استخراج على نطاق صغير من Caenorhabditis elegans الحمض النووي الجينومي
Summary
يظهر هنا وصف للعزل المباشر والسريع نسبيا للحمض النووي الجينومي Caenorhabditis elegans من واحد أو عدد قليل من الحيوانات باستخدام مجموعة أنسجة متاحة تجاريا. إعداد gDNA الناتج هو قالب مناسب ل PCR.
Abstract
استخراج الحمض النووي الجينومي من واحد أو عدد قليل من Caenorhabditis elegans له العديد من التطبيقات النهائية ، بما في ذلك PCR لخطوط التنميط الجيني والاستنساخ والتسلسل. تستغرق الطرق التقليدية القائمة على البروتين K لاستخراج الحمض النووي الجيني من C. elegans عدة ساعات. مجموعات الاستخراج التجارية التي تكسر بشكل فعال بشرة C. elegans واستخراج الحمض النووي الجينومي محدودة. يتم الإبلاغ هنا عن طريقة سهلة وأسرع (~ 15 دقيقة) وفعالة من حيث التكلفة لاستخراج الحمض النووي الجينومي C. elegans الذي يعمل بشكل جيد لتطبيقات الفصول الدراسية والبحوث. تم تحسين طريقة استخراج الحمض النووي هذه لاستخدام اليرقات المتأخرة (L4) أو الديدان الخيطية البالغة كمادة أولية للحصول على قالب موثوق به لأداء PCR. تشير النتائج إلى أن جودة الحمض النووي مناسبة لتضخيم الأهداف الجينية ذات الأحجام المختلفة بواسطة PCR ، مما يسمح بالتنميط الجيني لحيوان واحد أو عدد قليل حتى عند التخفيف إلى واحد من خمسين من الحمض النووي الجيني من شخص بالغ واحد لكل تفاعل. يمكن استخدام البروتوكولات المبلغ عنها بشكل موثوق لإنتاج قالب الحمض النووي بسرعة من عينة واحدة أو صغيرة من C. elegans للتطبيقات القائمة على PCR.
Introduction
هنا ، يتم تقديم بروتوكولين مرتبطين بتحلل Caenorhabditis elegans لجعل الحمض النووي متاحا للتطبيقات القائمة على PCR. PCR هي تقنية جزيئية شائعة الاستخدام تستخدم للعديد من التطبيقات ، بما في ذلك التنميط الجيني وتضخيم شظايا الحمض النووي للاستنساخ والتسلسل ، من بين أمور أخرى. الدودة المستديرة الصغيرة (1 مم) التي تعيش بحرية C. elegans هي نظام حيواني شائع للبحوث البيولوجية. الحصول على الحمض النووي الجينومي المناسب من واحد أو عدد قليل من الحيوانات يكفي لتضخيم التسلسل بواسطة PCR. تحتوي يرقات L4 المتأخرة والبالغين على حوالي 1000 خلية جسدية فقط (بما في ذلك بعض الخلايا متعددة النواة ومتعددة الصبغيات) ، والخلايا الجرثومية ، و (إذا كان الحيوان خنثى محبوذا) ذرية في الرحم1. ومع ذلك ، فإن هذه الحيوانات محمية بواسطة بشرة يجب تعطيلها لاستخراج الحمض النووي الجينومي2. تتضمن الطرق القياسية لإعداد قالب الحمض النووي الجيني الخيطي ل PCR خطوات متعددة وتستغرق عدة ساعات. يتم تجميد الحيوانات أولا في مخزن تحلل الدودة الذي يحتوي على بروتين K (-70 درجة مئوية أو أقل) لمدة 15-45 دقيقة على الأقل (يوصى ببعض البروتوكولات بفترة أطول) 3،4،5،6. هذه الخطوة الشقوق فتح الحيوانات.
بعد التجميد ، يتم تحضين الحيوانات لمدة 1 ساعة عند 60-65 درجة مئوية حتى يعمل البروتين K ، ثم يتم تعطيل الإنزيم لمدة 15-30 دقيقة عند 95 درجة مئوية. البروتيناز K يدمر النوكليز الذي يتحلل الحمض النووي. يعد تعطيل البروتين K قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل أمرا مهما لمنع البروتين K من تدهور بوليميراز الحمض النووي. البروتوكولان القائمان على المجموعة الموصوفان هنا هما طريقتان سريعتان وموثوقتان وفعالتان من حيث التكلفة لاستخراج الحمض النووي الجيني من واحد أو عدد قليل من الديدان الخيطية للبحث اليومي وتدريس التطبيقات المختبرية. تم تحسين المجموعة المستخدمة في الأصل من قبل الشركة المصنعة لاستخراج الحمض النووي من الأنسجة الحيوانية واللعاب والشعر7. ويستخدم حل إعداد الأنسجة الملكية وحل استخراج لتحليل الخلايا وجعل الحمض النووي الجينومي في متناول اليد. ثم يقوم حل تحييد الملكية بتحييد المكونات التي قد تمنع تفاعل البوليميراز المتسلسل (على سبيل المثال ، الأملاح والأيونات والجزيئات المرتبطة ب Mg2+).
عند التنميط الجيني ، يمكن اختبار واحد. عند تحديد ما إذا كانت السلالة متماثلة الزيجوت ، فإن اختبار ستة أو أكثر من النسل من واحد يعطي ثقة عالية بأن الخط متماثل الزيجوت أم لا (هناك فرصة بنسبة 0.02٪ لاختيار ستة ذرية متحولة متماثلة الزيجوت عشوائيا من أحد الوالدين غير المتجانسين [(1/4)6 × 100٪ = 0.02٪]). هذه الطريقة 1) مباشرة ، مع خطوات أقل من طريقة proteinase K ، و 2) تقلل من وقت إعداد القالب إلى 15 دقيقة. تظهر النتائج في هذا العمل أن البروتوكول المطور يعمل بقوة في استخراج الحمض النووي الجيني من ديدان مفردة أو قليلة ، والتي يمكن استخدامها بشكل موثوق في التطبيقات النهائية التي لا تتطلب الحمض النووي عالي النقاء ، بما في ذلك PCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد تحديد الأنماط الجينية ل C. elegans خطوة مهمة أثناء إجراء الصلبان الجينية لإنشاء سلالات C. elegans جديدة. يعد استخراج الحمض النووي الجيني باستخدام واحد أو عدد قليل من C. elegans خطوة حاسمة في التنميط الجيني C. elegans. يصف هذا البروتوكول استخراج الحمض النووي الجيني من C. elegans باست?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم الحصول على سلالة N2 وبكتيريا E. coli OP50 من مركز Caenorhabditis Genetics Center (CGC) ، الذي يموله مكتب برامج البنية التحتية البحثية التابع للمعاهد الوطنية للصحة (P40 OD010440). تم الحصول على سلالة blmp-1 (tm548) من المشروع الوطني للموارد الحيوية ، اليابان. يشكر المؤلفون WormBase. تم دعم هذا العمل من قبل NIH R01GM097591 إلى T.L.G. ، والتمويل الداخلي من جامعة تكساس للمرأة إلى T.L.G ، ومركز TWU لأبحاث الطلاب إلى M.F.L.
Materials
| autoclave tape | Defend | 43237-2 | |
| aluminium foil, heavy duty | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| calcium chloride | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp hotplate/stirrer | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, capsules | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifuge | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb) |
| NGM media powder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | |
| PrimeSTAR GXL polymerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb |
| SimpliAmp thermal cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| stir bar | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| worm pick | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
Riferimenti
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , (2007).
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetica. 131, 609-624 (1992).
- Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
- Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-10 (2008).
- Biron, D., Haspel, G. . C. elegans: Methods and Applications. , (2015).
- . Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013)
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).
- Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).
- Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).
- Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
- Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
- Huang, T. -. F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).
- Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
