Caenorhabditis elegans Genomic DNA의 소규모 추출
Summary
여기에 제시된 것은 시판되는 조직 키트를 사용하여 하나 또는 몇몇 동물로부터 예 쁜꼬마선충 게놈 DNA의 간단하고 비교적 신속한 분리에 대한 설명이다. 생성된 gDNA 제제는 PCR에 적합한 주형이다.
Abstract
단일 또는 몇몇 예쁜꼬마선충으로부터의 게놈 DNA 추출 은 유전자형 분석, 클로닝 및 시퀀싱을 위한 PCR을 포함한 많은 다운스트림 응용을 갖는다. C. elegans 에서 게놈 DNA 추출을위한 전통적인 프로테이나제 K 기반 방법은 몇 시간이 걸립니다. C. elegans 표피를 효과적으로 열고 게놈 DNA를 추출하는 상업적 추출 키트는 제한적입니다. 교실 및 연구 응용 분야에 잘 작동하는 C. elegans 게놈 DNA를 추출하는 쉽고 빠르며 비용 효율적인 방법이 여기에보고되었습니다. 이 DNA 추출 방법은 PCR을 수행하기 위해 신뢰할 수있는 주형을 얻기 위한 출발 물질로서 단일 또는 몇 개의 후기 유충 (L4) 또는 성인 선충류를 사용하도록 최적화되어 있습니다. 결과는 DNA 품질이 PCR에 의해 상이한 크기의 유전자 표적을 증폭시키는 데 적합하다는 것을 나타내며, 반응 당 단일 성인으로부터 게놈 DNA의 일-오십분의 일로 희석 된 경우에도 단일 또는 몇 마리의 동물의 유전자형을 허용한다. 보고된 프로토콜은 PCR 기반 응용을 위해 C. elegans 의 단일 또는 작은 샘플로부터 DNA 주형을 신속하게 생산하는데 신뢰성 있게 사용될 수 있다.
Introduction
여기에서, PCR 기반 응용을 위해 DNA에 접근할 수 있도록 예쁜꼬마선충의 용해를 위한 두 가지 관련 프로토콜이 제시된다. PCR은 클로닝 및 시퀀싱을 위한 DNA 단편의 지노타이핑 및 증폭을 포함한 많은 응용 분야에 일반적으로 사용되는 분자 기술입니다. 작은 (1mm), 자유 살아있는 회충 C. elegans는 생물학적 연구를위한 인기있는 동물 시스템입니다. 단일 동물 또는 몇몇 동물로부터 적합한 게놈 DNA를 수득하는 것은 PCR에 의해 서열을 증폭시키기에 충분하다. 후기 L4 유충과 성인은 utero 1의 ~ 1,000 개의 체세포 (일부 다중 핵, 다발성 세포 포함), 생식 세포 및 (동물이 gravid hermaphrodite인 경우) 자손 만 포함합니다. 그러나, 이들 동물은 게놈 DNA2를 추출하기 위해 파쇄되어야 하는 표피에 의해 보호된다. PCR을 위해 선충류 게놈 DNA 주형을 준비하는 표준 방법은 여러 단계를 포함하며 몇 시간이 걸립니다. 동물들은 먼저 프로테이나제 K를 함유하는 웜 용해 완충액(-70°C 이하)에서 적어도 15-45분(일부 프로토콜에 의해 더 긴 것이 권장됨)3,4,5,6 동안 동결된다. 이 단계는 동물을 열어줍니다.
동결 후, 동물을 프로테이나제 K가 작용하도록 60-65°C에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 효소를 95°C에서 15-30분 동안 불활성화시킨다. 프로테이나제 K는 DNA를 분해하는 뉴클레아제를 파괴합니다. PCR 전에 프로테이나제 K의 불활성화는 프로테이나제 K가 DNA 중합효소를 분해하는 것을 방지하는 데 중요하다. 여기에 설명 된 두 가지 키트 기반 프로토콜은 일상적인 연구 및 교육 실험실 응용 프로그램을 위해 단일 동물 또는 몇 마리의 선충류에서 게놈 DNA를 추출하는 빠르고 안정적이며 비용 효율적인 방법입니다. 사용 된 키트는 원래 제조업체가 동물 조직, 타액 및 모발에서 DNA를 추출하도록 최적화되었습니다7. 독점적 인 조직 준비 솔루션과 추출 용액을 사용하여 세포를 용해시키고 게놈 DNA에 접근 할 수 있도록합니다. 그런 다음 독점 중화 용액은 PCR을 억제할 수 있는 성분(예: 염, 이온 및Mg2+ 결합 분자)을 중화시킵니다.
유전자형을 만들 때 단일 동물을 테스트 할 수 있습니다. 균주가 동형접합성인지 판단할 때, 단일 동물로부터 6개 이상의 자손을 시험하는 것은 선이 동형접합성인지 아닌지에 대한 높은 확신을 준다(이형접합성 부모로부터 6개의 동형접합성 돌연변이 자손을 무작위로 선별할 확률은 0.02%이다[(1/4)6 × 100% = 0.02%]). 이 방법은 1) 프로테이나제 K 방법보다 적은 단계로, 간단하고, 2) 주형 준비 시간을 15분으로 감소시킨다. 이 연구의 결과는 개발 된 프로토콜이 단일 또는 몇 개의 웜에서 게놈 DNA를 추출하는 데 강력하게 작동한다는 것을 보여 주며, 이는 PCR을 포함하여 고도로 정제 된 DNA를 필요로하지 않는 하류 응용 분야에 안정적으로 사용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans의 유전자형을 결정하는 것은 새로운 C. elegans 균주를 만들기 위해 유전 적 교차를 수행하는 동안 중요한 단계입니다. 단일 또는 몇 개의 C. elegans를 이용한 게놈 DNA 추출은 C. elegans를 지노타이핑하는 데 중요한 단계입니다. 이 프로토콜은 상용 키트를 사용하여 C. elegans로부터의 게놈 DNA 추출을 기술한다. 이 방법은 빠르며 강력하게 작동합니다. 이 방법을 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
N2 균주 및 대장균 OP50 박테리아는 NIH 연구 인프라 프로그램 사무소 (P40 OD010440)가 자금을 지원하는 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)로부터 수득되었다. blmp-1(tm548) 균주는 일본 국립 생물자원 프로젝트로부터 입수하였다. 저자는 웜베이스에 감사드립니다. 이 작업은 NIH R01GM097591에서 T.L.G., Texas Woman ‘s University가 T.L.G.에 내부 자금을 지원하고, TWU의 학생 연구 센터가 M.F.L.에 지원했습니다.
Materials
| autoclave tape | Defend | 43237-2 | |
| aluminium foil, heavy duty | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| calcium chloride | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp hotplate/stirrer | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, capsules | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifuge | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb) |
| NGM media powder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | |
| PrimeSTAR GXL polymerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb |
| SimpliAmp thermal cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| stir bar | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| worm pick | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
Riferimenti
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