結核ワクチンの有効性評価のためのマイクロコロニー形成ユニットアッセイ
Summary
コロニー形成単位(CFU)の測定は、目に見えるコロニーを形成するのに数週間かかる結 核菌 を含む細菌を定量するためのゴールドスタンダード技術です。ここでは、時間効率の向上、ラボのスペースと試薬コストの削減、ミディアムおよびハイスループット実験へのスケーラビリティを備えたCFU測定用のマイクロCFUについて説明します。
Abstract
感染性病原体による世界の死因の第1位である結核(TB)は、2022年に160万人が死亡しましたが、2019年から2021年のパンデミック時にCOVID-19によってのみ上回りました。この病気は、 結核菌 (M.tb)によって引き起こされます。唯一の結核ワクチンである マイコバクテリウム・ウシ・バ チルス・カルメット・ゲラン(BCG)は、世界最古の認可済みワクチンであり、現在も使用されています。現在、12種類のワクチンが臨床試験中であり、数十種類のワクチンが前臨床開発中です。前臨床試験で結核ワクチンの有効性を評価するために使用される方法は、コロニー形成ユニット(CFU)アッセイによる細菌コロニーの列挙です。この時間のかかるアッセイは、結論が出るまでに4〜6週間かかり、ラボとインキュベーターのスペースがかなり必要で、試薬コストが高く、汚染されやすいです。ここでは、 M.tb ワクチンの有効性結果を分析するためのシンプルで迅速なソリューションを提供する、コロニーの計数に最適化された方法であるmicro-CFU(mCFU)について説明します。mCFUアッセイは、必要な試薬を10倍に減らし、インキュベーション期間を3倍に短縮し、結論までに1〜2週間かかり、ラボのスペースと試薬コストを削減し、多数の M.tbを扱うことに関連する健康と安全のリスクを最小限に抑えます。さらに、結核ワクチンの有効性を評価するために、マイコバクテリアに感染したワクチン接種動物の組織など、さまざまなソースからサンプルを採取することができます。また、感染研究のために単細胞で均一で高品質のマイコバクテリア培養物を製造するための最適化された方法についても説明します。最後に、これらの手法をワクチンの有効性判定の前臨床試験に普遍的に採用し、最終的に結核ワクチン開発の時間を短縮することを提案します。
Introduction
結核(TB)は、単一の感染性病原体である 結核菌 (M.tb)による世界の主要な死因であり、他のどの病原体よりも多くの死者を出しています。2021年、結核は160万人の死亡者を出し、2019年から2021年のパンデミック1ではCOVID-19に抜かれました。さらに、世界保健機関(WHO)の2022年のグローバル結核報告書によると、COVID-19のパンデミックが新規結核患者の増加の原因となっています。また、WHOは、この期間に結核と診断された人の数が大幅に減少したと報告しており、結核の症例数がさらに増加する可能性があります1。
カルメット・ゲラン菌(BCG)は、100年以上前に初めてワクチンとして使用された病原性マイコバクテリウム・ウシの弱毒生株です。これは結核に対する唯一のワクチンであり、現在も使用されている世界最古の認可ワクチンです2,3。現在、臨床試験の異なる段階にある12のワクチン4があり、数十のワクチンが前臨床開発中である5,6。結核ワクチンの前臨床評価には、ゼブラフィッシュ、マウス、モルモット、ウサギ、ウシ、ヒト以外の霊長類などの多様な動物モデルで得られる安全性と免疫原性の評価7が含まれる8,9,10。さらに、M.tb感染および/または伝播に対する防御を誘導するワクチンの能力、すなわちワクチンの有効性を評価するには、in vivoでのM.tbチャレンジが必要です5,11。興味深いことに、BCGワクチン接種は、訓練された免疫のメカニズムを通じて、他の細菌およびウイルス病原体の生存に影響を与える非特異的効果を誘発します12,13。感染した動物の生存可能な細菌負荷を定量化するために選択する方法は、コロニー形成単位(CFU)アッセイ5,15による細菌コロニーの列挙です。CFUは、特定の増殖条件下でコロニーを形成する微生物(細菌または真菌)の数を推定する単位です。CFUは生存可能な複製微生物に由来し、各コロニー内の生きた微生物の絶対数を推定することは困難です。コロニーが1つ以上の微生物に由来するかどうかは不明です。CFU単位はこの不確実性を反映しているため、同じサンプルの繰り返しで大きなばらつきが観察されます。この時間のかかるアッセイは、バイオセーフティレベル3(BSL3)施設、十分な実験室とインキュベータースペースで働くように訓練された専門技術者を必要とし、結論が出るまでに4〜6週間かかり、汚染されやすいです。
この研究では、コロニーの計数に最適化された方法であるマイクロCFU(mCFU)について説明し、結果を分析するためのシンプルで迅速なソリューションを提供します15、16、17、18、19、20。mCFUアッセイは、必要な試薬を10倍に減らし、インキュベーション期間を3倍に短縮し、結論までに1〜2週間かかり、ラボのスペースと試薬コストを削減し、多数のM.tbを扱うことに関連する健康と安全のリスクを最小限に抑えます。私たちは、この方法をワクチンの有効性判定の前臨床試験に広く採用し、最終的に結核ワクチンの開発期間を短縮することを提案します。最後に、この最適化されたCFU計数法は、マイコバクテリアだけでなく、大腸菌やRalstonia solanacearumなどの他の細菌の定量にも使用されています21。
Protocol
Representative Results
Discussion
結核は重要な公衆衛生上の問題であり、特に低・中所得国において重要性が高まっています。新型コロナウイルス感染症(COVID-19)のパンデミック(世界的大流行)において、結核の診断と治療のための医療現場が混乱したことで、新規症例の発生率に悪影響を及ぼしました1。さらに、この流行を制御するために、多剤耐性および広範囲の薬剤耐性M.tb株、およびM.tb?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ポルトガル・カトリカ大学医学部の内部資金と、UIDP/04279/2020、UIDB/04279/2020、およびEXPL/SAU-INF/0742/2021の助成金に基づくFundação para a Ciência e a Tecnologia(FCT)からの外部資金によって支援されました。
Materials
| 96-well plates | VWR | 734-2781 | |
| DSLR 15-55 mm lens | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
| DSLR camera | Nikon | D3400 | |
| DSLR macro lens | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270106 | |
| Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included. | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
| Multichannel pipette (0.5 – 10 µl) | Gilson | FA10013 | |
| Multichannel pipette (20 – 200 µl) | Gilson | FA10011 | |
| Mycobacterium bovis BCG | American Type Culture Collection | ATCC35734 | strain TMC 1011 [BCG Pasteur] |
| OADC enrichment | BD | 211886 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Spectrophotometer UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
| Square Petri dish 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
| Ultrasound bath Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |
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