Mikrokoloniebildender Unit-Assay zur Wirksamkeitsbewertung von Impfstoffen gegen Tuberkulose
Summary
Die Bestimmung koloniebildender Einheiten (KBE) ist die Goldstandard-Technik zur Quantifizierung von Bakterien, einschließlich Mycobacterium tuberculosis , die Wochen brauchen kann, um sichtbare Kolonien zu bilden. Hier beschreiben wir eine Mikrokbe für die KBE-Bestimmung mit erhöhter Zeiteffizienz, reduziertem Laborplatz und Reagenzienkosten sowie Skalierbarkeit auf Experimente mit mittlerem und hohem Durchsatz.
Abstract
Tuberkulose (TB), die weltweit häufigste Todesursache durch einen Infektionserreger, tötete im Jahr 2022 1,6 Millionen Menschen und wurde erst während der Pandemie 2019-2021 von COVID-19 übertroffen. Die Krankheit wird durch das Bakterium Mycobacterium tuberculosis (M.tb) verursacht. Der Mycobacterium bovis-Stamm Bacillus Calmette-Guérin (BCG), der einzige TB-Impfstoff, ist der älteste zugelassene Impfstoff der Welt, der noch verwendet wird. Derzeit befinden sich 12 Impfstoffe in klinischen Studien und Dutzende von Impfstoffen in der präklinischen Entwicklung. Die Methode der Wahl, um die Wirksamkeit von TB-Impfstoffen in präklinischen Studien zu beurteilen, ist die Zählung von Bakterienkolonien durch den Colony-Forming Units (KBE)-Assay. Dieser zeitaufwändige Assay dauert 4 bis 6 Wochen, erfordert viel Platz im Labor und im Inkubator, hat hohe Reagenzienkosten und ist anfällig für Kontaminationen. Hier beschreiben wir eine optimierte Methode zur Koloniezählung, die Mikro-KBE (mCFU), die eine einfache und schnelle Lösung zur Analyse der Wirksamkeit von M.tb-Impfstoffen bietet. Der mCFU-Assay benötigt zehnmal weniger Reagenzien, verkürzt die Inkubationszeit um das Dreifache und dauert 1 bis 2 Wochen, reduziert den Platzbedarf im Labor und die Reagenzienkosten und minimiert die Gesundheits- und Sicherheitsrisiken, die mit der Arbeit mit einer großen Anzahl von M.tb verbunden sind. Um die Wirksamkeit eines Tuberkuloseimpfstoffs zu bewerten, können Proben aus einer Vielzahl von Quellen entnommen werden, einschließlich Gewebe von geimpften Tieren, die mit Mykobakterien infiziert sind. Wir beschreiben auch eine optimierte Methode zur Herstellung einer einzelligen, einheitlichen und qualitativ hochwertigen Mykobakterienkultur für Infektionsstudien. Schließlich schlagen wir vor, dass diese Methoden universell für präklinische Studien zur Bestimmung der Wirksamkeit von Impfstoffen eingesetzt werden sollten, was letztendlich zu einer Zeitverkürzung bei der Entwicklung von Impfstoffen gegen TB führt.
Introduction
Tuberkulose (TB) ist weltweit die häufigste Todesursache durch einen einzigen Infektionserreger, das Bakterium Mycobacterium tuberculosis (M.tb), das mehr Menschen tötet als jeder andere Krankheitserreger. Im Jahr 2021 war Tuberkulose für 1,6 Millionen Todesfälle verantwortlich und wurde während der Pandemie 2019-2021 von COVID-19 übertroffen1. Darüber hinaus war laut dem globalen TB-Bericht der Weltgesundheitsorganisation von 2022 die COVID-19-Pandemie für einen Anstieg der neuen TB-Fälle verantwortlich. Die WHO berichtet auch von einem starken Rückgang der Zahl der Menschen, bei denen in diesem Zeitraum Tuberkulose diagnostiziert wurde, was die Zahl der Tuberkulosefälle weiter erhöhen könnte1.
Der Bacillus Calmette-Guérin (BCG) ist ein lebend abgeschwächter Stamm des pathogenen Mycobacterium bovis, der vor mehr als 100 Jahren erstmals als Impfstoff eingesetzt wurde. Dies ist der einzige Impfstoff gegen Tuberkulose und der älteste zugelassene Impfstoff der Welt, der noch verwendet wird 2,3. Derzeit befinden sich 12 Impfstoffe in verschiedenen Phasen klinischer Studien4 und Dutzende von Impfstoffen befinden sich in der präklinischen Entwicklung 5,6. Die präklinische Bewertung von Impfstoffen gegen Tuberkulose umfasst die Bewertung der Sicherheit und Immunogenität7, die in verschiedenen Tiermodellen wie Zebrafischen, Mäusen, Meerschweinchen, Kaninchen, Rindern und nichtmenschlichen Primaten erzielt werdenkönnen 8,9,10. Darüber hinaus erfordert die Beurteilung der Fähigkeit eines Impfstoffs, einen Schutz vor einer M.tb-Infektion und/oder -Übertragung zu induzieren, d. h. die Wirksamkeit des Impfstoffs, eine M.tb-Provokation in vivo 5,11. Interessanterweise induziert die BCG-Impfung unspezifische Effekte, die das Überleben anderer bakterieller und viraler Krankheitserreger beeinflussen12,13 durch den Mechanismus der trainierten Immunität14. Um die lebensfähige Bakterienlast in einem infizierten Tier zu quantifizieren, ist die Methode der Wahl die Zählung von Bakterienkolonien durch den Colony-Forming Units (KBE)-Assay 5,15. KBE ist eine Einheit, die die Anzahl der Mikroorganismen (Bakterien oder Pilze) schätzt, die unter bestimmten Wachstumsbedingungen Kolonien bilden. KBE stammen von lebensfähigen und replizierten Mikroorganismen, und die absolute Anzahl der lebenden Mikroorganismen in jeder Kolonie ist schwer abzuschätzen. Es ist unsicher, ob eine Kolonie aus einem oder mehreren Mikroorganismen entstanden ist. Die KBE-Einheit spiegelt diese Unsicherheit wider, so dass eine große Variabilität in Replikaten derselben Probe beobachtet werden kann. Dieser zeitaufwändige Assay erfordert spezialisierte Techniker, die für die Arbeit in einer Einrichtung der Biosicherheitsstufe 3 (BSL3) geschult sind, einen beträchtlichen Labor- und Inkubatorplatz, dauert 4 bis 6 Wochen und ist anfällig für Kontaminationen.
In dieser Studie beschreiben wir eine optimierte Methode zur Koloniezählung, die Mikro-KBE (mCFU), und bieten eine einfache und schnelle Lösung zur Analyse der Ergebnisse 15,16,17,18,19,20. Der mCFU-Assay benötigt zehnmal weniger Reagenzien, verkürzt die Inkubationszeit um das Dreifache und dauert 1 bis 2 Wochen, reduziert den Platzbedarf im Labor und die Reagenzienkosten und minimiert die Gesundheits- und Sicherheitsrisiken, die mit der Arbeit mit einer großen Anzahl von M.tb verbunden sind. Wir schlagen vor, dass diese Methode universell für präklinische Studien zur Bestimmung der Wirksamkeit von Impfstoffen eingesetzt werden sollte, was letztendlich zu einer Zeitverkürzung bei der Entwicklung von Impfstoffen gegen TB führt. Schließlich wurde diese optimierte Methode der KBE-Zählung verwendet, um nicht nur Mykobakterien, sondern auch andere Bakterien wie Escherichia coli und Ralstonia solanacearum21 zu quantifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tuberkulose ist ein wichtiges Problem der öffentlichen Gesundheit, das vor allem in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen zunehmend an Bedeutung gewinnt. Die Unterbrechung der Gesundheitseinrichtungen zur Diagnose und Behandlung von Tuberkulose während der COVID-19-Pandemie wirkte sich negativ auf die Inzidenz neuer Fälle aus1. Darüber hinaus müssen die multiresistenten und extensiv resistenten M.tb-Stämme und die Koinfektion von M.tb und HIV dringend angegangen we…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch interne Mittel der Medizinischen Fakultät der Universidade Católica Portuguesa und externe Mittel der Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) im Rahmen der Zuschüsse UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 und EXPL/SAU-INF/0742/2021 unterstützt.
Materials
| 96-well plates | VWR | 734-2781 | |
| DSLR 15-55 mm lens | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
| DSLR camera | Nikon | D3400 | |
| DSLR macro lens | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270106 | |
| Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included. | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
| Multichannel pipette (0.5 – 10 µl) | Gilson | FA10013 | |
| Multichannel pipette (20 – 200 µl) | Gilson | FA10011 | |
| Mycobacterium bovis BCG | American Type Culture Collection | ATCC35734 | strain TMC 1011 [BCG Pasteur] |
| OADC enrichment | BD | 211886 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Spectrophotometer UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
| Square Petri dish 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
| Ultrasound bath Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |
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