Extração em pequena escala de Caenorhabditis elegans DNA genômico
Summary
Apresentado aqui é uma descrição do isolamento simples e relativamente rápido de Caenorhabditis elegans DNA genômico de um ou poucos animais usando um kit de tecido comercialmente disponível. A preparação gDNA resultante é um modelo adequado para PCR.
Abstract
A extração de DNA genômico de um único ou alguns elegans de Caenorhabditis tem muitas aplicações a jusante, incluindo PCR para linhas de genotipagem, clonagem e sequenciamento. Os métodos tradicionais à base de proteínas à base de K para extração genômica de DNA de C. elegans levam várias horas. Kits de extração comercial que efetivamente quebram a cutícula C. elegans e extraem DNA genômico são limitados. Um método fácil, mais rápido (~15 min), e econômico de extrair DNA genômico C. elegans que funciona bem para aplicações em sala de aula e pesquisa é relatado aqui. Este método de extração de DNA é otimizado para usar nematoides únicos ou algumas larvas tardias (L4) ou nematoides adultos como material inicial para a obtenção de um modelo confiável para executar PCR. Os resultados indicam que a qualidade do DNA é adequada para amplificar alvos genéticos de diferentes tamanhos por PCR, permitindo genotipagem de animais únicos ou alguns, mesmo em diluições a um cinquenta do DNA genômico de um único adulto por reação. Os protocolos relatados podem ser usados de forma confiável para produzir rapidamente o modelo de DNA a partir de uma única ou uma pequena amostra de C. elegans para aplicações baseadas em PCR.
Introduction
Aqui, dois protocolos relacionados são apresentados para a lise de caenorhabditis elegans para tornar o DNA acessível para aplicações baseadas em PCR. PCR é uma técnica molecular comumente usada para muitas aplicações, incluindo genotipagem e amplificação de fragmentos de DNA para clonagem e sequenciamento, entre outras. A pequena (1 mm), lombriga de vida livre C. elegans é um sistema animal popular para pesquisa biológica. Obter DNA genômico adequado de um único animal ou alguns animais é suficiente para amplificar a sequência por PCR. Larvas L4 tardias e adultos contêm apenas ~1.000 células somáticas (incluindo algumas células multinucleares, poliploides), células germinativas, e (se o animal é uma hermafrodita gravid) prole no útero1. No entanto, esses animais são protegidos por uma cutícula que deve ser interrompida para extrair o DNA genômico2. Os métodos padrão para preparar o modelo de DNA genômico nematode para PCR envolvem múltiplas etapas e levam várias horas. Os animais são primeiro congelados em tampão de lise de verme contendo proteinase K (−70 °C ou abaixo) por pelo menos 15-45 min (mais tempo é recomendado por alguns protocolos)3,4,5,6. Este passo abre os animais.
Após o congelamento, os animais são incubados por 1h a 60-65 °C para o proteinase K funcionar, em seguida, a enzima é inativada por 15-30 min a 95 °C. O proteinase K destrói os núcleos que degradam o DNA. A inativação da proteinase K antes do PCR é importante para evitar que a proteinase K degrade a polimerase do DNA. Os dois protocolos baseados em kits descritos aqui são métodos rápidos, confiáveis e econômicos para extrair DNA genômico de um único animal ou alguns nematoides para pesquisas diárias e aplicações laboratoriais de ensino. O kit utilizado foi originalmente otimizado pelo fabricante para extrair DNA de tecido animal, saliva e cabelo7. Ele usa uma solução proprietária de preparação de tecidos e solução de extração para células de lise e torna o DNA genômico acessível. Uma solução proprietária de neutralização neutraliza então os componentes que podem inibir o PCR (por exemplo, sais, íons e moléculas de ligação Mg2+).
Ao genotipar, um único animal pode ser testado. Ao determinar se uma cepa é homozigosa, testar seis ou mais descendentes de um único animal dá alta confiança de que uma linha é homozigosa ou não (há uma chance de 0,02% de escolher aleatoriamente seis descendentes mutantes homozigos de um pai heterozigoso [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Este método 1) é simples, com menos passos do que o método proteinase K, e 2) diminui o tempo de preparação do modelo para 15 min. Os resultados deste trabalho demonstram que o protocolo desenvolvido funciona robustamente na extração de DNA genômico de um único ou poucos worms, que podem ser usados de forma confiável para aplicações a jusante que não requerem DNA altamente purificado, incluindo PCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Determinar os genótipos de C. elegans é um passo importante ao realizar cruzes genéticas para criar novas cepas de C. elegans . Extração genômica de DNA usando um único ou pouco C. elegans é um passo crucial na genotipagem C. elegans. Este protocolo descreve a extração genômica de DNA de C. elegans usando um kit comercial. Este método é rápido e funciona de forma robusta. O DNA genômico extraído usando este método pode ser usado para aplicações a jusante, in…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A cepa N2 e a bactéria E. coli OP50 foram obtidas do Centro genético de Caenorhabditis (CGC), que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). A cepa blmp-1(tm548) foi obtida do Projeto Nacional de Biorefonte, Japão. Os autores agradecem wormbase. Este trabalho foi apoiado pelo NIH R01GM097591 para t.L.G., financiamento interno da Texas Woman’s University para t.L.G, e o Centro de Pesquisa estudantil da TWU para M.F.L.
Materials
| autoclave tape | Defend | 43237-2 | |
| aluminium foil, heavy duty | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| calcium chloride | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp hotplate/stirrer | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, capsules | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifuge | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb) |
| NGM media powder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | |
| PrimeSTAR GXL polymerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb |
| SimpliAmp thermal cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| stir bar | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| worm pick | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
Riferimenti
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , (2007).
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetica. 131, 609-624 (1992).
- Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
- Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-10 (2008).
- Biron, D., Haspel, G. . C. elegans: Methods and Applications. , (2015).
- . Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013)
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).
- Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).
- Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).
- Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
- Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
- Huang, T. -. F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).
- Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
