Estrazione su piccola scala di Caenorhabditis elegans DNA genomico

Summary

Qui viene presentata una descrizione dell’isolamento semplice e relativamente rapido del DNA genomico di Caenorhabditis elegans da uno o pochi animali utilizzando un kit di tessuti disponibile in commercio. La preparazione del gDNA risultante è un modello adatto per la PCR.

Abstract

L’estrazione del DNA genomico da una o poche Caenorhabditis elegans ha molte applicazioni a valle, tra cui la PCR per linee di genotipizzazione, clonazione e sequenziamento. I metodi tradizionali a base di proteinasi K per l’estrazione del DNA genomico da C. elegans richiedono diverse ore. I kit di estrazione commerciali che rompono efficacemente la cuticola di C. elegans ed estraggono il DNA genomico sono limitati. Un metodo facile, più veloce (~ 15 minuti) ed economico per estrarre il DNA genomico di C. elegans che funziona bene per le applicazioni in classe e di ricerca è riportato qui. Questo metodo di estrazione del DNA è ottimizzato per utilizzare singoli o pochi nematodi tardo-larvali (L4) o adulti come materiale di partenza per ottenere un modello affidabile per eseguire la PCR. I risultati indicano che la qualità del DNA è adatta per amplificare bersagli genici di diverse dimensioni mediante PCR, consentendo la genotipizzazione di uno o pochi animali anche a diluizioni a un cinquantesimo del DNA genomico da un singolo adulto per reazione. I protocolli riportati possono essere utilizzati in modo affidabile per produrre rapidamente un modello di DNA da un singolo o un piccolo campione di C. elegans per applicazioni basate su PCR.

Introduction

Qui, vengono presentati due protocolli correlati per la lisi di Caenorhabditis elegans per rendere il DNA accessibile per le applicazioni basate sulla PCR. La PCR è una tecnica molecolare comunemente usata per molte applicazioni, tra cui la genotipizzazione e l’amplificazione di frammenti di DNA per la clonazione e il sequenziamento, tra gli altri. Il piccolo (1 mm), nematode a vita libera C. elegans è un sistema animale popolare per la ricerca biologica. Ottenere DNA genomico adeguato da un singolo animale o da pochi animali è sufficiente per amplificare la sequenza mediante PCR. Le larve tardive di L4 e gli adulti contengono solo ~ 1.000 cellule somatiche (comprese alcune cellule poliploidi multi-nucleari), cellule germinali e (se l’animale è un ermafrodita gravido) prole in utero¹. Tuttavia, questi animali sono protetti da una cuticola che deve essere interrotta per estrarre il DNA genomico². I metodi standard per preparare il modello di DNA genomico dei nematodi per la PCR comportano più passaggi e richiedono diverse ore. Gli animali vengono prima congelati in un tampone di lisi worm contenente proteinasi K (-70 °C o inferiore) per almeno 15-45 minuti (più a lungo è raccomandato da alcuni protocolli)3,4,5,6. Questo passaggio apre gli animali.

Dopo il congelamento, gli animali vengono incubati per 1 ora a 60-65 °C affinché la proteinasi K funzioni, quindi l’enzima viene inattivato per 15-30 minuti a 95 °C. La proteinasi K distrugge le nucleasi che degradano il DNA. L’inattivazione della proteinasi K prima della PCR è importante per evitare che la proteinasi K degradi la DNA polimerasi. I due protocolli basati su kit qui descritti sono metodi rapidi, affidabili ed economici per estrarre il DNA genomico da un singolo animale o da alcuni nematodi per la ricerca quotidiana e l’insegnamento delle applicazioni di laboratorio. Il kit utilizzato è stato originariamente ottimizzato dal produttore per estrarre il DNA da tessuti animali, saliva e capelli⁷. Utilizza una soluzione proprietaria di preparazione dei tessuti e una soluzione di estrazione per lisare le cellule e rendere accessibile il DNA genomico. Una soluzione di neutralizzazione proprietaria neutralizza quindi i componenti che possono inibire la PCR (ad esempio, sali, ioni e molecole leganti Mg²+).

Durante la genotipizzazione, un singolo animale può essere testato. Quando si determina se un ceppo è omozigote, testare sei o più figli di un singolo animale dà un’alta sicurezza che una linea sia omozigote o meno (c’è una probabilità dello 0,02% di scegliere casualmente sei progenie mutanti omozigoti da un genitore eterozigote [(1/4)⁶ × 100% = 0,02%]). Questo metodo 1) è semplice, con meno passaggi rispetto al metodo della proteinasi K, e 2) riduce il tempo di preparazione del modello a 15 minuti. I risultati di questo lavoro dimostrano che il protocollo sviluppato funziona in modo robusto nell’estrazione del DNA genomico da uno o pochi vermi, che possono essere utilizzati in modo affidabile per applicazioni a valle che non richiedono DNA altamente purificato, inclusa la PCR.

Protocol

1. Manutenzione di C. elegans NOTA: I ceppi N2 (wild type) e blmp-1(tm548) C. elegans sono stati mantenuti su piastre standard di nematodi (NGM) a 20 °C. Preparare le piastre NGM sciogliendo 23,005 g di polvere NGM in 973 ml di acqua in un pallone da 2 L. Coprire l’apertura del pallone con un foglio di alluminio (o tappo autoclavabile che consente lo sfiato) e fissare il rivestimento con nastro adesivo. Autoclave per sciogliere la polvere e sterili…

Representative Results

Il DNA genomico di uno o pochi adulti wild-type è stato estratto utilizzando il kit commerciale o il protocollo di lisi tradizionale per confrontare l’efficacia di questi due metodi. Questi lisati sono stati poi utilizzati come modelli per la PCR per amplificare un target più grande di ~ 2.100 bp (codifica blmp-1) o un target più piccolo di ~ 500 bp (codificando una parte di sma-10). Entrambi i metodi hanno prodotto con successo prodotti PCR appropriati (Figura 1A). …

Discussion

Determinare i genotipi di C. elegans è un passo importante durante l’esecuzione di incroci genetici per creare nuovi ceppi di C. elegans . L’estrazione del DNA genomico utilizzando una o poche C. elegans è un passo cruciale nella genotipizzazione di C. elegans. Questo protocollo descrive l’estrazione del DNA genomico da C. elegans utilizzando un kit commerciale. Questo metodo è veloce e funziona in modo robusto. Il DNA genomico estratto con questo metodo può essere utilizz…

Materials

autoclave tape	Defend	43237-2
aluminium foil, heavy duty	Reynolds Wrap	2182934
calcium chloride	Millipore Sigma	102382 (CAS 10035-04-8)
Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution)	Sigma-Aldrich Co. LLC	XNAT2-1KT
Isotemp hotplate/stirrer	Fisher Scientific	11-100-495H
LB media, Lennox, capsules	MP Biomedicals, LLC	3002-131
magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous	Thermo Scientific	AC413485000 (CAS 7487-88-9)
microcentrifuge	Labnet International, Inc.	PrismR, C2500-R
NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs, Inc.	M0515S	"Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb)
NGM media powder	US Biological Life Sciences	N1000
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs, Inc.	M0531S	"Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb)
primers	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos
PrimeSTAR GXL polymerase	Takara Bio Inc.	R050B	"Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb
Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb)	New England Biolabs, Inc.	N0550S
SapphireAmp Fast PCR Master Mix	Takara Bio Inc.	RR350A	"Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb
Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix	Sigma-Aldrich Co. LLC	P4600	"Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb
SimpliAmp thermal cycler	Applied Biosystems	A24812
stir bar	Fisher Scientific	14-512-126
vortex mixer	Fisher Scientific	2215365
worm pick	Genesee Scientific Corporation	59-AWP