Kleinschalige extractie van Caenorhabditis elegans Genomisch DNA
Summary
Hier wordt een beschrijving gegeven van de eenvoudige en relatief snelle isolatie van Caenorhabditis elegans genomisch DNA van een of enkele dieren met behulp van een in de handel verkrijgbare weefselkit. Het resulterende gDNA-preparaat is een geschikt sjabloon voor PCR.
Abstract
Genomische DNA-extractie uit enkele of enkele Caenorhabditis elegans heeft veel downstream-toepassingen, waaronder PCR voor genotyperingslijnen, klonen en sequencing. De traditionele proteïnase K-gebaseerde methoden voor genomische DNA-extractie uit C. elegans duren enkele uren. Commerciële extractiekits die de C. elegans-cuticula effectief openbreken en genomisch DNA extraheren, zijn beperkt. Een eenvoudige, snellere (~ 15 min) en kostenefficiënte methode voor het extraheren van C. elegans genomisch DNA dat goed werkt voor klaslokalen en onderzoekstoepassingen wordt hier gerapporteerd. Deze DNA-extractiemethode is geoptimaliseerd om enkele of enkele laatlarven (L4) of volwassen nematoden te gebruiken als uitgangsmateriaal voor het verkrijgen van een betrouwbare sjabloon om PCR uit te voeren. De resultaten geven aan dat de DNA-kwaliteit geschikt is voor het versterken van gendoelen van verschillende grootte door PCR, waardoor genotypering van enkele of enkele dieren mogelijk is, zelfs bij verdunningen tot een vijftigste van het genomische DNA van een enkele volwassene per reactie. De gerapporteerde protocollen kunnen betrouwbaar worden gebruikt om snel DNA-sjablonen te produceren uit een enkele of een kleine steekproef van C. elegans voor PCR-gebaseerde toepassingen.
Introduction
Hier worden twee gerelateerde protocollen gepresenteerd voor de lysis van Caenorhabditis elegans om DNA toegankelijk te maken voor PCR-gebaseerde toepassingen. PCR is een veelgebruikte moleculaire techniek die voor veel toepassingen wordt gebruikt, waaronder genotypering en het versterken van DNA-fragmenten voor onder andere klonen en sequencing. De kleine (1 mm), vrijlevende rondworm C. elegans is een populair diersysteem voor biologisch onderzoek. Het verkrijgen van geschikt genomisch DNA van een enkel dier of een paar dieren is voldoende om de sequentie door PCR te versterken. Late L4-larven en volwassenen bevatten slechts ~ 1.000 somatische cellen (waaronder sommige multinucleaire, polyploïde cellen), geslachtscellen en (als het dier een gravid hermafrodiet is) nakomelingen in utero1. Deze dieren worden echter beschermd door een cuticula die moet worden verstoord om het genomische DNA2 te extraheren. Standaardmethoden om nematode genomische DNA-sjabloon voor PCR voor te bereiden, omvatten meerdere stappen en duren enkele uren. De dieren worden eerst ingevroren in een wormlysisbuffer met proteïnase K (−70 °C of lager) gedurende ten minste 15-45 minuten (langer wordt aanbevolen door sommige protocollen)3,4,5,6. Deze stap breekt de dieren open.
Na bevriezing worden de dieren gedurende 1 uur bij 60-65 ° C geïncubeerd om het proteïnase K te laten werken, waarna het enzym gedurende 15-30 minuten bij 95 ° C wordt geïnactiveerd. Het proteïnase K vernietigt de nucleasen die DNA afbreken. De inactivatie van proteïnase K vóór PCR is belangrijk om te voorkomen dat het proteïnase K het DNA-polymerase afbreekt. De twee kit-gebaseerde protocollen die hier worden beschreven, zijn snelle, betrouwbare en kosteneffectieve methoden om genomisch DNA te extraheren uit een enkel dier of een paar nematoden voor dagelijks onderzoek en het onderwijzen van laboratoriumtoepassingen. De gebruikte kit werd oorspronkelijk door de fabrikant geoptimaliseerd om DNA uit dierlijk weefsel, speeksel en haar te extraheren7. Het maakt gebruik van een gepatenteerde weefselpreparatieoplossing en extractieoplossing om cellen te lyseren en genomisch DNA toegankelijk te maken. Een gepatenteerde neutralisatieoplossing neutraliseert vervolgens de componenten die PCR kunnen remmen (bijv. Zouten, ionen en Mg2 + -bindende moleculen).
Bij genotypering kan een enkel dier worden getest. Bij het bepalen of een stam homozygoot is, geeft het testen van zes of meer nakomelingen van een enkel dier een hoge mate van vertrouwen dat een lijn homozygoot is of niet (er is een kans van 0,02% om willekeurig zes homozygote mutante nakomelingen te kiezen van een heterozygote ouder [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Deze methode 1) is eenvoudig, met minder stappen dan de proteïnase K-methode, en 2) vermindert de voorbereidingstijd van de sjabloon tot 15 minuten. De resultaten in dit werk tonen aan dat het ontwikkelde protocol robuust werkt bij het extraheren van genomisch DNA uit enkele of enkele wormen, die betrouwbaar kunnen worden gebruikt voor downstream-toepassingen die geen sterk gezuiverd DNA vereisen, inclusief PCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het bepalen van de genotypen van C. elegans is een belangrijke stap bij het uitvoeren van genetische kruisingen om nieuwe C. elegans-stammen te creëren. Genomische DNA-extractie met behulp van een enkele of enkele C. elegans is een cruciale stap in het genotyperen van C. elegans. Dit protocol beschrijft genomische DNA-extractie van C. elegans met behulp van een commerciële kit. Deze methode is snel en werkt robuust. Het genomische DNA dat met deze methode wordt geëxtraheerd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De N2-stam en E. coli OP50-bacteriën werden verkregen van het Caenorhabditis Genetics Center (CGC), dat wordt gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). De blmp-1 (tm548) stam werd verkregen van het National Bioresource Project, Japan. De auteurs bedanken WormBase. Dit werk werd ondersteund door NIH R01GM097591 aan T.L.G., interne financiering door Texas Woman’s University aan T.L.G. en TWU’s Center for Student Research aan M.F.L.
Materials
| autoclave tape | Defend | 43237-2 | |
| aluminium foil, heavy duty | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| calcium chloride | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp hotplate/stirrer | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, capsules | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifuge | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb) |
| NGM media powder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | |
| PrimeSTAR GXL polymerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb |
| SimpliAmp thermal cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| stir bar | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| worm pick | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
Riferimenti
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , (2007).
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetica. 131, 609-624 (1992).
- Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
- Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-10 (2008).
- Biron, D., Haspel, G. . C. elegans: Methods and Applications. , (2015).
- . Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013)
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).
- Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).
- Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).
- Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
- Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
- Huang, T. -. F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).
- Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
