Summary
该协议提出了一种从原代肺组织衍生人肺类器官的方法，扩大肺类器官并诱导近端分化以产生3D和2D气道类器官，从而忠实地对人气道上皮进行表型检查。
Abstract
缺乏强大的人体呼吸 道上皮体外 模型阻碍了对呼吸系统生物学和病理学的理解。我们描述了一种明确的方案，从肺组织中的成体干细胞中提取人肺类器官，并诱导近端分化以产生成熟的气道类器官。然后以高稳定性连续扩张肺类器官超过1年，而分化的气道类器官用于在形态学和功能上模拟人气道上皮至接近生理水平。因此，我们建立了人类气道上皮的鲁棒类器官模型。肺类器官和分化气道类器官的长期扩张产生了稳定和可再生的来源，使科学家能够在培养皿中重建和扩增人气道上皮细胞。人肺类器官系统为各种应用提供了独特且具有生理活性 的体外 模型，包括研究病毒 - 宿主相互作用，药物测试和疾病建模。
Introduction
类器官已成为器官发育 体外 建模和研究生物学和疾病的强大而通用的工具。当在生长因子定义的培养基中培养时，来自各种器官的成体干细胞（ASC）可以在3维（3D）中扩增并自组装成由多种细胞类型组成的器官样细胞簇，称为类器官。Clevers的实验室在2009年报告了第一个ASC衍生的类器官，人类肠道类器官的衍生1，2。之后，ASC衍生的类器官已被确定用于各种人体器官和组织，包括前列腺3，4，肝脏5，6，胃7，8，9，胰腺10，乳腺11和肺 12，13.这些ASC衍生的类器官保留了天然器官的关键细胞，结构和功能特性，并在长期扩增培养物中保持了遗传和表型稳定性14，15。
类器官也可以来源于多能干细胞（PSC），包括胚胎干（ES）细胞和诱导多能干细胞（iPS）细胞16。虽然PSC衍生的类器官利用器官发育的机制来建立它们，但ASC可以通过重建在生理组织自我更新或组织修复期间模仿干细胞位的条件来强制形成类器官。PSC衍生的类器官是探索发育和器官发生的有利模型，尽管无法达到ASC衍生类器官的可比成熟水平。PSC衍生类器官的胎儿样成熟状态，以及建立这些类器官的复杂性，大大阻碍了它们在研究成熟组织中的生物学和病理学的广泛应用。
从鼻子到末端细支气管的人体呼吸道内衬气道上皮，也称为假分层纤毛上皮，由四种主要细胞类型组成，即纤毛细胞，杯状细胞，基底细胞和俱乐部细胞。我们与Clevers的实验室12，13合作，从人类肺组织中建立了ASC衍生的人类肺类器官。这些肺类器官在扩张介质中连续扩张超过一年;确切的持续时间因从不同供体获得的不同类器官系而异。然而，与天然气道上皮相比，这些长期可扩张的肺类器官还不够成熟，因为纤毛细胞（人体气道中的主要细胞群）在这些肺类器官中代表性不足。因此，我们开发了一种近端分化方案，并产生了3D和2D气道类器官，其形态学和功能上将气道上皮进行表观镜检查至接近生理水平。
在这里，我们提供一种视频方案，从原代肺组织中衍生出人肺类器官，扩大肺类器官并诱导近端分化以产生3D和2D气道类器官。
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Protocol
本文所述的所有使用人体组织的实验均已获得香港大学/医院管理局香港西区（UW13-364和UW21-695）机构审查委员会的批准。在组织收集之前获得患者的知情同意。
1. 人肺类器官的衍生
- 实验材料的制备
- 通过用2mM谷氨酰胺，10mM HEPES，100 U / mL青霉素和100μg / mL链霉素补充高级DMEM / F12培养基来制备基础培养基。
- 通过用10%R-spondin 1条件培养基，10%诺金条件培养基，1x B27补充剂，1.25mM N-乙酰半胱氨酸，10mM烟酰胺，5μM Y-27632，500nM A-83-01，1μM SB202190，5ng / mL纤维球生长因子（FGF）-7，20ng / mL FGF-10和100μg/ mL丙莫星（见 材料表）来制备人肺类器官扩张培养基。
注意：R-spondin 1和Noggin条件培养基可以用商业重组R-spondin 1（500 ng / mL）和Noggin（100 ng / mL）代替。 - 在细胞培养箱中预热24孔悬浮培养板。使用具有5%CO2 的标准细胞培养箱和37°C的加湿气氛。 在4°C冰箱中解冻基底基质。在实验过程中将基底基质和培养基保持在冰上。
- 从人体肺组织中分离细胞以进行3D类器官培养
- 从因各种疾病而接受手术切除的患者身上获取大小约为0.5厘米的新鲜切除的人体肺组织。在室温下将肺组织运输在30 mL基础培养基中，并在生物安全罩内尽快处理。
- 在10厘米的细胞培养皿中用无菌手术刀将肺组织切碎成小块（0.5-1毫米）。在15mL离心管中用10mL冷基础培养基洗涤组织片，然后在4°C下以400× g 离心5分钟。
- 弃去上清液并将沉淀重悬于8mL基础培养基中，补充有胶原酶，终浓度为2mg / mL。通过在37°C下以120rpm摇动管30-40分钟来消化组织片。
- 上下移液20倍，使用10 mL血清学移液器剪切消化的组织块。将100μm过滤器堆放在50 mL离心管上并过滤悬浮液。
- 用基础培养基回收过滤器上的组织碎片，并将其转移到15 mL离心管中，然后进行第二轮剪切和过滤。可以进行1x-2x的额外剪切过滤以分离更多细胞，特别是当采购一小块组织（例如，<0.5 cm）时。
- 将FBS加入到终浓度为2%的流通中以终止消解，然后在4°C下以400× g 离心5分钟。
- 将细胞沉淀重悬于10mL基础培养基中，然后在4°C下以400× g 离心5分钟。 弃去上清液。
- （可选）如果在沉淀中观察到许多红细胞（通过沉淀的颜色估计），则将细胞沉淀重悬于2mL红细胞裂解缓冲液中，并在室温下孵育5分钟。然后，向管中加入10mL基础培养基，然后在4°C下以400× g 离心5分钟。 弃去上清液。
- 将颗粒重悬于冷的基底基质中并保持在冰上。加入80-160μL基底基质，用于从0.5cm左右大小的肺组织中回收的细胞;该量足以播种2-4滴。
- 将40μL悬浮液分配到预热的24孔悬浮培养板的每个孔中。将培养板在37°C下孵育10-15分钟。让基底基质凝固形成液滴。
- 向每个孔中加入500μL人肺类器官扩增培养基，补充有5nM赫氏β-1，并将板在细胞培养箱中孵育。
- 每 3 天刷新一次培养基。取出旧培养基，同时保持液滴完好无损，并小心加入新鲜培养基。孵育10-14天后通过类器官。仅在第一次传代之前的初始培养中使用赫来古林β-1。
- 在显微镜下观察类器官，以确保类器官不会嵌入非常高的细胞密度。如果液滴由于细胞密度过高而崩解，则回收并重新嵌入具有较高基底基质体积的类器官和细胞，以产生更多具有较低和理想细胞密度的液滴。
2. 人肺类器官的扩张
- 通过将巴斯德移液器的尖端燃烧到火焰（如本生燃烧器）上来准备巴斯德移液器，以将开口从1.5毫米缩小到直径约1.0毫米。冷却移液器，然后进行高压灭菌以灭菌。用基础培养基润湿移液器，以避免在机械剪切过程中细胞附着和损失。
- 通过机械剪切进行肺类器官通道
- 使用1 mL吸头和上下移液器来打破上面获得的液滴。然后，将类器官与培养基一起转移到15 mL离心管中，并用冷的基础介质将体积调节至10 mL。在4°C下以300× g 离心5分钟后弃去上清液
- 再次用10mL冷基础培养基洗涤类器官。将类器官重悬于2 mL冷基础培养基中。上下移液，用巴斯德移液器将类器官剪切成小块。
- 用基础培养基补充至总体积为10mL，然后在4°C下以300× g 离心5分钟。 用足够多的冷基底基质重悬类器官碎片，以实现1：3至1：5的扩张。保持冰封。
- 将40μL类器官悬浮液置于预热的24孔板的每个孔中。将培养板在37°C下孵育10-15分钟。让基底基质固化。
- 向每个孔中加入500μL肺类器官扩增培养基，并在细胞培养箱中孵育。每 3 天刷新一次培养基。每2周通过一次类器官，比例为1：3至1：5。
- 肺类器官通过胰蛋白酶消化
注意：当难以使用巴斯德移液管将肺类器官剪切成小块时，或者类器官的大小变化很大，或者随后的实验需要更均匀大小的类器官时，胰蛋白酶消化是优选的。- 收获肺类器官，如步骤2.2.1所示。将类器官重悬于1mL解离酶中，并在37°C水浴中孵育3-5分钟。
- 向试管中加入1 mL基础培养基。通过使用巴斯德移液器将类器官上下移液成小块，机械地剪切类器官。在4倍放大倍率的显微镜下检查类器官碎片的大小。然后，加入40μLFBS以终止消化。
注意：根据实验安排在显微镜下确定类器官碎片的大小。如果实验需要更多的类器官或更均匀大小的类器官，请将类器官剪切成更小的碎片甚至单个细胞。然后，在类器官准备好进行实验之前，需要更长的时间，可能是3周。 - 用基础培养基加注至最终体积为10mL，然后在4°C下以300× g 离心5分钟。 将类器官碎片重悬于冷基底基质中，其体积足以通过，比例为1：5-1：10。保持冰封。
- 将40μL类器官悬浮液置于预热的24孔板的每个孔中。将培养板在37°C下孵育10-15分钟。让基底基质固化。
- 每孔补充500μL肺类器官扩增培养基，并在细胞培养箱中孵育。每 3 天刷新一次扩展介质。2-3周后通过类器官。
注意：大约100个类器官安装在基底基质的40μL液滴中。肺类器官通常生长得更好，细胞密度相对较高。如果液滴分解或由于细胞密度过高而使生长中的类器官附着在一起，则以较低的细胞密度重新包埋类器官。
3. 近端分化产生成熟的气道类器官
- 制备近端分化培养基（PD培养基），方法是用1x空气液体界面补充剂，1x空气液体界面维持补充剂，4μg/ mL肝素，1μM氢化可的松，10μM Y-27632和10μM DAPT补充空气液体界面基础介质（见 材料表）。
- 3D 气道类器官
- 通过机械剪切传代后，在膨胀培养基中孵育肺类器官7-10天。将膨胀介质更换为PD介质。将类器官在PD培养基中孵育14天，在细胞培养箱中孵育14天。
- 丢弃每个孔中的PD培养基。加入细胞裂解物缓冲液以收获分化的气道类器官，用于RNA提取和通过RT-qPCR测定检测细胞基因表达。
- 或者，在加入10mM EDTA后，将类器官在37°C下孵育60分钟以将类器官分离成单细胞，然后进行流式细胞术分析以检查细胞群。类器官已准备好进行各种实验操作。
- 2D 气道类器官
- 准备足够的3D肺类器官用于2D分化培养。24 孔渗透性支撑插入物和 12 孔渗透性支撑插入物总共需要 1.3 x 105 和 4.5 x 10 5 个细胞。
- 在3D肺类器官在扩增培养基中生长2周后，将类器官消化成单细胞并接种到24孔和12孔插入物中以产生2D气道类器官。
- 将插入物与基础培养基在细胞培养箱中预孵育过夜。分别在24孔板的顶部和底部室中加入250μL和500μL基础培养基。对于12孔板，分别在顶部和底部室中加入500μL和1，000μL基础培养基。
- 收获3D肺类器官，如步骤2.2.1所述。用1mL解离酶重悬类器官，并在37°C水浴中孵育3-5分钟。
- 向试管中加入1 mL基础培养基。上下移液，用巴斯德移液管将类器官剪切成单个细胞，并在显微镜下检查细胞。然后，加入40μLFBS以终止消化。
- 将细胞通过40μm过滤器过滤到50mL离心管中。将过滤后的细胞悬浮液转移到15 mL管中。用基础培养基加注至总体积为10mL，然后在4°C下以300× g 离心5分钟。
- 根据液滴中的细胞密度，将从24个液滴（40μL）收集的沉淀重悬于1-2.5mL肺类器官扩增培养基中。在显微镜下用细胞计数器计算细胞数量。将细胞浓度调节至 1.3 x 106/mL（对于 24 孔插入片段）或 9 x 105/mL（对于 12 孔插入片段）。
- 从顶部和底部腔室中取出基底培养基。分别在24孔插入物和12孔插入物的底部室中加入500μL和1，000μL膨胀培养基。在步骤3.3.7中制备的100μL和500μL细胞悬浮液分别将100μL和500μL种子到24孔插入物和12孔插入物的顶端室中。
- 在细胞培养箱中孵育2天。用板的顶腔和底室中的PD介质替换膨胀介质。将类器官在细胞培养箱中孵育14天，每3天刷新一次PD培养基。
注意：在PD培养基中孵育后的第7天起，在显微镜下的3D和2D类器官中可识别移动纤毛。在PD培养基中分化培养14天后，气道类器官成熟，可用于各种实验操作。 - 每隔一天使用电阻测量系统测量经上皮电阻（TEER），该系统符合17中描述的标准协议。
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Representative Results
该方案能够以高成功率衍生出人肺类器官。将新鲜的人体肺组织切成小块，然后用胶原酶分解。将所得的单细胞嵌入基底基质中，并在肺类器官扩增培养基中孵育，并补充一系列用于上皮干细胞生长的利基因子（步骤1.1.2）。 图1 显示了嵌入在2型（BME; 图 1A（左）。囊性类器官出现并随着时间的推移而扩大（图1A，右）。同时，不相关的细胞逐渐经历细胞死亡。成纤维细胞在第一次或第二次传代期间存在于培养物中。之后，培养物仅含有上皮类器官，这些类器官是来自原代肺组织中存在的上皮干细胞的肺类器官。这些类肺类器官每2-3周通过1：3至1：5的比例的机械剪切或以1：5至1：10的比例通过胰蛋白酶消化（步骤2.2-2.3） 传代。第四次通过后肺类器官的代表性显微照片如图 1B所示。机械剪切后，嵌入在BME中的类器官碎片在几个小时内形成囊性结构域（图1B，左）。第5天同一场的显微照片（图1B，右）显示类器官随着时间的推移而生长。这些扩张的人肺类器官包含所有四种主要的气道上皮细胞类型，包括ACCTUB+或FOXJ1+纤毛细胞，P63 +基底细胞，CC10 +俱乐部细胞和MUC5AC +高脚杯细胞18 （图1C），处于过早状态。值得注意的是，这些人肺类器官可以连续稳定地传代超过1年。当维持在基底基质内时，肺类器官最有可能显示顶端内极性，不到2%-3%的肺类器官显示顶端极性13。因此，除非将3D类器官剪切开，否则细胞顶点不容易接近。
然而，与天然人气道上皮相比，这些长期可扩张的肺类器官尚未充分成熟，因为天然人气道上皮中的优势细胞群，纤毛细胞，在肺类器官中代表性不足。然后，我们定义了一种近端分化（PD）培养基，以改善人肺类器官的成熟状态。在膨胀培养基中孵育的类器官和PD培养基随着时间的推移发展出独特的形态（图2A）。运动纤毛在PD培养基中的类器官中比在膨胀培养基中更丰富。在PD培养基中分化培养2周后，在每个类器官中都可识别运动纤毛（图2B 和 补充视频1）。有趣的是，跳动的纤毛驱动类器官管腔内的细胞碎片和排泄的粘蛋白单向旋转，这充分概括了粘膜纤毛自动扶梯以除去吸入的颗粒（补充视频1），这是人体气道的重要自我清除机制。我们证明，与原始的肺类器官相比，分化类器官中的纤毛细胞显着增加至约50%。为了评估四种上皮细胞的百分比，通过流式细胞术分析2D气道类器官。简单地说，在37 °C下用10 mM EDTA解离60 min，用4%PFA固定，并用0.1%表面活性剂渗透。随后，将细胞与一抗（见 材料表）在4°C下孵育1小时，然后用二抗染色。使用FACS系统来分析样品。流式细胞术分析表明，分化的类器官适应四种气道上皮细胞类型（图2C）。因此，我们开发了一种近端分化方案来产生气道类器官，可以忠实地模拟人类气道上皮到接近生理水平。
为了使类器官顶端表面易于接近，并更好地模拟人类气道上皮暴露于呼吸道病原体的情况，我们生成了气道类器官的2D单层。分化培养2周后，2D气道类器官形成完整的上皮屏障（图3A，B）。我们还进行了葡聚糖阻塞测定，以评估在2D气道类器官中形成的上皮屏障的完整性。在透孔插入物中培养后的第10天，将荧光素异硫氰酸酯 - 葡聚糖（MW 10，000）加入顶室的培养基中并在37°C下孵育4小时。收获顶部和底部腔室中的培养基进行荧光测定。葡聚糖阻塞指数是指顶部腔室中培养基的荧光强度与底部腔室中的荧光强度（图3B）。这些2D气道类器官还含有丰富的纤毛细胞（图3C）。用抗β-微管蛋白IV抗体（ACCTUB）和山羊抗小鼠488二抗标记纤毛细胞。使用共聚焦显微镜获得共聚焦图像。使用DAPI的激光器405nm，ACCTUB的488nm和Phalloidin的633/640nm的激光器采集多通道图像。根据共聚焦显微镜的用户手册调整成像参数。简而言之，针孔尺寸设置为1 AU，主增益设置为650 V至750 V，数字增益为1.0，每个通道的激光功率在0.2%至5%的范围内进行调整。通过使用所提供的分析软件执行图像处理。
人体呼吸道内衬两种不同类型的上皮，即气道上皮和肺泡上皮。前者将气道从鼻腔排成一直至末端细支气管，由四种主要类型的上皮细胞组成，即纤毛细胞、杯状细胞、棒状细胞和基底细胞。此外，近端和远端气道的气道上皮内衬沿近端-远端轴显示可变的细胞组成。近端气道上皮是假分层的，由丰富的纤毛细胞和分泌粘液的高脚杯细胞组成;而远端气道上皮是单层立方体纤毛和球杆细胞，基底细胞和高脚杯细胞较少19。用于获取肺类器官的人类肺组织是从因各种疾病而接受手术切除的患者那里获得的。我们使用与患病组织相邻的正常肺组织进行类器官培养。这些肺组织通常含有不同大小的细支气管，周围是肺泡囊。在初始培养期间，肺组织中的气道上皮干细胞或气道祖细胞由于扩增培养基中的生态位因子而存活和增殖。扩张培养基通过将类器官引导至未成熟状态，使肺类器官的初始衍生和长期扩张成为可能，而气道分化方案则在形态学和功能上产生气道类器官表型，对天然气道上皮进行表型检查。模型系统，包括肺类器官的推导，扩张和分化， 如图4所示。近端和远端气道上皮中的细胞组成也如图 4所示。
（A）具有代表性的显微照片显示，在第0天从肺组织中分离后，单个细胞嵌入基底基质中（左）。在第5天，囊性类器官正在生长（右）。比例尺为0.5毫米（B）第四次通过当天和通过后第5天肺部类器官的代表性显微照片。比例尺为0.5毫米。P1 和 P4 代表第一段和第四段。这些图像是在10倍放大倍率下拍摄的。（C）人肺类器官中四种气道上皮细胞类型的共聚焦图像。肺类器官中存在四种气道上皮细胞谱系，包括 ACCUB+ 和 FOXJ1+ 纤毛细胞、P63+ 基底细胞、CC10+ 俱乐部细胞和 MUC5AC+ 高脚杯细胞。细胞核和细胞肌动蛋白丝分别与DAPI（蓝色）和Phalloidin-647（紫色）复染。比例尺为 10 μm。这个数字是从13中采用的。请点击此处查看此图的大图。
图2：人肺类器官的近端分化 （A）人肺类器官在PD培养基或膨胀（Exp）培养基中平行培养16天。显示指示日期的类器官的明场显微照片。（B）纤毛在分化的气道类器官中显示（黑色箭头）。比例尺为20μm.（C）通过FACS分析检测到的在PD培养基（顶部）和膨胀培养基（底部）中孵育的类器官中单个细胞类型的百分比。图中显示了一条类器官线的代表性直方图。该实验在三个不同的类器官系中进行。这个数字是从13中采用的。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：生成 2D 分化气道类器官。 （A）在PD培养基中孵育后的第二天测量经上皮电子电阻（TEER）。数据显示10个插入物中2D单层的平均±标准偏差（SD）。（B）在透气支撑板中培养后第10天，加入荧光素异硫氰酸酯 - 葡聚糖，并在4 h后收获顶部和底部室中的培养基进行荧光测定。葡聚糖阻塞指数是指顶部腔室中介质的荧光强度与底部腔室中的荧光强度。我们实验中使用的渗透性支撑嵌件的直径为0.4 μm。无需接种任何细胞，葡聚糖可以自由穿透正常的2D插入物。因此，正常2D（标有空白的条形图）的葡聚糖阻塞指数应为1。数据表示10个带有2D气道类器官（2D类器官）的插入物和两个空白插入物（空白）中插入物的平均± SD。（C）2D气道类器官中丰富的ACCTUB+纤毛细胞（绿色）的共聚焦图像。细胞肌动蛋白丝与Phalloidin-647（紫色）复染。比例尺为20 μm。这个数字是从13中采用的。 请点击此处查看此图的大图。
图4：人肺类器官的衍生、扩张和分化示意图。 从人肺组织中分离的单细胞直接嵌入基底基质中，并在肺类器官扩张培养基中孵育。衍生的人体肺类器官可以长期膨胀，稳定性高，并且很容易从冷冻储备的储备中回收。分化后，生成的气道类器官可以忠实地模拟人气道上皮。2D和3D气道类器官已被开发用于各种实验操作。 请点击此处查看此图的大图。
补充视频 1. 同步跳动的纤毛驱动细胞碎片在分化的气道类器官13中单向旋转。该视频已从13开始采用。 请点击此处下载此视频。
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Discussion
人气道内衬气道上皮，也称为假分层纤毛上皮。上气道上皮的主要细胞类型是纤毛细胞，其能够协调其顶端纤毛运动以从气道中排出粘液和吸入颗粒，产生和分泌粘液的杯状细胞以及排列在基底膜上并参与再生的基础细胞。在小气道（如细支气管）中，长方体气道上皮包含分泌性俱乐部细胞和比上气道区域更少的纤毛细胞。我们描述了一种从人类肺组织中的上皮干细胞中提取人体肺类器官的强大方案。这些人肺类器官维持在扩增培养基中，连续传代1年以上，稳定性高。扩增培养基中的关键生长因子包括R-spondin，一种Wnt激动剂20;和Noggin，它是BMP信号传导21的抑制剂，以及FGF7和FGF10。先前的研究揭示了Wnt，FGF和BMP信号传导在呼吸上皮的稳态中的关键作用22，23，24。扩增培养基通过将类器官引导至未成熟状态，使肺类器官的初始衍生和长期扩增成为可能。我们进一步开发了一种近端分化方法，以产生3D和2D气道类器官，该方法可容纳四种主要的气道细胞类型，并将人气道上皮模拟到接近生理的水平。在整个过程中，包括初始衍生，长期扩增和近端分化，既不需要繁琐的细胞纯化，也不需要饲养层和基质细胞。因此，我们建立了人类气道上皮的类器官模型。文化的两个阶段，扩张文化和差异化文化，是相互排斥的。肺类器官为长期扩张提供了稳定的来源，而分化的气道类器官则忠实地对人气道上皮进行表观。这些类器官适用于各种实验操作，包括成像，RNA测序，流式细胞术分析，基因编辑等。
为了确保高效率地获得肺类器官，必须准确细致地重建扩增培养基，这对于方案实现的高建立率至关重要。这种类器官模型的一个主要局限性是纯上皮组成，缺乏基质细胞和存在于人体呼吸粘膜中的免疫细胞，这可能导致气道类器官在一定程度上偏离天然气道上皮。因此，我们努力通过将免疫细胞和其他生物学相关成分纳入我们当前的类器官模型中来产生下一代呼吸道类器官。
我们建立的气道类器官忠实地模拟了人类天然呼吸道上皮的多细胞组成和功能，达到接近生理的水平，这在任何同质细胞系中都是不可能的。我们的类器官模型使科学家能够重建和稳定地扩展培养板中的天然人类气道上皮。这些气道类器官是研究人类气道生物学和病理学的通用工具。由于复制能力有限，研究实验室中使用的原代气道上皮细胞不可扩展，并且几乎不能作为可重复且易于获得的研究工具。
类器官，包括人类呼吸道类器官，已经揭示了它们在研究人类病原体方面的独特性和强度，包括SARS-CoV-228，29，30，31，32，33，34。作为一种通用的生理活性工具，人体肺类器官可以被广泛用于探索人体呼吸道的生物学和病理学。
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Disclosures
J. Z.，C.L.和M.C.C.被列为气道类器官专利的发明人（公开号：US-2021-0207081-A1）。其他作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
我们感谢香港大学李嘉诚医学院泛有机科学与电子显微镜中心在共聚焦成像和流式细胞术方面的协助。这项工作部分得到了食物及卫生局卫生及医学研究基金（HMRF，17161272及19180392）的资助;研究资助局一般研究基金（GRF，17105420）;及香港特别行政区政府创新科技署Health@InnoHK。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | - |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | - | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | - | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
References
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