया गया था जैसा कि पहले वर्णित किया गया था29,30। Methanosarcina thermophila के लिए, मेथनॉल का उपयोग ऊर्जा स्रोत के रूप में किया गया था, जबकि मेथानोकुलस थर्मोफिलस को H2 / CO2 पर उगाया गया था। माइक्रोस्कोपिक मूल्यांकन द्वारा विकास की जांच की गई थी, जबकि गैस क्रोमैटोग्राफी द्वारा मीथेन (CH4) के माप के माध्यम से गतिविधि की जांच की गई थी जैसा कि पहले वर्णित किया गया था31। शुद्ध संस्कृतियों का उपयोग प्रस्तुत प्रोटोकॉल के अनुसार cofactor F420 के निष्कर्षण के लिए किया गया था। इसके अलावा, एक मेसोफिलिक बायोगैस रिएक्टर कीचड़ (अपशिष्ट जल उपचार संयंत्र, ज़िर्ल, ऑस्ट्रिया; कीचड़ मापदंडों के बारे में विवरण के लिए, कृपया 32 देखें), एक कृषि रूप से उपयोग किए जाने वाले घास का मैदान (Innsbruck, ऑस्ट्रिया), और वन मिट्टी (लैंस, ऑस्ट्रिया) के नमूनों सहित पर्यावरणीय नमूने शरद ऋतु 2020 में कोफ़ैक्टर F420 के निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए लिए गए थे।
शुद्ध संस्कृतियों के विकास को माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1) द्वारा सत्यापित किया गया है, जिसमें उत्पादित CH4 का विश्लेषण इनक्यूबेशन के 14 दिनों के दौरान गैस क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से किया गया था (डेटा नहीं दिखाया गया है)। शुद्ध संस्कृतियों से cofactor F420 निष्कर्षण की दक्षता विभिन्न विघटन रणनीतियों को लागू करके परीक्षण किया गया था: 0.5-1.0 मिमी सिरेमिक धड़कता है, अल्ट्रासोनिक उपचार, और दबाव-तापमान विघटन का उपयोग करके 121 डिग्री सेल्सियस और 1.2 बार दबाव (autoclaving) का उपयोग करके बीट-बीटिंग। प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित एक बफर को लागू करने वाले दबाव-तापमान उपचार का उपयोग करके अधिकतम निष्कर्षण दक्षता स्पष्ट हो गई और इस प्रकार बाद के सभी प्रयोगों (चित्रा 2) के लिए आगे लागू किया गया था। निष्कर्षण दक्षता परीक्षण एक अच्छी तरह से बढ़ते मेथानोकुलस थर्मोफिलस संस्कृति के विभिन्न संस्करणों के मानक जोड़ के माध्यम से किए गए थे। इसके अलावा, विभिन्न नमूनों और वेरिएंट की तुलना क्रोमैटोग्राम से पीक क्षेत्र पर आधारित थी।
बाद में, सेल अर्क को एक ठोस-चरण निष्कर्षण (एसपीई) प्रक्रिया के अधीन किया गया था। इस उद्देश्य के लिए, विभिन्न आयन एक्सचेंजर्स का परीक्षण किया गया था। यह पता चला है कि एक कमजोर अनियन मिश्रित-मोड बहुलक सॉर्बेंट ने क्षालन के बाद कोफ़ैक्टर F420 की उच्चतम मात्रा प्राप्त की। इसके अलावा, विभिन्न क्षालन बफर और धोने के समाधान का परीक्षण किया गया था और 25 एमएम अमोनियम एसीटेट के लिए एक वॉश बफर के रूप में सबसे अच्छे परिणाम दिखाए गए थे और एक क्षालन बफर के रूप में मेथनॉल में एनएच 3 का मिश्रण था। क्षालन चरण से मेथनॉल को वैक्यूम-तापमान उपचार के माध्यम से पानी के साथ क्षालन के बाद आदान-प्रदान किया जा सकता है।
Cofactor F420 के HPLC विश्लेषण का परीक्षण विभिन्न C18 स्तंभों के साथ किया गया था, जिसमें एक NX C18 स्तंभ के साथ प्रस्तुत अध्ययन के दौरान प्राप्त सिस्टम कॉन्फ़िगरेशन के लिए सर्वोत्तम परिणाम थे। अलग-अलग ग्लूटामेट पूंछ की लंबाई के साथ F420 व्युत्पत्ति के ज्ञात वितरण वाले एक मानक का उपयोग संदर्भ उद्देश्यों के लिए किया गया था। यह मानक कृपया ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय विश्वविद्यालय के प्रोफेसर कॉलिन जैक्सन द्वारा प्रदान किया गया था। ग्लूटामेट पूंछ की लंबाई के विश्लेषण से कोफ़ैक्टर F420 की समग्र एकाग्रता और मेथेनोजेनिक शुद्ध संस्कृतियों और पर्यावरणीय नमूनों की F420 पूंछ की लंबाई के वितरण में अंतर का पता चला (चित्रा 3)।
| बफ़र | संयोजन |
| Lysis बफर (2x स्टॉक समाधान) | 200 mM पोटेशियम डाइहाइड्रोजन फॉस्फेट (KH2PO4) 50 mM ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) 1% (w/v) polysorbate 80 (Tween 80) 5 एम सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान के साथ पीएच 7.0 के लिए समायोजित |
| SPE कंडीशनिंग समाधान | मेथनॉल (HPLC ग्रेड) |
| SPE संतुलन समाधान | आसुत पानी 0.2 μm फ़िल्टर |
| SPE धोने का घोल 1 | 25 mM अमोनियम एसीटेट |
| एसपीई धोने का घोल 2 | मेथनॉल (HPLC ग्रेड) |
| SPE क्षालन बफर | मेथनॉल में 20% -25% जलीय अमोनिया समाधान को पतला करके मेथनॉल में 2% (v / v) अमोनिया |
| HPLC मोबाइल चरण A | 10 mM tetrabutylammonium हाइड्रॉक्साइड (TBAH) 20 mM di-ammonium hydrogen phosphate ((NH4)2HPO4) 85% फॉस्फोरिक एसिड के साथ पीएच 7.0 में समायोजित |
| HPLC मोबाइल चरण B | एसिटोनिट्राइल (HPLC ग्रेड) |
तालिका 1: ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) और एचपीएलसी विश्लेषण के लिए बफर और मोबाइल चरण संरचना।
चित्रा 1: फ्लोरोसेंट मेथेनोजेनिक शुद्ध संस्कृति। (ए) चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी के माध्यम से और (बी) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मेथनोसार्सिना थर्मोफिला का विज़ुअलाइज़ेशन जब कोफ़ैक्टर F420 यूवी प्रकाश (395-440 एनएम पर उत्तेजना और 475-495 एनएम पर उत्सर्जन) के साथ उत्साहित होता है। स्केल बार: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।
चित्रा 2: मानक इसके अलावा. M. thermophilus संस्कृतियों के विभिन्न संस्करणों के साथ spiked मैट्रिक्स के 1.0 ग्राम से एसपीई के बाद बरामद cofactor F420 के पीक क्षेत्र. मैट्रिक्स को 0 μL, 250 μL, 500 μL, 750 μL, और संस्कृति के 1000 μL के साथ संशोधित किया गया था और विभिन्न विघटन रणनीतियों के अधीन किया गया था: बीट-बीटिंग, अल्ट्रासोनिक उपचार, और दबाव-तापमान विघटन (ऑटोक्लेविंग)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: ग्लूटामेट पूंछ लंबाई वितरण। शुद्ध संस्कृतियों और पर्यावरण के नमूनों के Cofactor F420 पूंछ लंबाई वितरण। ऊपर से नीचे तक: कृषि रूप से उपयोग किए जाने वाले घास का मैदान (मिट्टी), वन (मिट्टी), मेसोफिलिक बायोगैस रिएक्टर, एम थर्मोफिलस की शुद्ध संस्कृति, और एम थर्मोफिला की शुद्ध संस्कृति। सापेक्ष अवशोषण की गणना दिखाए गए क्रोमैटोग्राम के भीतर उच्चतम चोटी पर सामान्यीकरण द्वारा की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
मेथेनोजेनिक शुद्ध संस्कृतियों से कोफ़ैक्टर F420 के मूल्यांकन के लिए, शामिल सूक्ष्मजीवों के विकास और गतिविधि (प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी) की कल्पना करने के लिए एक सूक्ष्म मूल्यांकन किया जा सकता है (चित्रा 1)। प्राकृतिक वातावरण से प्राप्त नमूनों के लिए, F420 का पता लगाने या मापने के लिए माइक्रोस्कोपी का उपयोग अन्य फ्लोरोसेंट सूक्ष्मजीवों, कार्बनिक और अकार्बनिक कणों के साथ हस्तक्षेप के कारण सीमित है। इस संदर्भ में, HPLC का उपयोग करके F420 और बाद के फ्लोरोमेट्रिक विश्लेषण का निष्कर्षण, जैसा कि पहले वर्णित है5, न केवल cofactor F420 की समग्र एकाग्रता पर बल्कि पॉलीगुटामेट पूंछ लंबाई वितरण पर भी जानकारी प्रदान कर सकता है।
Cofactor F420 के निष्कर्षण के लिए, एक दबाव-तापमान उपचार को अत्यधिक प्रभावी दिखाया गया था (चित्रा 2) और पिछले निष्कर्षों के अनुसार है5,27,33। इस विधि के माध्यम से और ईडीटीए और पॉलीसोर्बेट सहित एक फॉस्फेट बफर लाइसिस सिस्टम को लागू करते हुए, कोफ़ैक्टर F420 की उच्चतम सांद्रता कारक की उच्च सांद्रता वाले मेथेनोजेनिक शुद्ध संस्कृतियों से प्राप्त की गई थी। इसके अलावा (और अन्य परीक्षण किए गए सेल व्यवधान विधियों की तुलना में), दबाव-तापमान उपचार आसानी से लागू होता है और सामग्री की बचत होती है।
एसपीई को एक नमूने के भीतर कोफ़ैक्टर F420 polyglutamate पूंछ लंबाई वितरण के निर्धारण के उद्देश्य से एक डाउनस्ट्रीम HPLC विश्लेषण को सक्षम करने के लिए किया गया था। विभिन्न आयन एक्सचेंजर्स के बीच, एक कमजोर अनियन मिश्रित-मोड बहुलक सॉर्बेंट ने सबसे अच्छा प्रदर्शन दिखाया और धोने के उद्देश्यों के लिए मैट्रिक्स के लिए कोफ़ैक्टर F420 के प्रभावी बंधन के साथ-साथ अवांछित उप-उत्पादों को धोने के बाद निष्कर्षण मैट्रिक्स से इसके बाद के हटाने की अनुमति देता है। इस उद्देश्य के लिए, बुनियादी मेथनॉल सबसे अच्छा साबित हुआ।
प्रस्तुत विधि के माध्यम से, विभिन्न शुद्ध संस्कृतियों और पर्यावरणीय नमूनों को cofactor F420 (चित्रा 3) के बारे में पुनरुत्पादित रूप से विश्लेषण किया जा सकता है। यहां तक कि मिट्टी या कीचड़ जैसे नमूनों में अवांछित उप-उत्पादों के उच्च अनुपात वाले नमूनों का विश्लेषण प्रस्तुत प्रक्रिया द्वारा किया जा सकता है। इसलिए, HPLC के माध्यम से डाउनस्ट्रीम विश्लेषण को F420 की कुल एकाग्रता और F420 डेरिवेटिव के पॉलीग्लुटामेट पूंछ की लंबाई वितरण का विश्लेषण करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था। मिट्टी और अन्य नमूनों में F420 के उच्च स्तर का पता लगाना Ney et el.5 का समर्थन करता है, जिन्होंने प्रस्तावित किया कि जीनोमिक और मेटाजीनोमिक्स विश्लेषण के आधार पर एरोबिक मिट्टी के बैक्टीरिया में कोफ़ैक्टर व्यापक है।
संक्षेप में, यह पहला प्रोटोकॉल है जिसका उद्देश्य न केवल शुद्ध संस्कृतियों से बल्कि मिट्टी या कीचड़ जैसे पर्यावरणीय नमूनों से भी कोफ़ैक्टर F420 को निकालने और विश्लेषण करना है। पर्यावरणीय नमूनों से F420 निकालने में सबसे महत्वपूर्ण कदम बाद के HPLC विश्लेषण के लिए lysates के पूर्व-सफाई के लिए आवश्यक एसपीई है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल भविष्य की परियोजनाओं के लिए विभिन्न वातावरणों और जैव प्रक्रियाओं में F420 की भूमिका का अनावरण करने के लिए सहायक होगा।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम कृतज्ञतापूर्वक शुद्ध cofactor F420 के साथ समर्थन के लिए प्रोफेसर कॉलिन जैक्सन को धन्यवाद देते हैं। इस शोध को Tyrolean Science Fund (TWF) और Universität Innsbruck (Publikationsfonds) द्वारा समर्थित किया गया था। हम जीपीएस, एचके, एसबी, जीजी और एचबी के समर्थन को बहुत स्वीकार करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | |||
| Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector | Shimadzu | HPLC system | |
| Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes | |||
| HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mm | Phenomenex | HPLC column | |
| PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis | |||
| Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbent | Phenomenex | weak anion mixed-mode polymeric sorbent | |
| Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes | SPE equipment | ||
| Vortex mixer |
References
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- Bashiri, G., et al. A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes. Nature Communications. 10 (1), 451 (2019).
- Grinter, R., Greening, C. Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea. FEMS Microbiology Reviews. , (2021).
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