Kleine Extraktion von Caenorhabditis elegans Genomischer DNA
Summary
Hier wird eine Beschreibung der einfachen und relativ schnellen Isolierung der genomischen DNA von Caenorhabditis elegans aus einem oder wenigen Tieren unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Gewebekits vorgestellt. Die resultierende gDNA-Präparation ist eine geeignete Vorlage für die PCR.
Abstract
Die genomische DNA-Extraktion aus einer oder wenigen Caenorhabditis elegans hat viele nachgelagerte Anwendungen, einschließlich PCR für Genotypisierungslinien, Klonen und Sequenzierung. Die traditionellen Proteinase-K-basierten Methoden zur genomischen DNA-Extraktion aus C. elegans dauern mehrere Stunden. Kommerzielle Extraktionskits, die die Cuticula von C. elegans effektiv aufbrechen und genomische DNA extrahieren, sind begrenzt. Eine einfache, schnellere (~ 15 min) und kostengünstige Methode zur Extraktion von C. elegans genomischer DNA, die sich gut für Unterrichts- und Forschungsanwendungen eignet, wird hier berichtet. Diese DNA-Extraktionsmethode ist optimiert, um einzelne oder einige spätlarven (L4) oder erwachsene Nematoden als Ausgangsmaterial für die Gewinnung einer zuverlässigen Vorlage für die Durchführung einer PCR zu verwenden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die DNA-Qualität geeignet ist, Genziele unterschiedlicher Größe durch PCR zu amplifizieren, was die Genotypisierung einzelner oder weniger Tiere auch bei Verdünnungen auf ein Fünfzigstel der genomischen DNA von einem einzelnen Erwachsenen pro Reaktion ermöglicht. Die berichteten Protokolle können zuverlässig verwendet werden, um DNA-Template aus einer einzelnen oder einer kleinen Probe von C. elegans für PCR-basierte Anwendungen schnell herzustellen.
Introduction
Hier werden zwei verwandte Protokolle für die Lyse von Caenorhabditis elegans vorgestellt, um DNA für PCR-basierte Anwendungen zugänglich zu machen. PCR ist eine häufig verwendete molekulare Technik, die für viele Anwendungen verwendet wird, einschließlich der Genotypisierung und Amplifikation von DNA-Fragmenten zum Klonen und Sequenzieren, unter anderem. Der kleine (1 mm), freilebende Spulwurm C. elegans ist ein beliebtes Tiersystem für die biologische Forschung. Die Gewinnung geeigneter genomischer DNA von einem einzelnen Tier oder einigen wenigen Tieren reicht aus, um die Sequenz durch PCR zu amplifizieren. Späte L4-Larven und Erwachsene enthalten nur ~ 1.000 somatische Zellen (einschließlich einiger multinuklearer, polyploider Zellen), Keimzellen und (wenn das Tier ein gravider Hermaphrodit ist) Nachkommen in utero1. Diese Tiere sind jedoch durch eine Kutikula geschützt, die gestört werden muss, um die genomische DNA2 zu extrahieren. Standardmethoden zur Vorbereitung der genomischen DNA-Vorlage für Nematoden für die PCR umfassen mehrere Schritte und dauern mehrere Stunden. Die Tiere werden zunächst in Wurmlysepuffer eingefroren, der Proteinase K (−70 °C oder weniger) für mindestens 15-45 min enthält (längere wird von einigen Protokollen empfohlen)3,4,5,6. Dieser Schritt reißt die Tiere auf.
Nach dem Einfrieren werden die Tiere für 1 h bei 60-65 °C inkubiert, damit die Proteinase K funktioniert, dann wird das Enzym für 15-30 min bei 95 °C inaktiviert. Die Proteinase K zerstört die Nukleasen, die DNA abbauen. Die Inaktivierung der Proteinase K vor der PCR ist wichtig, um zu verhindern, dass die Proteinase K die DNA-Polymerase abbaut. Die beiden hier beschriebenen Kit-basierten Protokolle sind schnelle, zuverlässige und kostengünstige Methoden, um genomische DNA aus einem einzelnen Tier oder einigen Nematoden für alltägliche Forschungs- und Lehrlaboranwendungen zu extrahieren. Das verwendete Kit wurde ursprünglich vom Hersteller optimiert, um DNA aus tierischem Gewebe, Speichel und Haaren zu extrahieren7. Es verwendet eine proprietäre Gewebepräparationslösung und Extraktionslösung, um Zellen zu lysieren und genomische DNA zugänglich zu machen. Eine proprietäre Neutralisationslösung neutralisiert dann die Komponenten, die die PCR hemmen können (z. B. Salze, Ionen und Mg2+-bindende Moleküle).
Bei der Genotypisierung kann ein einzelnes Tier getestet werden. Bei der Bestimmung, ob ein Stamm homozygot ist, gibt das Testen von sechs oder mehr Nachkommen eines einzelnen Tieres eine hohe Sicherheit, dass eine Linie homozygot ist oder nicht (es besteht eine Wahrscheinlichkeit von 0,02%, dass zufällig sechs homozygote mutierte Nachkommen von einem heterozygoten Elternteil ausgewählt werden [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Diese Methode 1) ist einfach, mit weniger Schritten als die Proteinase K-Methode, und 2) verringert die Vorlagenvorbereitungszeit auf 15 min. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass das entwickelte Protokoll robust bei der Extraktion genomischer DNA aus einzelnen oder wenigen Würmern funktioniert, die zuverlässig für nachgelagerte Anwendungen verwendet werden kann, die keine hochgereinigte DNA benötigen, einschließlich PCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Bestimmung der Genotypen von C. elegans ist ein wichtiger Schritt bei der Durchführung genetischer Kreuzungen, um neue C. elegans-Stämme zu erzeugen. Die genomische DNA-Extraktion mit einem oder wenigen C. elegans ist ein entscheidender Schritt bei der Genotypisierung von C. elegans. Dieses Protokoll beschreibt die genomische DNA-Extraktion aus C. elegans mit einem kommerziellen Kit. Diese Methode ist schnell und funktioniert robust. Die mit dieser Methode extrahierte g…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Der N2-Stamm und E. coli OP50-Bakterien wurden vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC) bezogen, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird. Der Stamm blmp-1(tm548) wurde vom National Bioresource Project, Japan, bezogen. Die Autoren danken WormBase. Diese Arbeit wurde von NIH R01GM097591 an T.L.G., interne Finanzierung durch die Texas Woman’s University an T.L.G. und TWU’s Center for Student Research an M.F.L. unterstützt.
Materials
| autoclave tape | Defend | 43237-2 | |
| aluminium foil, heavy duty | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| calcium chloride | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp hotplate/stirrer | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, capsules | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifuge | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb) |
| NGM media powder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | |
| PrimeSTAR GXL polymerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb |
| SimpliAmp thermal cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| stir bar | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| worm pick | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
Riferimenti
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , (2007).
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetica. 131, 609-624 (1992).
- Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
- Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-10 (2008).
- Biron, D., Haspel, G. . C. elegans: Methods and Applications. , (2015).
- . Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013)
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).
- Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).
- Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).
- Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
- Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
- Huang, T. -. F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).
- Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
