Extraction à petite échelle de l’ADN génomique de Caenorhabditis elegans

Summary

Voici une description de l’isolement simple et relativement rapide de l’ADN génomique de Caenorhabditis elegans à partir d’un ou de quelques animaux à l’aide d’un kit de tissus disponible dans le commerce. La préparation d’ADNg qui en résulte est un modèle approprié pour la PCR.

Abstract

L’extraction génomique de l’ADN à partir d’un ou de quelques Caenorhabditis elegans a de nombreuses applications en aval, y compris la PCR pour les lignées de génotypage, le clonage et le séquençage. Les méthodes traditionnelles à base de protéinase K pour l’extraction de l’ADN génomique de C. elegans prennent plusieurs heures. Les kits d’extraction commerciaux qui ouvrent efficacement la cuticule de C. elegans et extraient l’ADN génomique sont limités. Une méthode facile, plus rapide (~ 15 min) et rentable d’extraction de l’ADN génomique de C. elegans qui fonctionne bien pour les applications en classe et en recherche est rapportée ici. Cette méthode d’extraction de l’ADN est optimisée pour utiliser un ou quelques nématodes larvaires tardifs (L4) ou adultes comme matériau de départ pour obtenir un modèle fiable pour effectuer la PCR. Les résultats indiquent que la qualité de l’ADN convient à l’amplification de cibles génétiques de différentes tailles par PCR, permettant le génotypage d’un ou de quelques animaux, même à des dilutions à un cinquantième de l’ADN génomique d’un seul adulte par réaction. Les protocoles signalés peuvent être utilisés de manière fiable pour produire rapidement un modèle d’ADN à partir d’un seul ou d’un petit échantillon de C. elegans pour des applications basées sur la PCR.

Introduction

Ici, deux protocoles connexes sont présentés pour la lyse de Caenorhabditis elegans afin de rendre l’ADN accessible pour les applications basées sur la PCR. La PCR est une technique moléculaire couramment utilisée pour de nombreuses applications, y compris le génotypage et l’amplification de fragments d’ADN pour le clonage et le séquençage, entre autres. Le petit ver rond (1 mm) vivant librement C. elegans est un système animal populaire pour la recherche biologique. L’obtention d’ADN génomique approprié à partir d’un seul animal ou de quelques animaux est suffisante pour amplifier la séquence par PCR. Les larves et les adultes de la fin de la L4 ne contiennent que ~1 000 cellules somatiques (y compris certaines cellules polyploïdes multinucléaires), des cellules germinales et (si l’animal est un hermaphrodite gravide) une progéniture in utero¹. Cependant, ces animaux sont protégés par une cuticule qui doit être perturbée pour extraire l’ADN génomique². Les méthodes standard pour préparer un modèle d’ADN génomique de nématode pour la PCR impliquent plusieurs étapes et prennent plusieurs heures. Les animaux sont d’abord congelés dans un tampon de lyse de ver contenant de la protéinase K (−70 °C ou moins) pendant au moins 15 à 45 min (plus longtemps est recommandé par certains protocoles)^3,4,5,6. Cette étape ouvre les animaux.

Après congélation, les animaux sont incubés pendant 1 h à 60-65 °C pour que la protéinase K fonctionne, puis l’enzyme est inactivée pendant 15-30 min à 95 °C. La protéinase K détruit les nucléases qui dégradent l’ADN. L’inactivation de la protéinase K avant la PCR est importante pour empêcher la protéinase K de dégrader l’ADN polymérase. Les deux protocoles basés sur des kits décrits ici sont des méthodes rapides, fiables et rentables pour extraire l’ADN génomique d’un seul animal ou de quelques nématodes pour la recherche quotidienne et l’enseignement des applications de laboratoire. Le kit utilisé a été optimisé à l’origine par le fabricant pour extraire l’ADN des tissus animaux, de la salive et des cheveux⁷. Il utilise une solution exclusive de préparation tissulaire et une solution d’extraction pour lyser les cellules et rendre l’ADN génomique accessible. Une solution de neutralisation exclusive neutralise ensuite les composants qui peuvent inhiber la PCR (par exemple, les sels, les ions et les molécules de liaison Mg²⁺).

Lors du génotypage, un seul animal peut être testé. Pour déterminer si une souche est homozygote, le fait de tester six descendants ou plus d’un seul animal donne une grande confiance qu’une lignée est homozygote ou non (il y a 0,02 % de chances de choisir au hasard six descendants mutants homozygotes d’un parent hétérozygote [(1/4)⁶ × 100 % = 0,02 %]). Cette méthode 1) est simple, avec moins d’étapes que la méthode de la protéinase K, et 2) réduit le temps de préparation du gabarit à 15 min. Les résultats de ce travail démontrent que le protocole développé fonctionne de manière robuste dans l’extraction de l’ADN génomique d’un ou de quelques vers, qui peut être utilisé de manière fiable pour des applications en aval qui ne nécessitent pas d’ADN hautement purifié, y compris la PCR.

Protocol

1. Entretien de C. elegans REMARQUE : Les souches N2 (type sauvage) et blmp-1(tm548) de C. elegans ont été maintenues sur des plaques de milieux de croissance de nématodes (NGM) standard à 20 °C. Préparer les plaques de NGM en dissolvant 23,005 g de poudre de NGM dans 973 mL d’eau dans une fiole de 2 L. Couvrez l’ouverture du ballon avec du papier d’aluminium (ou un capuchon autoclavable qui permet la ventilation) et fixez le revêtement…

Representative Results

L’ADN génomique d’un ou de quelques adultes de type sauvage a été extrait à l’aide du kit commercial ou du protocole de lyse traditionnel pour comparer l’efficacité de ces deux méthodes. Ces lysats ont ensuite été utilisés comme modèles pour la PCR afin d’amplifier soit une cible plus grande d’environ 2 100 pb (codage blmp-1), soit une cible plus petite d’environ 500 pb (codant une partie de sma-10). Les deux méthodes ont permis d’obtenir des produits de PCR appropriés (<stro…

Discussion

Déterminer les génotypes de C. elegans est une étape importante lors de la réalisation de croisements génétiques pour créer de nouvelles souches de C. elegans . L’extraction génomique de l’ADN à l’aide d’un seul ou de quelques C. elegans est une étape cruciale dans le génotypage de C. elegans. Ce protocole décrit l’extraction d’ADN génomique de C. elegans à l’aide d’un kit commercial. Cette méthode est rapide et fonctionne de manière robuste. L?…

Materials

autoclave tape	Defend	43237-2
aluminium foil, heavy duty	Reynolds Wrap	2182934
calcium chloride	Millipore Sigma	102382 (CAS 10035-04-8)
Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution)	Sigma-Aldrich Co. LLC	XNAT2-1KT
Isotemp hotplate/stirrer	Fisher Scientific	11-100-495H
LB media, Lennox, capsules	MP Biomedicals, LLC	3002-131
magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous	Thermo Scientific	AC413485000 (CAS 7487-88-9)
microcentrifuge	Labnet International, Inc.	PrismR, C2500-R
NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs, Inc.	M0515S	"Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb)
NGM media powder	US Biological Life Sciences	N1000
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs, Inc.	M0531S	"Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb)
primers	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos
PrimeSTAR GXL polymerase	Takara Bio Inc.	R050B	"Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb
Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb)	New England Biolabs, Inc.	N0550S
SapphireAmp Fast PCR Master Mix	Takara Bio Inc.	RR350A	"Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb
Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix	Sigma-Aldrich Co. LLC	P4600	"Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb
SimpliAmp thermal cycler	Applied Biosystems	A24812
stir bar	Fisher Scientific	14-512-126
vortex mixer	Fisher Scientific	2215365
worm pick	Genesee Scientific Corporation	59-AWP