Мелкомасштабная экстракция геномной ДНК Caenorhabditis elegans
Summary
Здесь представлено описание простого и относительно быстрого выделения геномной ДНК Caenorhabditis elegans от одного или нескольких животных с использованием коммерчески доступного набора тканей. Полученный препарат гДНК является подходящим шаблоном для ПЦР.
Abstract
Геномная экстракция ДНК из одного или нескольких Caenorhabditis elegans имеет много последующих применений, включая ПЦР для генотипирования линий, клонирования и секвенирования. Традиционные методы протеиназы на основе K для геномной экстракции ДНК из C. elegans занимают несколько часов. Коммерческие наборы для экстракции, которые эффективно разрывают кутикулу C. elegans и извлекают геномную ДНК, ограничены. Здесь сообщается о простом, быстром (~ 15 мин) и экономически эффективном методе извлечения геномной ДНК C. elegans , который хорошо подходит для классных и исследовательских приложений. Этот метод экстракции ДНК оптимизирован для использования одной или нескольких поздних личинок (L4) или взрослых нематод в качестве исходного материала для получения надежного шаблона для выполнения ПЦР. Результаты показывают, что качество ДНК подходит для амплификации генных мишеней разных размеров с помощью ПЦР, что позволяет генотипировать одного или нескольких животных даже при разведении до одной пятидесятой геномной ДНК от одного взрослого человека за реакцию. Сообщенные протоколы могут быть надежно использованы для быстрого получения шаблона ДНК из одного или небольшого образца C. elegans для приложений на основе ПЦР.
Introduction
Здесь представлены два связанных протокола для лизиса Caenorhabditis elegans, чтобы сделать ДНК доступной для приложений на основе ПЦР. ПЦР является широко используемым молекулярным методом, используемым для многих применений, включая генотипирование и амплиферацию фрагментов ДНК для клонирования и секвенирования, среди прочих. Маленький (1 мм), свободно живущий круглый червь C. elegans является популярной животной системой для биологических исследований. Получение подходящей геномной ДНК от одного животного или нескольких животных достаточно для амплиации последовательности с помощью ПЦР. Поздние личинки L4 и взрослые особи содержат только ~ 1000 соматических клеток (включая некоторые многоядерные, полиплоидные клетки), половые клетки и (если животное является гравидным гермафродитом) потомство в утробе матери1. Однако эти животные защищены кутикулой, которая должна быть нарушена для извлечения геномной ДНК2. Стандартные методы подготовки шаблона геномной ДНК нематоды для ПЦР включают в себя несколько шагов и занимают несколько часов. Животных сначала замораживают в буфере лизиса червей, содержащем протеиназу K (−70 °C или ниже) в течение не менее 15-45 мин (более длительный рекомендуется некоторыми протоколами)3,4,5,6. Этот шаг раскалывает животных.
После замораживания животных инкубируют в течение 1 ч при 60-65 °С для работы протеиназы К, затем фермент инактивируют в течение 15-30 мин при 95 °С. Протеиназа К разрушает нуклеазы, которые разрушают ДНК. Инактивация протеиназы К перед ПЦР важна для предотвращения деградации протеиназы К ДНК-полимеразы. Два описанных здесь протокола на основе наборов являются быстрыми, надежными и экономически эффективными методами извлечения геномной ДНК либо из одного животного, либо из нескольких нематод для повседневных исследований и обучения лабораторным приложениям. Используемый набор был первоначально оптимизирован производителем для извлечения ДНК из тканей животных, слюны и волос7. Он использует запатентованный раствор для подготовки тканей и экстракционный раствор для лизирования клеток и делает геномную ДНК доступной. Запатентованный нейтрализующий раствор затем нейтрализует компоненты, которые могут ингибировать ПЦР (например, соли, ионы и Mg2+-связывающие молекулы).
При генотипировании может быть протестировано одно животное. При определении того, является ли штамм гомозиготным, тестирование шести или более потомков от одного животного дает высокую уверенность в том, что линия гомозиготна или нет (существует 0,02% вероятность случайного выбора шести гомозиготных мутантных потомков от гетерозиготного родителя [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Этот метод 1) является простым, с меньшим количеством шагов, чем метод протеиназы К, и 2) сокращает время приготовления шаблона до 15 минут. Результаты этой работы демонстрируют, что разработанный протокол надежно работает при извлечении геномной ДНК из одного или нескольких червей, которые могут быть надежно использованы для последующих применений, не требующих высокоочищенной ДНК, включая ПЦР.
Protocol
Representative Results
Discussion
Определение генотипов C. elegans является важным шагом при выполнении генетических скрещиваний для создания новых штаммов C. elegans . Геномная экстракция ДНК с использованием одного или нескольких C. elegans является решающим шагом в генотипировании C. elegans. Этот протокол описы?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Штамм N2 и бактерии E. coli OP50 были получены из Центра генетики Caenorhabditis (CGC), который финансируется Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). Штамм blmp-1(tm548) был получен в результате Национального проекта биоресурсов, Япония. Авторы благодарят WormBase. Эта работа была поддержана NIH R01GM097591 для T.L.G., внутренним финансированием Техасского женского университета для T.L.G и Центром студенческих исследований TWU для M.F.L.
Materials
| autoclave tape | Defend | 43237-2 | |
| aluminium foil, heavy duty | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| calcium chloride | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp hotplate/stirrer | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, capsules | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifuge | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb) |
| NGM media powder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | |
| PrimeSTAR GXL polymerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb |
| SimpliAmp thermal cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| stir bar | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| worm pick | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
Riferimenti
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , (2007).
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetica. 131, 609-624 (1992).
- Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
- Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-10 (2008).
- Biron, D., Haspel, G. . C. elegans: Methods and Applications. , (2015).
- . Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013)
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).
- Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).
- Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).
- Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
- Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
- Huang, T. -. F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).
- Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
