Caenorhabditis elegans Genomik DNA'sının Küçük Ölçekli Ekstraksiyonu
Summary
Burada, Caenorhabditis elegans genomik DNA’sının ticari olarak temin edilebilen bir doku kiti kullanılarak bir veya birkaç hayvandan basit ve nispeten hızlı bir şekilde izole edilmesinin bir açıklaması sunulmaktadır. Elde edilen gDNA preparatı PCR için uygun bir şablondur.
Abstract
Tek veya birkaç Caenorhabditis elegans’tan genomik DNA ekstraksiyonu, genotipleme hatları, klonlama ve dizileme için PCR dahil olmak üzere birçok aşağı akış uygulamasına sahiptir. C. elegans’tan genomik DNA ekstraksiyonu için geleneksel proteinaz K bazlı yöntemler birkaç saat sürer. C. elegans kütikülünü etkili bir şekilde açan ve genomik DNA’yı çıkaran ticari ekstraksiyon kitleri sınırlıdır. Sınıf ve araştırma uygulamaları için iyi çalışan C. elegans genomik DNA’sını çıkarmak için kolay, daha hızlı (~ 15 dakika) ve uygun maliyetli bir yöntem burada bildirilmiştir. Bu DNA ekstraksiyon yöntemi, PCR gerçekleştirmek için güvenilir bir şablon elde etmek için başlangıç materyali olarak tek veya birkaç geç larva (L4) veya yetişkin nematodları kullanmak üzere optimize edilmiştir. Sonuçlar, DNA kalitesinin, farklı boyutlardaki gen hedeflerini PCR ile yükseltmek için uygun olduğunu ve reaksiyon başına tek bir yetişkinden genomik DNA’nın ellide birine kadar seyreltmelerde bile tek veya birkaç hayvanın genotiplenmesine izin verdiğini göstermektedir. Bildirilen protokoller, PCR tabanlı uygulamalar için tek veya küçük bir C. elegans örneğinden DNA şablonunu hızlı bir şekilde üretmek için güvenilir bir şekilde kullanılabilir.
Introduction
Burada, DNA’yı PCR tabanlı uygulamalar için erişilebilir kılmak amacıyla Caenorhabditis elegans’ın lizisi için iki ilgili protokol sunulmuştur. PCR, diğerlerinin yanı sıra klonlama ve dizileme için DNA fragmanlarının genotiplenmesi ve çoğaltılması da dahil olmak üzere birçok uygulama için kullanılan yaygın olarak kullanılan bir moleküler tekniktir. Küçük (1 mm), serbest yaşayan yuvarlak kurt C. elegans, biyolojik araştırmalar için popüler bir hayvan sistemidir. Tek bir hayvandan veya birkaç hayvandan uygun genomik DNA elde etmek, diziyi PCR ile yükseltmek için yeterlidir. Geç L4 larvaları ve yetişkinleri, utero 1’de sadece ~ 1.000 somatik hücre (bazı çoklu nükleer, poliploid hücreler dahil), germ hücreleri ve (hayvan gravid bir hermafrodit ise) yavru içerir. Bununla birlikte, bu hayvanlar genomik DNA2’yi çıkarmak için bozulması gereken bir kütikül ile korunmaktadır. PCR için nematod genomik DNA şablonu hazırlamak için standart yöntemler birden fazla adım içerir ve birkaç saat sürer. Hayvanlar ilk önce proteinaz K (-70 ° C veya altı) içeren solucan lizis tamponunda en az 15-45 dakika (bazı protokoller tarafından daha uzun süre tavsiye edilir) 3,4,5,6 dondurulur. Bu adım hayvanları açar.
Dondurulduktan sonra, proteinleraz K’nın çalışması için hayvanlar 60-65 ° C’de 1 saat inkübe edilir, daha sonra enzim 95 ° C’de 15-30 dakika boyunca inaktive edilir. Proteinaz K, DNA’yı bozan nükleazları yok eder. PCR’den önce proteinaz K’nın inaktivasyonu, proteinaz K’nın DNA polimerazı bozmasını önlemek için önemlidir. Burada açıklanan iki kit tabanlı protokol, günlük araştırma ve öğretim laboratuar uygulamaları için tek bir hayvandan veya birkaç nematoddan genomik DNA’yı çıkarmak için hızlı, güvenilir ve uygun maliyetli yöntemlerdir. Kullanılan kit başlangıçta üretici tarafından hayvan dokusundan, tükürükten ve saçtan DNA çıkarmak için optimize edildi7. Hücreleri lize etmek ve genomik DNA’yı erişilebilir kılmak için tescilli bir doku hazırlama çözeltisi ve ekstraksiyon çözeltisi kullanır. Tescilli bir nötralizasyon çözeltisi daha sonra PCR’yi inhibe edebilecek bileşenleri nötralize eder (örneğin, tuzlar, iyonlar ve Mg2 + bağlayıcı moleküller).
Genotipleme yaparken, tek bir hayvan test edilebilir. Bir suşun homozigot olup olmadığını belirlerken, tek bir hayvandan altı veya daha fazla yavruyu test etmek, bir çizginin homozigot olup olmadığına dair yüksek güven verir (heterozigot bir ebeveynden altı homozigot mutant soyunun rastgele seçilme şansı% 0.02’dir [(1/4)6 ×% 100 =% 0.02]). Bu yöntem 1) proteinaz K yönteminden daha az adımla basittir ve 2) şablon hazırlama süresini 15 dakikaya düşürür. Bu çalışmadaki sonuçlar, geliştirilen protokolün, PCR de dahil olmak üzere yüksek oranda saflaştırılmış DNA gerektirmeyen aşağı akış uygulamaları için güvenilir bir şekilde kullanılabilen tek veya birkaç solucandan genomik DNA’nın çıkarılmasında sağlam bir şekilde çalıştığını göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans’ın genotiplerini belirlemek, yeni C. elegans suşları oluşturmak için genetik haçlar gerçekleştirirken önemli bir adımdır. Tek veya birkaç C. elegans kullanılarak genomik DNA ekstraksiyonu, C. elegans’ın genotiplendirilmesinde çok önemli bir adımdır. Bu protokol, ticari bir kit kullanarak C. elegans’tan genomik DNA ekstraksiyonunu tanımlar. Bu yöntem hızlıdır ve sağlam çalışır. Bu yöntem kullanılarak ekstrakte edilen genomik DNA, genoti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
N2 suşu ve E. coli OP50 bakterileri, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi’nden (CGC) elde edildi. Blmp-1 (tm548) suşu Japonya Ulusal Biyokaynak Projesi’nden elde edildi. Yazarlar WormBase’e teşekkür ediyor. Bu çalışma NIH R01GM097591 tarafından T.L.G.’ye, Texas Woman’s University tarafından T.L.G.’ye ve TWU’nun Öğrenci Araştırma Merkezi’nin M.F.L.’ye sağladığı iç finansman tarafından desteklenmiştir.
Materials
| autoclave tape | Defend | 43237-2 | |
| aluminium foil, heavy duty | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| calcium chloride | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp hotplate/stirrer | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, capsules | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifuge | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb) |
| NGM media powder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | |
| PrimeSTAR GXL polymerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb |
| SimpliAmp thermal cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| stir bar | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| worm pick | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
Riferimenti
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , (2007).
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetica. 131, 609-624 (1992).
- Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
- Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-10 (2008).
- Biron, D., Haspel, G. . C. elegans: Methods and Applications. , (2015).
- . Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013)
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).
- Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).
- Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).
- Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
- Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
- Huang, T. -. F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).
- Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
