La determinazione delle unità formanti colonie (CFU) è la tecnica gold standard per quantificare i batteri, tra cui il Mycobacterium tuberculosis che può richiedere settimane per formare colonie visibili. Qui descriviamo un micro-CFU per la determinazione di CFU con una maggiore efficienza temporale, una riduzione dello spazio di laboratorio e del costo dei reagenti e la scalabilità per esperimenti a media e alta produttività.
La tubercolosi (TB), la principale causa di morte in tutto il mondo per un agente infettivo, ha ucciso 1,6 milioni di persone nel 2022, superata solo dal COVID-19 durante la pandemia 2019-2021. La malattia è causata dal batterio Mycobacterium tuberculosis (M.tb). Il ceppo di Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), l’unico vaccino contro la tubercolosi, è il più antico vaccino autorizzato al mondo, ancora in uso. Attualmente, ci sono 12 vaccini in fase di sperimentazione clinica e dozzine di vaccini in fase di sviluppo preclinico. Il metodo di scelta utilizzato per valutare l’efficacia dei vaccini contro la tubercolosi negli studi preclinici è l’enumerazione delle colonie batteriche mediante il test delle unità formanti colonie (CFU). Questo test richiede dalle 4 alle 6 settimane per essere concluso, richiede un notevole spazio in laboratorio e nell’incubatore, ha costi elevati per i reagenti ed è soggetto a contaminazione. Qui descriviamo un metodo ottimizzato per l’enumerazione delle colonie, il micro-CFU (mCFU), che offre una soluzione semplice e rapida per analizzare i risultati dell’efficacia del vaccino contro la tubercolosi . Il test mCFU richiede un numero dieci volte inferiore di reagenti, riduce di tre volte il periodo di incubazione, impiegando da 1 a 2 settimane per concludersi, riduce lo spazio di laboratorio e il costo dei reagenti e riduce al minimo i rischi per la salute e la sicurezza associati al lavoro con un gran numero di M.tb. Inoltre, per valutare l’efficacia di un vaccino contro la tubercolosi, è possibile ottenere campioni da una varietà di fonti, compresi tessuti di animali vaccinati infettati da micobatteri. Descriviamo anche un metodo ottimizzato per produrre una coltura micobatterica unicellulare, uniforme e di alta qualità per gli studi sulle infezioni. Infine, proponiamo che questi metodi siano universalmente adottati per gli studi preclinici sulla determinazione dell’efficacia dei vaccini, portando in ultima analisi a una riduzione dei tempi di sviluppo dei vaccini contro la tubercolosi.
La tubercolosi (TBC) è la principale causa di morte in tutto il mondo a causa di un singolo agente infettivo, il batterio Mycobacterium tuberculosis (M.tb), che uccide più persone di qualsiasi altro agente patogeno. Nel 2021, la tubercolosi è stata responsabile di 1,6 milioni di decessi ed è stata superata dalla COVID-19 durante la pandemia 2019-20211. Inoltre, secondo il rapporto globale sulla tubercolosi del 2022 dell’Organizzazione Mondiale della Sanità, la pandemia di COVID-19 è stata responsabile di un aumento dei nuovi casi di tubercolosi. L’OMS segnala anche un forte calo del numero di persone a cui è stata diagnosticata la tubercolosi durante questo periodo, il che potrebbe aumentare ulteriormente il numerodi casi di tubercolosi.
Il Bacillus Calmette-Guérin (BCG) è un ceppo vivo attenuato del patogeno Mycobacterium bovis, utilizzato per la prima volta come vaccino più di 100 anni fa. Questo è l’unico vaccino contro la tubercolosi ed è il più antico vaccino autorizzato al mondo ancora in uso 2,3. Attualmente, ci sono 12 vaccini in diverse fasi di sperimentazione clinica4 e dozzine di vaccini sono in fase di sviluppo preclinico 5,6. La valutazione preclinica dei vaccini contro la tubercolosi include la valutazione della sicurezza e dell’immunogenicità7, che possono essere ottenute in diversi modelli animali come pesce zebra, topi, porcellini d’India, conigli, bovini e primati non umani 8,9,10. Inoltre, la valutazione della capacità di un vaccino di indurre protezione contro l’infezione e/o la trasmissione di M.tb, cioè l’efficacia del vaccino, richiede un challenge di M.tb in vivo 5,11. È interessante notare che la vaccinazione BCG induce effetti non specifici che influenzano la sopravvivenza di altri patogeni batterici e virali12,13 attraverso il meccanismo dell’immunità addestrata14. Per quantificare la carica batterica vitale in un animale infetto, il metodo di scelta è l’enumerazione delle colonie batteriche attraverso il test delle unità formanti colonie (CFU) 5,15. La CFU è un’unità che stima il numero di microrganismi (batteri o funghi) che formano colonie in specifiche condizioni di crescita. I CFU provengono da microrganismi vitali e replicativi e il numero assoluto di microrganismi viventi all’interno di ciascuna colonia è difficile da stimare. Non è chiaro se una colonia abbia avuto origine da uno o più microrganismi. L’unità CFU riflette questa incertezza, quindi si può osservare una grande variabilità nelle repliche dello stesso campione. Questo test richiede molto tempo e tecnici specializzati formati per lavorare in una struttura di livello di biosicurezza 3 (BSL3), un ampio spazio di laboratorio e incubatore, richiede da 4 a 6 settimane per concludersi ed è soggetto a contaminazione.
In questo studio, descriviamo un metodo ottimizzato per l’enumerazione delle colonie, il micro-CFU (mCFU), e offriamo una soluzione semplice e rapida per analizzare i risultati 15,16,17,18,19,20. Il test mCFU richiede un numero dieci volte inferiore di reagenti, riduce di tre volte il periodo di incubazione, impiegando da 1 a 2 settimane per concludersi, riduce lo spazio di laboratorio e il costo dei reagenti e riduce al minimo i rischi per la salute e la sicurezza associati al lavoro con un gran numero di M.tb. Proponiamo che questo metodo sia universalmente adottato per gli studi preclinici sulla determinazione dell’efficacia dei vaccini, portando in ultima analisi a una riduzione dei tempi di sviluppo dei vaccini contro la tubercolosi. Infine, questo metodo ottimizzato di enumerazione CFU è stato utilizzato per quantificare non solo i micobatteri ma anche altri batteri, come Escherichia coli e Ralstonia solanacearum21.
La tubercolosi è un importante problema di salute pubblica con un’importanza crescente, in particolare nei paesi a basso e medio reddito. L’interruzione delle strutture sanitarie per la diagnosi e il trattamento della tubercolosi durante la pandemia di COVID-19 ha causato un impatto negativo sull’incidenza di nuovi casi1. Inoltre, i ceppi di M.tb multi-farmaco ed estensivamente resistenti ai farmaci e la co-infezione di M.tb e HIV devono essere affrontati con urgenza per control…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti interni della Facoltà di Medicina, Universidade Católica Portuguesa, e da finanziamenti esterni della Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), nell’ambito delle sovvenzioni UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 e EXPL/SAU-INF/0742/2021.
96-well plates | VWR | 734-2781 | |
DSLR 15-55 mm lens | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
DSLR camera | Nikon | D3400 | |
DSLR macro lens | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
Fetal calf serum | Gibco | 10270106 | |
Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included. | |
Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
Multichannel pipette (0.5 – 10 µl) | Gilson | FA10013 | |
Multichannel pipette (20 – 200 µl) | Gilson | FA10011 | |
Mycobacterium bovis BCG | American Type Culture Collection | ATCC35734 | strain TMC 1011 [BCG Pasteur] |
OADC enrichment | BD | 211886 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Spectrophotometer UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
Square Petri dish 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
Ultrasound bath Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |